大環(huán)抗生素手性固定相拆分克倫普羅對(duì)映體及分離機(jī)制研究

張丹丹， 張曉琳

(青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東青島 266042)

圖1 克倫普羅的結(jié)構(gòu)式

鹽酸克倫普羅它是一種β2腎上腺受體激動(dòng)劑，主要用于防治人、畜支氣管哮喘和痙攣[1]，結(jié)構(gòu)式見圖1，其分子中含有一個(gè)手性中心，具有一對(duì)呈鏡像對(duì)映關(guān)系的異構(gòu)體，但目前應(yīng)用的鹽酸克倫普羅均為外消旋體。而手性化合物的對(duì)映體常具有不同的藥理、毒理作用及藥物動(dòng)力學(xué)特征[2 - 5]。因此，對(duì)鹽酸克倫普羅對(duì)映體進(jìn)行拆分研究，建立簡(jiǎn)單、快速、分離性能好、靈敏的測(cè)定方法是一個(gè)具有理論及實(shí)際意義的課題。目前，對(duì)鹽酸克倫特羅對(duì)映體拆分的報(bào)道較多[6 - 8]，但是對(duì)鹽酸克倫普羅對(duì)映體的分離罕見報(bào)道，僅見楊晶等[9]采用柱前衍生化反相高效液相色譜法對(duì)其進(jìn)行了分離，但需要進(jìn)行衍生化反應(yīng)，方法繁瑣耗時(shí)，不好控制。

本研究采用三種大環(huán)抗生素類手性固定相Chirobiotic V、Chirobiotic T 和Chirobiotic R(結(jié)構(gòu)式見圖2)對(duì)鹽酸克倫普羅對(duì)映體直接進(jìn)行分離，考察分離模式、流動(dòng)相組成及柱溫的影響，研究對(duì)映體的熱力學(xué)行為，探討手性分離的機(jī)制。

圖2 三種大環(huán)抗生素類手性固定相的結(jié)構(gòu)式

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Jasco色譜儀(日本,分光公司),附Jasco UV-980高壓輸液泵，Jasco UV-975檢測(cè)器，IC 2001 plus 型柱溫箱，Anastar 色譜工作站;DT-100A型分析天平;pHS-25型pH計(jì);DL-180型超聲波清洗機(jī)。

鹽酸克倫普羅標(biāo)準(zhǔn)品由青島雙鯨藥業(yè)提供，用甲醇溶解，配制成濃度為1.0 mg/mL的貯備液，使用時(shí)稀釋至所需濃度。甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、四氫呋喃為色譜純(天津市康科德科技有限公司)；冰乙酸、三乙胺、硝酸銨為優(yōu)級(jí)純(天津市博迪化工有限公司)。

1.2 色譜條件

色譜柱:Chirobiotic V柱(250×4.6 mm i.d.,5 μm),Chirobiotic T柱(150×4.6 mm i.d.,5 μm) 和 Chirobiotic R柱(250×4.6 mm i.d.,5 μm)(Advanced Separation Technologies Inc.，美國(guó))。流動(dòng)相：甲醇-乙酸-三乙胺(100∶0.01∶0.01,V/V/V)。流速:1.0 mL/min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm；進(jìn)樣量:20 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 新極性有機(jī)相模式下鹽酸克倫普羅對(duì)映體的分離

新極性有機(jī)相模式是指流動(dòng)相只使用極性有機(jī)溶劑，添加適量的有機(jī)酸和堿來(lái)改善其對(duì)映體選擇性。這個(gè)模式結(jié)合了反相液相色譜的優(yōu)點(diǎn)，如增加了樣品的溶解性，溶劑更容易蒸發(fā)等，但是流動(dòng)相中不含水相。當(dāng)被分析物的分子結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)以上可以與手性固定相的手性位點(diǎn)發(fā)生相互作用的官能團(tuán)時(shí)，新極性有機(jī)相模式就可以被使用。鹽酸克倫普羅的結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)可以與手性位點(diǎn)發(fā)生相互作用的官能團(tuán)，如羥基，氨基和苯基等，因此，新極性有機(jī)相模式被確定為首選的分離模式。

2.1.1緩沖溶液類型對(duì)分離的影響本文考察了0.1%乙酸銨、0.1%硝酸銨和0.1%乙酸三乙胺三種緩沖體系對(duì)分離的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鹽酸克倫普羅在0.1%乙酸銨和硝酸銨緩沖體系中不能實(shí)現(xiàn)分離，且色譜峰拖尾，對(duì)稱性較差。而在0.1%乙酸-三乙胺緩沖體系中可以得到一定的手性分離，因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，選用0.1%乙酸-三乙胺做為流動(dòng)相的緩沖系統(tǒng)。

2.1.2緩沖溶液濃度對(duì)分離的影響以甲醇-乙酸-三乙胺體系作為流動(dòng)相，考察了乙酸和三乙胺的濃度和比例對(duì)分離的影響。在Chirobiotic R手性固定相上，無(wú)論如何優(yōu)化條件，鹽酸克倫普羅對(duì)映體均不能實(shí)現(xiàn)分離。在Chirobiotic V和Chirobiotic T手性固定相上，當(dāng)流動(dòng)相中只含有乙酸而不含有三乙胺時(shí)，不能實(shí)現(xiàn)手性分離；在含有三乙胺的流動(dòng)相中，鹽酸克倫普羅可實(shí)現(xiàn)一定的分離，乙酸的加入對(duì)化合物的手性識(shí)別不起主要作用，但可以改善色譜峰的峰形和對(duì)稱性。本文采用甲醇-乙酸-三乙胺(100∶0.1∶0.1,V/V/V)為起始流動(dòng)相，考察了緩沖液成分(乙酸-三乙胺)的濃度對(duì)鹽酸克倫普羅保留行為和對(duì)映體選擇性的影響。隨著乙酸-三乙胺的濃度從0.1%降低至0.02%或0.01%，鹽酸克倫普羅保留時(shí)間明顯延長(zhǎng)，分離效果顯著提高；但當(dāng)乙酸-三乙胺的濃度繼續(xù)降低至0.005%時(shí)，保留時(shí)間過長(zhǎng)，色譜峰展寬，分離效果下降。具體數(shù)據(jù)見表1。實(shí)驗(yàn)確定甲醇-乙酸-三乙胺(100∶0.01∶0.01,V/V/V)為最佳流動(dòng)相，在此條件下，鹽酸克倫普羅在Chirobiotic V和Chirobiotic T手性固定相上，均可實(shí)現(xiàn)基線分離，分離色譜圖見圖3，其對(duì)映體洗脫順序由Jasco OR-990手性檢測(cè)器測(cè)得，均為(-)-對(duì)映體先被洗脫。

2.1.3柱溫對(duì)分離的影響及熱力學(xué)性質(zhì)研究本文以甲醇-乙酸-三乙胺(100∶0.01∶0.01,V/V/V)為流動(dòng)相，考察了鹽酸克倫普羅在10、20、30和40 ℃下的分離情況。隨著溫度的降低，鹽酸克倫普羅的保留時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)映體選擇性有所提高。具體數(shù)據(jù)見表2。權(quán)衡分離度，保留時(shí)間及實(shí)際操作性，選取最佳分離溫度為20 ℃。根據(jù)Van’t Hoff 等式，色譜參數(shù)、柱溫和熱力學(xué)參數(shù)的關(guān)系為：lnα=-△H/RT+△S/R，式中R為氣體常數(shù)，T為絕對(duì)溫度，△H和△S分別代表對(duì)映體與手性固定相相互作用的焓變差和熵變。在表2考察的溫度范圍內(nèi)，得到鹽酸克倫普羅在Chirobiotic V手性固定相上的△H和△S分別為-114.23 kJ/mol和-0.22 J/(mol·K)，在Chirobiotic T手性固定相上的△H和△S分別為-167.97 kJ/mol和-0.29 J/(mol·K)，數(shù)值均為負(fù)值，表明其手性識(shí)別過程均為焓控過程。

表1 流動(dòng)相組成對(duì)鹽酸克倫普羅對(duì)映體保留行為和分離的影響

圖3 鹽酸克倫普羅對(duì)映體在Chirobiotic V(a)和Chirobiotic T(b)手性固定相上分離的色譜圖

表2 溫度對(duì)克倫普羅在替考拉寧手性固定相上分離效果的影響

2.2 反相模式下鹽酸克倫普羅對(duì)映體的分離

本文采用20%甲醇0.1%TEA為起始流動(dòng)相，考察了硝酸銨和乙酸三乙胺兩種緩沖鹽系統(tǒng)，并在該固定相所適應(yīng)的pH值范圍內(nèi)(4.0～7.0)考察了緩沖鹽pH值變化及有機(jī)改性劑種類(甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、四氫呋喃等)對(duì)鹽酸克倫普羅對(duì)映體保留行為和分離影響，該模式下鹽酸克倫普羅對(duì)映體在三種大環(huán)抗生素手性固定相上均不能實(shí)現(xiàn)分離。

2.3 正相模式下克倫普羅對(duì)映體的手性分離

本文考察了兩種流動(dòng)相系統(tǒng):正己烷-乙醇和正己烷-異丙醇，并通過改變流動(dòng)相組成以求實(shí)現(xiàn)手性分離，但結(jié)果表明，鹽酸克倫普羅對(duì)映體在三種大環(huán)抗生素手性固定相上均不能實(shí)現(xiàn)分離。

2.4 分離機(jī)制的探討

Chirobiotic V、Chirobiotic T和Chirobiotic R手性固定相，可與對(duì)映體發(fā)生π-π相互作用，氫鍵作用，包合作用，偶極作用，立體化學(xué)作用和離子相互作用。本研究中，在Chirobiotic V和T手性固定相上，只有在新極性有機(jī)相模式下，流動(dòng)相中同時(shí)含有三乙胺和乙酸時(shí)，鹽酸克倫普羅對(duì)映體才能實(shí)現(xiàn)較好的分離，這說(shuō)明離子作用是對(duì)映體分離的最主要作用機(jī)制，而其手性分離是上述提到的各種相互作用的共同結(jié)果。在正相模式下，鹽酸克倫普羅對(duì)映體不能得到分離，這進(jìn)一步證明了離子相互作用在鹽酸克倫普羅對(duì)映體分離時(shí)的必要性，因?yàn)殡x子相互作用在正相模式下是很難，甚至不可能發(fā)生的。鹽酸克倫普羅對(duì)映體在Chirobiotic R固定相上沒能實(shí)現(xiàn)手性分離，這主要是由于Chirobiotic R的結(jié)構(gòu)中缺少羧基，而羧基是與克倫普羅發(fā)生離子相互作用的重要手性位點(diǎn)之一，進(jìn)一步證明了離子相互作用是實(shí)現(xiàn)對(duì)映體分離的最必要作用。

3 結(jié)論

本文采用三種大環(huán)抗生素類手性固定相Chirobiotic V、Chirobiotic T和Chirobiotic R對(duì)鹽酸克倫普羅進(jìn)行了拆分研究，在Chirobiotic V、Chirobiotic T手性固定相上成功實(shí)現(xiàn)了其對(duì)映體的基線分離，分離度RS可分別達(dá)2.00和2.13。本文建立的鹽酸克倫普羅拆分方法簡(jiǎn)單,操作方便,可以用于其對(duì)映體的質(zhì)量控制及立體選擇性藥代動(dòng)力學(xué)的研究。