超臨界二氧化碳萃取齒瓣石斛

包曉青， 梁明在， 吳志剛， 陶正明*， 林智雄

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)，浙江　溫州　325035；2.浙江省亞熱帶作物研究所，浙江　溫州　325005；3.臺(tái)灣義守大學(xué)化學(xué)工程系，臺(tái)灣　高雄　84001）

超臨界二氧化碳萃取齒瓣石斛

包曉青1，2， 梁明在3， 吳志剛2， 陶正明2*， 林智雄3

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)，浙江溫州325035；2.浙江省亞熱帶作物研究所，浙江溫州325005；3.臺(tái)灣義守大學(xué)化學(xué)工程系，臺(tái)灣高雄84001）

目的 采用超臨界二氧化碳萃?。⊿FE）法萃取齒瓣石斛。方法 使用正己烷、異丙醇、乙酸乙酯、乙醇作為夾帶劑。SFE萃取分兩階段和一階段萃取，前者使用純CO2萃取，再添加夾帶劑萃??；后者直接泵入夾帶劑與CO2共同萃取，以比較兩法的萃取效率。結(jié)果 乙酸乙酯作為夾帶劑更有利于齒瓣石斛中低極性化合物的溶出。直接泵入乙酸乙酯與CO2共萃的方式更有利于齒瓣石斛中各成分的溶出。結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)萃取方式為未來(lái)齒瓣石斛的進(jìn)一步研究提供良好的基礎(chǔ)。

齒瓣石斛；超臨界二氧化碳萃取；夾帶劑；乙酸乙酯

石斛為我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中常用的貴重藥材，藥用歷史悠久，在眾多石斛屬中，齒瓣石斛Dendrobium deυonianum Paxt.是近年來(lái)被研究發(fā)現(xiàn)的一種新的中藥石斛，其野生及栽培量較大，而且經(jīng)化學(xué)成分、藥理等方面的研究結(jié)果表明其質(zhì)量與目前市場(chǎng)上應(yīng)用最為廣泛的鐵皮石斛類似程度極大［1-2］，有研究者［3］從齒瓣石斛中分離得到具有抗氧化活性的化合物，具有較好的清除自由基能力，清除率達(dá)到84%。另有學(xué)者［4］利用GC-MS鑒定出齒瓣石斛中48種脂溶性成分，并具有重要的藥理活性。在目前的研究中，多以有機(jī)溶劑回流提取齒瓣石斛，但這些方法具有溶劑消耗量大、費(fèi)時(shí)、溶出成分低等缺點(diǎn)。超臨界流體萃取技術(shù)（SFE）作為一種新型的提取分離技術(shù)，在藥用植物有效成分的提取分離中得到廣泛應(yīng)用［5-7］。特別是超臨界二氧化碳具有氣體擴(kuò)散性及液體溶解能力［8］、臨界點(diǎn)低（7.2 MPa、32℃）易操作，以及流體減壓后即可氣化與萃取物分離等優(yōu)點(diǎn)，并能有效降低萃取的溫度與有機(jī)溶劑用量，達(dá)到活性保留且降低能源消耗的目的［9］。例如，林杰等［10］利用超臨界二氧化碳從柚子粉中提取柚皮苷，發(fā)現(xiàn)用該方法萃取柚皮苷具有萃取速度快，提取率高，產(chǎn)品的純度好等優(yōu)點(diǎn)。張郁松［11］采用超臨界CO2流體萃取法從干紅辣椒中得到的辣椒紅色素，與傳統(tǒng)方法相比，辣椒紅色素要更穩(wěn)定、沒(méi)有辣味、色澤鮮艷、感官品質(zhì)明顯優(yōu)于有機(jī)法。并且超臨界流體萃取技術(shù)能選擇性地按照成分極性大小、沸點(diǎn)高低和分子質(zhì)量大小依次萃取出來(lái)，比較適用于提取中低極性成分［12］。本研究利用超臨界流體萃取技術(shù)對(duì)齒瓣石斛進(jìn)行萃取，探討該萃取方式對(duì)齒瓣石斛中各成分溶出程度的影響。

1　材料

1.1儀器 超臨界萃取設(shè)備（臺(tái)灣金屬工業(yè)研究發(fā)展中心）；高效液相色譜儀（泵HITACHI L-2130），檢測(cè)器（HITACHIL-4200 UV-Vis）；SAMPO KB-RD85U型真空烘箱；PANCHUM R-2000V1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

1.2試劑 95%乙醇（景明化工股份有限公司，分析純）；乙腈、正己烷、乙酸乙酯、異丙醇等有機(jī)溶劑（友和貿(mào)易股份有限公司，色譜純）；實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水；CO2（錦德氣體有限公司，純度＞99.9%）。齒瓣石斛藥材由浙江鐵楓鐵皮生物科技有限公司提供。

2　方法

2.1分析方法的建立 為了檢測(cè)不同提取方法萃取齒瓣石斛的結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)確定以HPLC作為定量的分析方法。Kromasil 100-5C18色譜柱（250 mm× 4.60 mm ID，5μm，Kromasil公司）；流動(dòng)相為乙腈（A）-水溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，30%A；5～15 min，30%→50%A；15～35 min，50%→70%A；35～50 min，70%→50%A；50～55 min，50%→30%A）。體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；柱溫25℃；進(jìn)樣量20μL。

2.2夾帶劑的選擇 由于純二氧化碳對(duì)石斛中復(fù)雜成分的溶解度較低，所以在萃取過(guò)程中必須輔以適當(dāng)比例的夾帶劑以提高二氧化碳溶解度，而不同溶劑作為夾帶劑，其萃取出的成分會(huì)有較大差異，因此首先使用不同有機(jī)溶劑分別提取藥材，以選擇合適的夾帶劑。

稱取定量齒瓣石斛干燥品，按質(zhì)量比1∶30比例加入各萃取溶劑，使用的溶劑分別為正己烷（Hexanes）、異丙醇（L-propanol）、乙酸乙酯（EA），無(wú)水乙醇（EtOH），然后在50℃超聲提取1.5 h，冷卻，過(guò)濾，取殘?jiān)凑胀瑯拥姆椒ㄔ偬崛纱?，合?次續(xù)濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀揮干溶劑，用甲醇復(fù)溶并轉(zhuǎn)移至量瓶，定容，用0.45μm微孔濾膜濾過(guò)后進(jìn)行HPLC分析。

2.3超臨界萃取法 將干燥的齒瓣石斛藥材用粉碎機(jī)粉碎，稱定質(zhì)量180 g裝入萃取釜內(nèi)。萃取時(shí)溫度設(shè)定為50℃，萃取槽壓力設(shè)定為35 MPa，二氧化碳體積流量設(shè)定為60 g/min。本實(shí)驗(yàn)的超臨界萃取分2批次進(jìn)行，第1批次為兩階段萃取法，首先單獨(dú)使用純二氧化碳進(jìn)行萃取3 h后，再以混合質(zhì)量分?jǐn)?shù)8.970%乙酸乙酯的超臨界二氧化碳萃取3 h，萃取過(guò)程當(dāng)中，每30 min于分離槽中收集溶于乙酸乙酯的粗萃物，分別給予編號(hào)為SH001至SH012；第2批次實(shí)驗(yàn)為一階段萃取法，即自萃取開(kāi)始同時(shí)泵入質(zhì)量分?jǐn)?shù)8.970%乙酸乙酯與二氧化碳共持續(xù)萃取6 h，分別給予編號(hào)SH013至SH024。待樣品（SH001～SH024）中二氧化碳揮發(fā)后稱量每瓶的質(zhì)量。前述實(shí)驗(yàn)每階段收集的樣品取6 mL置于離心管中進(jìn)行真空干燥（40℃），計(jì)算粗萃物的質(zhì)量變化，計(jì)算方法如公式1所示，藉此數(shù)據(jù)以了解1 kg齒瓣石斛中可獲粗萃物的量，樣品另以HPLC進(jìn)行分析，以了解其組成變化［13-14］。

根據(jù)結(jié)果繪制成q對(duì)E的萃取曲線，其中q指所流過(guò)萃取斧的二氧化碳的質(zhì)量與載入齒瓣石斛干質(zhì)量的質(zhì)量比，E代表粗萃出物與齒瓣石斛干質(zhì)量的質(zhì)量比，即齒瓣石斛的超臨界流體萃取產(chǎn)物之萃取產(chǎn)率。

3　結(jié)果與分析

3.1不同有機(jī)溶劑萃取結(jié)果 從圖1可以看出，極性最小的正己烷（Hexanes）提取的樣品中成分種類較少，基本上未能萃取出石斛中的成分，異丙醇（L-propanol）、乙酸乙酯（EA）、無(wú)水乙醇（EtOH）溶劑能夠更多的提取出石斛樣品中的成分。而無(wú)水乙醇主要是萃取出其中極性大的物質(zhì)，異丙醇和乙酸乙酯雖然也能將極性大的物質(zhì)萃取出，但是其萃取量相對(duì)無(wú)水乙醇少些。在中小極性成分中，乙酸乙酯的提取效率相對(duì)其他溶劑提取率更高并且不會(huì)提取出太多的大極性成分，因此采用超臨界二氧化碳萃取齒瓣石斛時(shí)可添加適量乙酸乙酯作為夾帶劑進(jìn)行萃取，以期加大中小極性成分的溶出。

圖1　不同有機(jī)溶劑提取齒瓣石斛結(jié)果Fig.1 Extraction of Dendrobium devonianum by different solvents

3.2SFE萃取齒瓣石斛 將SFE萃取得到的齒瓣石斛粗萃物進(jìn)行混合，直接從原液中吸取適量按“2.1”項(xiàng)中的分析方法進(jìn)行HPLC分析（圖2），由于在210 nm處乙酸乙酯會(huì)有吸收，故在圖譜中會(huì)有較大的溶劑峰出現(xiàn)。從圖2中可發(fā)現(xiàn)，SFE粗萃物中成分多樣，并且大多數(shù)都屬于中低極性化合物。

圖2　SFE萃取齒瓣石斛之色譜圖Fig.2 Analytical spectrum of Dendrobium devonianum Paxt.by SFE

本實(shí)驗(yàn)將圖譜中較明顯處的峰進(jìn)行歸類，按照極性從大到小依次分為5大組群，如圖中1～5所標(biāo)示。

3.2.1不同萃取批次總粗萃物的產(chǎn)率 圖3為本研究中兩次批次不同萃取方法得到的萃取曲線，其中空心方塊標(biāo)記代表單純使用超臨界CO2萃取石斛3 h，之后再泵入乙酸乙酯萃取3 h的實(shí)驗(yàn)，實(shí)心圓圈標(biāo)記代表自萃取一開(kāi)始便加入乙酸乙酯作為輔溶劑的萃取。

圖3　不同萃取批次萃取產(chǎn)物的產(chǎn)率Fig.3 Total crude extract yields of different batches of extractions

兩批次萃取實(shí)驗(yàn)進(jìn)行萃取6 h后累積萃取率仍具有上升趨勢(shì)，說(shuō)明其中的粗萃物還未萃取完全，需要繼續(xù)延長(zhǎng)萃取時(shí)間。兩階段萃取法在萃取齒瓣石斛6 h后得到粗萃物約為500 g/kg，一階段萃取方式能夠得到粗萃物約為300 g/kg。

3.2.2不同萃取批次不同成分的產(chǎn)率 由于“3.2”項(xiàng)中定義的5大組群的各信號(hào)峰未能有含量標(biāo)準(zhǔn)曲線，故無(wú)法準(zhǔn)確計(jì)算粗萃物中各成分的量，因此本實(shí)驗(yàn)假設(shè)用各信號(hào)峰的峰面積分別除以粗萃物的質(zhì)量，代表各組成在粗萃物中的含有量，如果將其累加并對(duì)時(shí)間作圖，則結(jié)果如圖4所示，圖中組群1～5分別表示圖2中信號(hào)峰1～信號(hào)峰5，同樣空心方塊標(biāo)記代表兩階段萃取，實(shí)心圓圈標(biāo)記代表自萃取一開(kāi)始便加入乙酸乙酯作為輔溶劑的萃取。

圖4　運(yùn)用SFE萃取齒瓣石斛得率Fig.4 Extract yields of Dendrobium devonianum Paxt.by SFE

從圖4中可知，SFE從石斛中萃取出的主要5種成分大致隨時(shí)間而減少，代表各成分含量隨時(shí)間增加而愈來(lái)愈少。其中組群1，2兩種成分的趨勢(shì)類似，其余3種組群則大致相似。因此可以將5個(gè)信號(hào)峰大致分成兩個(gè)族群。

族群一（即圖2中信號(hào)峰1，2）在單獨(dú)使用二氧化碳進(jìn)行萃取時(shí)，該成分處于平穩(wěn)增長(zhǎng)狀態(tài)，泵入乙酸乙酯共同萃取后，其在粗萃物中的含量明顯增加，可能是該成分需在乙酸乙酯的輔助下，才能夠大幅度萃取出。該族群若在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始就使用二氧化碳和乙酸乙酯共萃，其在粗萃物中的量迅速下降，之后處于平穩(wěn)趨勢(shì)，可能是由于該成分在開(kāi)始時(shí)大部份成分就已經(jīng)被萃取出。另外從圖中可知使用兩階段萃取方式得到的粗萃物總量稍高于一階段萃取。

族群二（即圖2中信號(hào)峰3，4，5）在單獨(dú)使用二氧化碳進(jìn)行萃取時(shí)，該成分同樣處于平穩(wěn)增長(zhǎng)狀態(tài)，繼而加入乙酸乙酯共萃其含有量有所增加，但增加幅度并不顯著。若在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始就使用二氧化碳和乙酸乙酯共萃，其含有量在2 h內(nèi)急劇增長(zhǎng)后即不再增加，說(shuō)明基本已經(jīng)完全被萃取出來(lái)了。同時(shí)可知使用一階段萃取方式得到的粗萃物總量遠(yuǎn)高于兩階段萃取。

4　小結(jié)與討論

本實(shí)驗(yàn)采用超臨界二氧化碳添加輔助溶劑乙酸乙酯共萃取的方式提取齒瓣石斛。在溫度為50℃，萃取槽壓力為35 MPa，二氧化碳體積流量為60 g/min時(shí)進(jìn)行兩批次不同方式的萃取，發(fā)現(xiàn)先用純二氧化碳進(jìn)行萃取繼而泵入乙酸乙酯共萃的方式更有利于總粗萃物的溶出。

族群一化合物為相對(duì)極性較大的化合物，在單獨(dú)使用純二氧化碳萃取時(shí)，由于二氧化碳對(duì)極性化合物的溶解能力不足，因此族群一化合物未能較多地被萃取出，當(dāng)泵入乙酸乙酯共萃后，其溶出程度大幅度增加，說(shuō)明族群一化合物需要在在乙酸乙酯的輔助下，才能夠被大量萃取出。雖然先使用純二氧化碳萃取后在泵入乙酸乙酯與二氧化碳共萃的方式得到的萃取物總量比直接使用兩者共同萃取的方式要高，但是高出的量并不多，因此若要更多地萃取出族群一化合物應(yīng)該選擇一階段的萃取法，即在萃取開(kāi)始即泵入乙酸乙酯與二氧化碳共同萃取。

族群二化合物在使用一階段萃取法時(shí)得到的萃取量遠(yuǎn)高于兩階段萃取法，這可能是因?yàn)橐宜嵋阴ヅc石斛中的溶質(zhì)分子更容易形成極性力、氫鍵或其他的化學(xué)鍵，增進(jìn)了超臨界流體溶劑對(duì)于溶質(zhì)的溶解性。因此若要更多地萃取出族群二化合物同樣應(yīng)該選擇一階段的萃取法，即在萃取開(kāi)始即泵入乙酸乙酯與二氧化碳共同萃取。但是在兩階段萃取時(shí)，泵入乙酸乙酯與二氧化碳共萃卻未見(jiàn)該群族化合物較大幅度的增加，其中原因還有待更進(jìn)一步的考察。

使用超臨界二氧化碳添加夾帶劑（乙酸乙酯）對(duì)齒瓣石斛進(jìn)行萃取有效、方便、快速地將齒瓣石斛中成分萃取出，為以后齒瓣石斛化學(xué)成分的研究提供良好的基礎(chǔ)。

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Extraction of chem ical com ponents from Dendrobium devonianum Paxt.by supercritical carbon dioxide

BAO Xiao-qing1，2， LIANG Ming-zai3， WU Zhi-gang2， TAO Zheng-ming2*， LIN Zhi-xiong3
（1.Wenzhou Medical Uniυersity，Wenzhou 325005，China；2.Zhejiang Institute for Subtropical Crops，Wenzhou 325005，China；3.Department of Chemical Engineering，I-Shou Uniυersity，Kaohsiung 84001，Taiwan，China）

Dendrobium deυonianum Paxt.；supercritical carbon dioxide extraction（SFE）；modifier；ethyl acetate

R284.2

A

1001-1528（2015）03-0530-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.015

2014-08-29

包曉青（1990—），女，碩士生，研究方向?yàn)樘烊凰幬锏姆蛛x純化。Tel：13587951484，E-mail：631356839@qq.com

陶正明，副研究員，主要從事中藥資源工作。