T-SPOT.TB陽性標本抗原ESAT-6和CFP-10相關(guān)性的探討

周玉利　周青雪

T-SPOT.TB陽性標本抗原ESAT-6和CFP-10相關(guān)性的探討

周玉利周青雪

目的 探討T-spot.TB陽性標本抗原ESAT-6和CFP-10的相關(guān)性。方法 統(tǒng)計2011年1月至2014年7月檢測的T-spot.TB陽性的333例結(jié)果，分析其中抗原ESAT-6與CFP-10的結(jié)果并評價相關(guān)性。結(jié)果 抗原ESAT-6陽性占98.49%，抗原CFP-10陽性占77.48%，抗原ESAT-6陽性且CFP-10陰性占22.52%，抗原ESAT-6陰性且CFP-10陽性占10.51%，抗原ESAT-6陽性合并CFP-10陽性占66.97%。結(jié)論 T-spot陽性標本中，抗原ESAT-6合并CFP-10陽性的比例最高，抗原ESAT-6陽性且CFP-10陰性的比例高于抗原ESAT-6陰性且CFP-10陽性的比例。

結(jié)核桿菌T細胞斑點試驗 抗原靶蛋白6 濾過蛋白10

早期發(fā)現(xiàn)和準確診斷是降低結(jié)核病發(fā)病率、減少傳播機會、控制結(jié)核病疫情的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。但是，傳統(tǒng)的檢測方法存在較多缺陷，不足以滿足臨床需求。結(jié)核桿菌T細胞斑點試驗（T-spot.TB）是一項有效的結(jié)核輔助診斷手段，其敏感性和特異度均＞95%［1］。在歐洲已經(jīng)獲得批準作為結(jié)核感染和結(jié)核潛伏感染篩查的重要檢測手段［2］。其是應用酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)（ELISPOT）檢測機體內(nèi)經(jīng)結(jié)核特異性的RDl區(qū)編碼A抗原早期分泌性抗原靶蛋白6（ESAT-6）和B抗原培養(yǎng)濾過蛋白10（CFP-10）肽段庫刺激后釋放γ干擾素的特異性T細胞數(shù)量。據(jù)此判斷是否有結(jié)核桿菌感染的可能，本資料針對疑似結(jié)核患者T-spot.TB檢測陽性結(jié)果，進行抗原ESAT-6和CFP-10陽性情況的分析，探討其相關(guān)性。

1　臨床資料

1.1一般資料 2011年1月至2014年7月本院333例疑似結(jié)核患者，血清標本檢測T-spot.TB陽性結(jié)果中男179例，女154例；年齡7～76歲，平均年齡（42.6±12.3）歲。

1.2儀器與試劑 Baker生物安全柜，RIVCO C02孵育箱。T-spot.TB試劑盒，淋巴細胞分離液、AIMV、RPMll640、ELISPOT計數(shù)儀由上海長征復星公司提供。

1.3方法 （1）T-spot.TB檢測：按T-spot.TB試劑盒操作規(guī)范進行。采集外周全血，無須空腹，需用肝素/肝素鋰/肝素鈉抗凝，不得使用EDTA抗凝。采血量要求：＜2歲兒童2～3ml，其他患者4～6 ml，免疫力低下/受抑制患者6～8ml；樣本室溫（15～25℃）保存與運輸，不得冷凍/冷藏；樣本采集后4h內(nèi)送到實驗室，8h內(nèi)完成檢測；1周內(nèi)有輸血史或做過PET-CT的患者會影響血液中淋巴細胞的分離，建議2周后再進行檢測；運輸過程中防止顛簸，避免樣本溶血影響結(jié)果。（2）操作過程：外周抗凝全血梯度離心分離外周血單個核細胞（PBMCs），結(jié)核特異性抗原（ESAT-6/CFP-10）刺激結(jié)核特異的效應T淋巴細胞，使其分泌γ-干擾素，效應T淋巴細胞分泌的γ-干擾素與模板預包被的抗γ-干擾素抗體結(jié)合并固定在細胞周圍，傳統(tǒng)的ELISA“雙抗夾心法”使抗原抗體結(jié)合物顯色，形成斑點，根據(jù)斑點數(shù)判斷結(jié)果，抗原ESAT-6檢測孔為測試孔A，抗原CFP-10檢測孔為測試孔B。（3）用ELISPOT計數(shù)儀（AID iSPOT Reader spectrum，ZEISS，德國）進行斑點閱讀與統(tǒng)計：空白對照孔內(nèi)斑點數(shù)＜10且陽性對照孔內(nèi)斑點數(shù)＞20時視為實驗有效。判定標準為當測試孔A或B達到以下標準則判定為陽性結(jié)果：空白對照斑點數(shù)為0～5個時且（抗原A或抗原B孔斑點數(shù)）-（空白對照孔斑點數(shù)）≥6，判斷為陽性（+）；空白對照斑點數(shù)為6～10個時且（抗原A或抗原B孔斑點數(shù)）≥2×（空白對照孔斑點數(shù)），判斷為陽性（+）；若上述標準不符合且陽性質(zhì)控對照孔正常時檢測結(jié)果為陰性（-）。若陰性對照孔斑點數(shù)≥10或陽性對照孔斑點數(shù)＜20時，結(jié)果不能確定。

1.4統(tǒng)計學方法 采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以%表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1333例T-SPOT.TB陽性患者抗原ESAT-6與抗原CFP-10統(tǒng)計結(jié)果 見表1。

表1　333例T-SPOT.TB陽性患者抗原ESAT-6與抗原CFP-10統(tǒng)計結(jié)果［n（%）］

2.2333例T-SPOT.TB陽性患者各科室分布情況 在本院內(nèi)分泌科、感染科、消化科、呼吸科、兒科的T-spot. TB陽性患者中，抗原ESAT-6陽性CFP-10陽性組，抗原ESAT-6陽性且CFP-10陰性組，抗原ESAT-6陰性且CFP-10陽性組，分別所占各科室總數(shù)的比例相近，與全院所占的比例66.97%、22.52%、10.51%相符。

3　討論

T-spot.TB技術(shù)是利用結(jié)核桿菌感染者外周血單個核細胞中存在結(jié)核特異性T細胞，這些淋巴細胞在受到結(jié)核桿菌特異抗原刺激后分泌IFN-γ 而設(shè)計的T細胞免疫斑點試驗。根據(jù)斑點數(shù)可以推測體內(nèi)是否存在對結(jié)核桿菌反應的效應T細胞，從而實現(xiàn)對結(jié)核桿菌感染進行輔助診斷。T-spot.TB檢測采用的MTB特異性抗原為ESAT-6和CFP-10（遺傳基因RD1區(qū)丟失），其蛋白編碼來源于結(jié)核分枝桿菌基因中的一個菌種特異性基因片斷，被稱為RD1，這個基因片段在大部分的分枝桿菌以及所有的環(huán)境分枝桿菌（包括卡介苗）中不存在，因此ESAT-6和CFP-10作為抗原有較高的特異性［3］。但M.kansasii（堪薩斯）、M.szulgai（蘇氏）、M.marinum（海）、M.gordonae（戈登） 四種分枝桿菌亦存在此兩種抗原，T-spot.TB陽性結(jié)果有可能是上述分枝桿菌感染引起的。

ESAT-6和CFP-10蛋白是牛分枝桿菌的免疫優(yōu)勢抗原，可誘導宿主特異性CD4+T細胞、CD8+、CTL增殖及IFN-7大量產(chǎn)生，在保護性細胞免疫反應中發(fā)揮重要作用，且能介導長期持久的免疫記憶。但是現(xiàn)今T-spot.TB技術(shù)處于發(fā)展階段還存在較多不足，該試劑盒在診斷活動性結(jié)核病方面的作用尚待確定，目前只能用于檢測是否有結(jié)核感染，并不能鑒別活動性結(jié)核病和結(jié)核潛伏感染［4，5］。

總之，測孔 A和檢測孔B由于所使用的抗原不同，所引起的細胞免疫反應不完全一致，ESAT-6抗原的靈敏度高于CFP-10抗原。且ESAT-6對潛伏感染檢測較為有效，但單獨使用檢出率較低。兩者具有互補性，兩者聯(lián)合檢測顯著提高檢測的靈敏度。ESAT-6抗原和CFP-10檢測相關(guān)性意義值得更深入研究。

1 Meier T， Eulenbruch HP， Wrighton-Smith P， et al. Sensitivity of a new commercial enzyme-linked immunospot assay （T SPOT-TB） for diagnosis of tuberculosis in clinical.practice. Eur J Clin Microbiol Infect Dis， 2005，24（8）：529～536.

2 Alfred A Lardizabal.Interferon-Gamma release assay for detection of tuberculosis infection.US Respiratory Disease，2006，54（6）： 59～61.

3 Kim SH ，Song KH，Choi SJ，et al.Diagnostic usefulness of a T-cell-based assay for extrapulmonary tuberculosis in immunocompromised patients. Am J Med，2009，122（2）：189.

4 Sztajnbok F R，Boecha N L，Sztajnbek D C，et al.The challenge of pediatric tuberculosis in face of new diagnostic techniques .J Pediatr（Rio J），2009， 85（3）： 189～193.

5 Ariga H，Harada N.Evolution of IGRA researches . Kekkaku，2008，83（9）：641～652.

310006 杭州市第一人民醫(yī)院檢驗科