白術(shù)多糖對(duì)樹突狀細(xì)胞表型及功能成熟的影響

汲廣全，陳仁瓊，鄭建仙，*

（1.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州 510641；2.中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院皮膚科，廣東 廣州 510120）

白術(shù)多糖對(duì)樹突狀細(xì)胞表型及功能成熟的影響

汲廣全1，陳仁瓊2，鄭建仙1，*

（1.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州 510641；2.中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院皮膚科，廣東 廣州 510120）

目的：研究白術(shù)多糖對(duì)人外周血來(lái)源的樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC）表型和功能的影響。方法：應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC表面標(biāo)志分子HLA-DR、CD86、CD83和CD80的表達(dá)及吞噬FITC-dextran的情況，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DC分泌白細(xì)胞介素-12（interleukin-12，IL-12）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）情況，Western blotting檢測(cè)DC表面Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）。結(jié)果：白術(shù)多糖能夠促進(jìn)TLR4的表達(dá)，促進(jìn)DC表面分子HLA-DR、CD86、CD83和CD80的表達(dá)，并且呈劑量依賴性，同時(shí)還使DC吞噬能力下降；白術(shù)多糖能夠促進(jìn)DC分泌IL-12和TNF-α。此外，TLR4抗體可以減少IL-12和TNF-α的產(chǎn)生。結(jié)論：白術(shù)多糖可以促進(jìn)人外周血來(lái)源的DC表型及功能的成熟。

白術(shù)；樹突狀細(xì)胞；Toll樣受體4

樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC）是專職的抗原提呈細(xì)胞，在固有免疫和獲得性免疫過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用［1-2］。它包括兩個(gè)階段：未成熟DC階段和成熟DC階段［3］。未成熟的DC攝取抗原能力很強(qiáng)，但低表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體-Ⅱ（major histocompatibility complex-Ⅱ，MHC-Ⅱ）；微生物或其他刺激可以活化DC，使未成熟的DC變?yōu)槌墒斓腄C［4-5］。成熟的DC攝取抗原能力下降，但卻高表達(dá)MHC-Ⅱ、CD86、CD80和CD83［6-8］，向T細(xì)胞呈遞抗原肽［9］，并且分泌白細(xì)胞介素-12（interleukin-12，IL-12）。此外，Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）對(duì)各種來(lái)源的多糖具有較廣譜的親和力［10］。目前有研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸多糖可以促使TLR4的表達(dá)［11-12］。

白術(shù)是一種傳統(tǒng)的中藥，具有抗腫瘤、抗炎和抗氧化等活性［13-14］，為藥食同源之品。研究發(fā)現(xiàn)白術(shù)多糖（polysaccharides from Atractylodes macrocephala Koidz，AMP）能夠調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)，增強(qiáng)手足口病小鼠的免疫功能［15］。但是，目前還沒有關(guān)于白術(shù)多糖影響DC成熟的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)考察白術(shù)多糖對(duì)人外周血來(lái)源的DC表型及功能成熟的調(diào)節(jié)作用，并初步探討白術(shù)多糖的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

白術(shù)多糖（純度95%） 陜西慈緣生物技術(shù)有限公司。

重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（recombinant human granulocyte macrophage colony stimulating factor，rhGM-CSF）和重組人白細(xì)胞介素4（recombinant human interleukin-4，rhIL-4） 美國(guó)Peprotech公司；淋巴細(xì)胞分離液、FITC-dextran 美國(guó)Sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)基 美國(guó)Gibco公司；胎牛血清 美國(guó)HyClone公司；熒光標(biāo)記鼠抗人單克隆抗體CD80、CD83、CD86、HLA-DR 美國(guó)BD公司；TLR4抗體 美國(guó)eBioscience公司；酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 美國(guó)R&D公司。

1.2儀器與設(shè)備

流式細(xì)胞儀 美國(guó)BD公司；凝膠處理系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；酶標(biāo)儀 日本Shimadzu公司。

1.3方法

1.3.1人外周血單核細(xì)胞來(lái)源的DC的體外誘導(dǎo)和培養(yǎng)

新鮮正常人抗凝外周血，用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）以1：1（V/V）進(jìn)行稀釋，緩慢加至淋巴細(xì)胞分離液上，2 000 r/min離心20 min，吸取單個(gè)核細(xì)胞層，RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌2 次，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/mL，加入6 孔板，每孔2 mL，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，吸去未貼壁的細(xì)胞。用RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌2 次，每孔加入2 mL含10%（體積分?jǐn)?shù)）胎牛血清、GM-CSF 1 000 U/mL和IL-4 800 U/mL的RPMI-1640培養(yǎng)基，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第3天50%換液，補(bǔ)充細(xì)胞因子GM-CSF和IL-4，第5天所收集的細(xì)胞為后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用。

1.3.2白術(shù)多糖對(duì)DC表型的影響

DC經(jīng)不同質(zhì)量濃度白術(shù)多糖（0、25、50、100、200 μg/mL）作用24 h后，分別收集空白對(duì)照組（未加白術(shù)多糖組）和多糖組DC，在流式管中分別加入20 μL的PE-CD83、PE-HLA-DR、FITC-CD86或FITC-CD80，每管加入100 μL細(xì)胞懸液（5×105），充分混勻后，室溫避光反應(yīng)30 min，PBS洗滌2 次，乙醇固定，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

1.3.3白術(shù)多糖對(duì)DC吞噬功能的影響

DC經(jīng)不同質(zhì)量濃度的白術(shù)多糖（0、25、50、100、200 μg/mL）作用24 h后，加入1 mg/mL FITC-dextran于 37 ℃條件下溫育1 h，然后用PBS洗滌2 次，于流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

1.3.4Western blotting檢測(cè)TLR4蛋白的表達(dá)

取各組細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液提取總蛋白。將蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE），濃縮膠80 V電泳30 min，分離膠120 V電泳1 h，用聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）轉(zhuǎn)膜，恒流250 mA轉(zhuǎn)膜1 h，脫脂奶粉封閉，加一抗TLR4，4 ℃孵育過(guò)夜，加二抗于室溫孵育2 h，化學(xué)發(fā)光顯影并用凝膠處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶和內(nèi)參條帶的灰度值及其比值。

1.3.5白術(shù)多糖對(duì)DC分泌細(xì)胞因子的影響

DC經(jīng)不同質(zhì)量濃度的白術(shù)多糖（0、25、50、100、200 μg/mL）作用24 h后收集細(xì)胞，或DC經(jīng)TLR4抗體預(yù)處理1 h，后用白術(shù)多糖刺激DC，24 h后收集細(xì)胞。應(yīng)用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清液中IL-12和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的含量，按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。反應(yīng)終止后用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定所測(cè)細(xì)胞因子的含量。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果與分析

2.1白術(shù)多糖對(duì)DC表面分子表達(dá)的影響

圖1　白術(shù)多糖對(duì)DC表型的影響Fig.1 Dose-dependent effect of AMP on phenotypic maturation of DCs

于DC培養(yǎng)第5天加入白術(shù)多糖繼續(xù)培養(yǎng)24 h，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC表面CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表達(dá)，結(jié)果如圖1所示，白術(shù)多糖能夠上調(diào)CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表達(dá)，即白術(shù)多糖可以促進(jìn)DC的表型成熟。不同質(zhì)量濃度（25、50、100、200 μg/mL）的白術(shù)多糖作用于DC，能夠上調(diào)CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表達(dá)，呈一定的劑量依賴性。其中白術(shù)多糖100 μg/mL為最適宜劑量，而隨后劑量增加并不能大幅增加這些分子的表達(dá)。

2.2白術(shù)多糖對(duì)DC吞噬功能的影響

圖2　白術(shù)多糖對(duì)DC吞噬功能的影響Fig.2 Dose-dependent effect of AMP on phagocytosis of DC

未成熟DC吞噬能力強(qiáng)，而成熟DC吞噬能力弱。為檢測(cè)白術(shù)多糖是否影響DC的吞噬功能，于培養(yǎng)第5天加入不同質(zhì)量濃度的白術(shù)多糖作用于DC，24 h后，加入FITC-dextran孵育1 h，收集細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC吞噬功能，如圖2所示，經(jīng)白術(shù)多糖處理的DC與空白對(duì)照組相比，其吞噬FITC-dextran的能力下降，并呈劑量依賴性。

2.3白術(shù)多糖對(duì)DC表面受體TLR4表達(dá)的影響

TLR4參與了多糖處理的免疫細(xì)胞活化，用不同質(zhì)量濃度的白術(shù)多糖作用于DC，結(jié)果如圖3所示，經(jīng)白術(shù)多糖處理的DC與空白對(duì)照組相比，TLR4蛋白的表達(dá)增加，在25～100 μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴性。當(dāng)白術(shù)多糖質(zhì)量濃度為100 μg/mL時(shí)，TLR4表達(dá)最強(qiáng)。

圖3　白術(shù)多糖對(duì)DC表達(dá)TLR4的影響Fig.3 Dose-dependent stimulation of APM on TLR4 expression in DCs

2.4白術(shù)多糖對(duì)DC分泌IL-12和TNF-α的影響

為檢測(cè)白術(shù)多糖能否刺激DC產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-12和TNF-α，將不同質(zhì)量濃度的白術(shù)多糖作用于DC 24 h后，收集細(xì)胞上清液，ELISA檢測(cè)IL-12和TNF-α。如圖4a、4b所示，白術(shù)多糖能夠使DC IL-12和TNF-α分泌量增加，呈劑量依賴性。

圖4　白術(shù)多糖對(duì)DC分泌IL-12和TNNFF--α的影響Fig.4 Induction of IL-12 and TNF-α production in DCs by AMP

2.3節(jié)結(jié)果已證實(shí)白術(shù)多糖可以刺激DC TLR4表達(dá)增加，為進(jìn)一步探索TLR4是否參與了白術(shù)多糖刺激DC分泌IL-12和TNF-α，用TLR4抗體預(yù)處理DC 1 h，隨后加入100 μg/mL白術(shù)多糖刺激DC 24 h，收集細(xì)胞上清液。以未加TLR4抗體為對(duì)照組。結(jié)果顯示，經(jīng)TLR4抗體預(yù)處理后，DC減少了其IL-12和TNF-α的分泌量（圖4c、4d）。

3　討 論

白術(shù)作為我國(guó)的一種傳統(tǒng)中藥，具有健脾益氣、燥濕利水等功效，它含有多糖、揮發(fā)油等多種生物活性物質(zhì)，其中多糖的免疫調(diào)節(jié)作用尤為突出，能夠調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能。近年來(lái)，關(guān)于多糖如靈芝多糖、枸杞多糖、黃芪多糖和Antrodia camphorata多糖［16-19］等的研究有了一些進(jìn)展，它們通過(guò)促進(jìn)DC的成熟調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。但是，目前關(guān)于白術(shù)多糖對(duì)DC表型和功能的影響尚未見報(bào)道。

DC是目前機(jī)體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，根據(jù)DC功能以及表面分子表達(dá)的不同，分為未成熟DC和成熟DC兩個(gè)階段。正常情況下，體內(nèi)絕大多數(shù)DC處于未成熟階段，低表達(dá)輔助刺激分子，如HLA-DR、CD86、CD80、CD83，但有很強(qiáng)的抗原攝取能力，與DC抗原提呈作用有關(guān)，同時(shí)也與DC對(duì)T細(xì)胞的激活相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)車前子多糖［20］及車前子提取物［21］增加了DC成熟標(biāo)志物的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DC經(jīng)白術(shù)多糖刺激作用后，HLA-DR、CD86、CD80、CD83的表達(dá)升高，吞噬FITC-dextran的能力降低，提示白術(shù)多糖誘導(dǎo)DC的成熟。此外，成熟的DC可以使IL-12和TNF-α的分泌量增加，IL-12和TNF-α可以誘導(dǎo)Th0細(xì)胞分化為Th1細(xì)胞，參與Th1反應(yīng)。以往研究發(fā)現(xiàn)IL-12的產(chǎn)生促進(jìn)了細(xì)胞免疫［22］。本研究發(fā)現(xiàn)白術(shù)多糖能促進(jìn)DC分泌IL-12和TNF-α，說(shuō)明白術(shù)多糖能夠促進(jìn)DC的成熟。

TLRs表達(dá)于免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞中。TLR4作為TLRs家族的一個(gè)成員，是重要的模式識(shí)別受體。有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌多糖具有免疫刺激活性，并且與TLR4的表達(dá)有關(guān)，提示一些多糖的非特異性免疫反應(yīng)很可能由TLR4介導(dǎo)［23-25］。本研究發(fā)現(xiàn)白術(shù)多糖增加了TLR4的表達(dá)，而進(jìn)一步用TLR4抗體進(jìn)行預(yù)處理可以減少白術(shù)多糖所引起的IL-12和TNF-α的產(chǎn)生，表明TLR4參與了IL-12 和TNF-α的分泌。

本實(shí)驗(yàn)從DC表面受體、表型、攝取抗原能力以及細(xì)胞因子的產(chǎn)生四個(gè)方面來(lái)證實(shí)白術(shù)多糖誘導(dǎo)人外周血來(lái)源的DC成熟與功能的改變，提示白術(shù)多糖的調(diào)節(jié)免疫功能與其誘導(dǎo)DC功能成熟相關(guān)。白術(shù)多糖刺激的DC細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

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Effect of Polysaccharides from Atractylodes macrocephala Koidz on Phenotypic and Functional Maturation of Dendritic Cells

JI Guangquan1， CHEN Renqiong2， ZHENG Jianxian1，*
（1. School of Light Industry and Food Science， South China University of Technology， Guangzhou 510641， China；2. Department of Dermatology， Sun Yat-Sen Memorial Hospital， Sun Yat-Sen University， Guangzhou 510120， China）

Purpose: To study the effect of polysaccharides from Atractylodes macrocephala Koidz （AMP） on phenotypic and functional maturation of dendritic cells （DCs）. Methods: The expression of toll-like receptor 4 （TLR4） was detected by Western blotting and the phagocytosis and phenotypic maturation of DCs was determined by flow cytometry. Furthermore，the production levels of IL-12 and tumor necrosis factor-α （TNF-α） were measured by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA） in DCs stimulated by different concentrations of AMP （25， 50， 100， and 200 μg/mL）. Moreover， the role of TLR4 in regulating IL-12 and TNF-α production was examined. Results: The expression levels of the markers of maturation such as HLA-DR， CD86， CD83 and CD80 were increased by AMP in a concentrate-dependent manner. Furthermore， AMP increased the production of IL-12 and TNF-α， promoted the expression of TLR4， and reduced the phagocytosis of DCs. Using TLR4 antibody， the presence of anti-TLR4 antibody markedly decreased IL-12 and TNF-α release. Conclusion: These data suggest that TLR4 is involved in the maturation of DCs induced by AMP.

Atractylodes macrocephala Koidz； dendritic cells； Toll-like receptor 4 （TLR4）

R965

A

1002-6630（2015）03-0207-05

10.7506/spkx1002-6630-201503040

2014-06-24

汲廣全（1982—），男，博士研究生，研究方向?yàn)榭辔兑种频臋C(jī)理和免疫藥理學(xué)。E-mail：jiwenqiang1213@163.com

鄭建仙（1966—），男，教授，博士，研究方向?yàn)榭辔兑种茩C(jī)理和免疫藥理學(xué)。E-mail：fejxzhen@163.com