穿心蓮內(nèi)酯干預(yù)對哮喘大鼠氣道IL-33表達的影響

楊　勇　劉雅娟　程　立★

穿心蓮內(nèi)酯干預(yù)對哮喘大鼠氣道IL-33表達的影響

楊勇劉雅娟程立★

目的 觀察穿心蓮內(nèi)酯干預(yù)對哮喘大鼠氣道IL-33表達的影響，探討其作用機制。方法 SD大鼠36只隨機分成3組：哮喘組、穿心蓮內(nèi)酯干預(yù)組和對照組，每組各12只。通過100mg卵清蛋白（OVA）腹腔注射致敏，并且OVA霧化吸入連續(xù)激發(fā)28d，末次激發(fā)24h后處死大鼠。行支氣管灌洗液（BALF）細胞總數(shù)、嗜酸性粒細胞計數(shù)，AB-PAS染色觀察氣道組織杯狀細胞、黏液分泌情況，Real-time PCR檢測IL-33 mRNA在肺組織內(nèi)的表達。結(jié)果 穿心蓮內(nèi)酯干預(yù)組BALF細胞總數(shù)、嗜酸性粒細胞數(shù)、AB-PAS陽性染色面積、IL-33 mRNA表達均較哮喘組減低（P＜0.05）。結(jié)論 穿心蓮內(nèi)酯可抑制哮喘大鼠氣道炎癥，并且降低氣道IL-33的表達。

哮喘 大鼠 穿心蓮內(nèi)酯

支氣管哮喘（簡稱哮喘），是一種嚴重危害人類健康的氣道慢性炎癥性疾?。?］。有研究表明，肺組織中IL-33的表達與哮喘的嚴重程度呈正相關(guān)［2］。本資料自2014年3月至8月觀察穿心蓮內(nèi)酯對哮喘大鼠氣道炎癥及IL-33表達的影響，從而為哮喘的藥物治療提供新的依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗動物 SD大鼠（雌性）共36只，體重（200±20）g，周齡6～7周，武漢同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。

1.2藥品及實驗試劑 穿心蓮內(nèi)酯注射液（江西青峰藥業(yè)有限公司）；卵蛋白（Ⅴ級）（美國Sigma公司）；氫氧化鋁凝膠（Invivogen公司）；RNAiso Reagent試劑（大連TaKaRa公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連TaKaRa公司）；熒光試劑SYBR?Premix Ex Taq?Ⅱ（大連TaKaRa公司）；AB-PAS染色試劑盒（上海源葉生物科技有限公司）。

1.3動物分組及模型建立 36只SD大鼠（按隨機數(shù)字法）分為3組，每組12只，分別是哮喘組、穿心蓮內(nèi)酯干預(yù)組（干預(yù)組）和對照組。依據(jù)既往文獻建立大鼠哮喘模型［3］：哮喘組和干預(yù)組在第1、8天通過腹腔注射致敏液1次（2ml生理鹽水加入OVA 100mg和氫氧化鋁200mg制成混合液），在第1次致敏后2周起用1%卵清蛋白（OVA）霧化激發(fā)，霧化1次/d，30min/次，連續(xù)激發(fā)28d。對照組用等量生理鹽水溶液代替OVA處理。干預(yù)組在接受OVA霧化激發(fā)的同時，予以穿心蓮內(nèi)酯0.06mg/（g·d），腹腔注射給藥28d。

1.4采集肺組織標本 末次激發(fā)24h后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉（0.05ml/10g）、固定并暴露腹腔，腹主動脈放血處死大鼠，打開胸腔，結(jié)扎右肺門的根部，取肺的右上葉和中葉放入凍存管中，立即液氮速凍，保存于-80 ℃的冰箱以備提取RNA，取右下葉肺組織放入4%的多聚甲醛中固定24h，制備成石蠟標本和石蠟切片，進行肺組織阿辛藍-過碘酸雪夫（AB-PAS）染色。

1.5支氣管灌洗液（BALF）細胞計數(shù) 取左肺，向肺內(nèi)緩慢注入2ml生理鹽水，保持30s后緩慢回抽灌洗液，共灌洗3次。取2mlBALF1500r/min離心10min，回收混懸液，用于細胞總數(shù)、嗜酸性粒細胞計數(shù)。

1.6實時熒光定量PCR （1）總RNA提?。翰捎肦NAiso Plus試劑提取血清中的總RNA，用核酸蛋白測量儀測定RNA的純度和濃度。（2）反轉(zhuǎn)錄：以RNA為模版，按PrimeScript RT reagent Kit操作說明進行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系20μl。（3）熒光定量PCR：根據(jù)Genbank中大鼠IL33、β-actin全基因序列，由TaKaRa公司設(shè)計和合成引物。IL-33上游5'-GAGACTCCGTTCTGGCCTCA-3'，下游5'-AATGTGTCAACAGACGCAGCAA-3'，擴增產(chǎn)物長度183bp；β-actin 內(nèi)參引物擴增產(chǎn)物長度150bp。擴增條件為95℃ 30s 1個循環(huán)，95℃ 10s、61℃ 30s 40個循環(huán)，后接溶解曲線。（4）基因相對定量=2-△△CT，得各樣本IL-33 mRNA的表達量。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（x±s）表示，進行單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1動物行為學(xué)觀察 對照組大鼠呼吸節(jié)律正常，毛色較亮，體重正常增長，反應(yīng)靈敏；哮喘組大鼠呼吸急促，腹肌抽搐，毛色失去光澤，四肢無力，反應(yīng)遲鈍、煩躁不安等反應(yīng)。穿心蓮內(nèi)酯干預(yù)組：哮喘發(fā)作的程度明顯緩解。

2.2氣道上皮杯狀細胞和黏液物質(zhì)AB-PAS染色觀察 對照組大鼠的氣道上皮幾乎未見杯狀細胞，管腔內(nèi)未見黏液分泌；哮喘組大鼠氣道上皮可見大量紫紅色杯狀細胞，管腔內(nèi)有大量藍色或紫藍色黏液分泌物，可見黏液栓形成，與對照組相比哮喘組氣道上皮杯狀細胞及黏液物質(zhì)陽性相對著色面積明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。穿心蓮內(nèi)酯干預(yù)組陽性相對著色面積低于哮喘組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1、圖1～3。

圖1　對照組氣道組織AB-PAS×200

圖2　哮喘組氣道組織AB-PAS×200

圖3　干預(yù)組氣道組織AB-PAS×200

表1　各組大鼠氣道上皮杯狀細胞和黏液物質(zhì)陽性相對著色面積的變化（x±s）

2.3BALF細胞總數(shù)和嗜酸性粒細胞分類計數(shù) 哮喘組中細胞總數(shù)及嗜酸性粒細胞絕對值、百分比均較對照組升高，穿心蓮內(nèi)酯干預(yù)后，可見明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2　各組大鼠BALF中細胞總數(shù)和嗜酸性粒細胞分類計數(shù)的變化（x±s）

2.4肺組織IL-33 mRNA的相對表達量 哮喘組、干預(yù)組大鼠IL-33 mRNA的相對表達量較對照組增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；干預(yù)組大鼠IL-33 mRNA的相對表達量較哮喘降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3　各組大鼠肺組織IL-33 mRNA表達的變化（x±s）

3　討論

穿心蓮內(nèi)酯是中藥穿心蓮的活性成分，可通過調(diào)節(jié)巨噬細胞表型分化及特異性抗原生成而有效調(diào)節(jié)固有免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，在體內(nèi)外均具有較強的抗炎作用，可抑制TNF-α、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）的合成［4］。體外實驗中，有效地抑制炎癥細胞對 LTB4、PGE2及TXB2 的合成［5］。此外，穿心蓮可抑制哮喘大鼠炎性細胞浸潤，糾正失調(diào)的Th1/Th2平衡，達到抗炎癥的作用［6］。

哮喘是由多種細胞包括氣道的炎性細胞和結(jié)構(gòu)細胞（如嗜酸粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞、平滑肌細胞、氣道上皮細胞等）和細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾?。?］。本實驗通過OVA誘發(fā)制備哮喘大鼠模型，采用穿心蓮內(nèi)酯干預(yù)。結(jié)果顯示，大鼠細胞總數(shù)、嗜酸性粒細胞百分數(shù)、嗜酸性粒細胞絕對值數(shù)較哮喘組降低（P＜0.05），與既往研究基本一致［8］；大鼠肺組織AB-PAS染色表明干預(yù)組上皮杯狀細胞增生及黏液分泌較哮喘組降低（P＜0.05）。結(jié)果表明，穿心蓮內(nèi)酯可以有效抑制大鼠氣道炎癥、氣道黏液高分泌，從而預(yù)防和緩解哮喘的癥狀。

IL-33是Th2型細胞因子，在哮喘患者和哮喘模型中表達增高，其不僅影響Th2細胞的分化，也直接作用于肥大細胞、DC細胞、嗜酸性粒細胞等誘導(dǎo)變態(tài)反應(yīng)性炎癥，因此，IL-33在哮喘的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用［9］。麻曉燕等［10］通過觀察哮喘患者血漿及痰液中IL-33的含量，發(fā)現(xiàn)支氣管哮喘患者外周血中IL-33含量高于正常組，而且重度哮喘組高于輕、中度哮喘組，此外，痰液中嗜酸性粒細胞計數(shù)與痰中IL-33含量呈明顯的正相關(guān)。本資料結(jié)果顯示，哮喘組、干預(yù)組大鼠IL-33 mRNA的相對表達量較對照組增高（P＜0.05）；干預(yù)組大鼠IL-33 mRNA的表達量較哮喘降低（P＜0.05）。結(jié)果表明，IL-33在哮喘大鼠的肺組織中高表達，穿心蓮內(nèi)酯可以明顯抑制哮喘組肺組織IL-33的表達及其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，IL-33作為炎癥因子參與哮喘的發(fā)生和發(fā)展，穿心蓮內(nèi)酯可以抑制大鼠氣道炎癥、氣道黏液高分泌，同時降低肺組織中IL-33的表達，從而使哮喘得到控制。

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Object To evaluate the effect of andrographolide on expression of IL-33 in a rat model of asthma. Methods SD rats（n=36）were randomly divided into three groups：the normal group（n=12），the asthmatic group（n=12），the andrographolide intervention group（n=12）. The rats were sensitized by 100mg ovalbumin（OVA），then they were challenged with ovalbumin，24 hours after the fi nal inhalation and challenging，all the rats were sacrifi ced. The amount of total cells and the concentration of eosinophils in the bronchoalveolar lavage fl uid（BALF）of each group were determined，the metaplasia of goblet cells in airway wall along with the degree of mucus hypersecretion were observed by alcian blue/periodic acid schiff（AB-PAS）staining. The pulmonary expression of IL-33 mRNA were measured by real-time PCR. Results The amount of total cells，eosinophils in BALF，the airway infl ammatory pathological score，the goblet cells in the airway wall，the degree of mucus secretion，the level of IL-33 mRNA in andrographolide group were all signifi cantly lower than those in asthmatic group（P＜0.05）. Conclusion The andrographolide can suppress the airway infl ammation and decrease the expressions of IL-33.

Asthma Rat Andrographolide

442008 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院綜合醫(yī)療科