［11C］N-甲基乙酰唑胺PET/CT評價肝臟纖維化早期診斷的價值

杜　名，韓婷婷，張　新，曹　禮，趙周社，李　紅，辛　軍，郭啟勇

（1.中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院放射科，遼寧 沈陽　110004；2.通用電氣（中國）醫(yī)療系統(tǒng)集團，北京　100176）

［11C］N-甲基乙酰唑胺PET/CT評價肝臟纖維化早期診斷的價值

杜名1，韓婷婷1，張新1，曹禮1，趙周社2，李紅2，辛軍1，郭啟勇1

（1.中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院放射科，遼寧 沈陽110004；2.通用電氣（中國）醫(yī)療系統(tǒng)集團，北京100176）

目的：采用［11C］N-甲基乙酰唑胺作為PET/CT的顯像劑，研究肝臟纖維化不同階段肝組織攝取率，探討［11C］N-甲基乙酰唑胺在評價肝臟纖維化早期診斷的價值。材料與方法：Wistar大鼠26只（雄性）、重量（29 240 g），對照組大鼠（N=8），硫代乙酰胺（TAA）成功建立肝纖維化模型大鼠（N=18），其中輕度肝纖維化（S1，N=10）及肝中重度纖維化（S2+S3，N=8）。以［11C］N-甲基乙酰唑胺為顯像劑，先對大鼠進行PET/CT動態(tài)掃描，選擇存活大鼠再以乙酰唑胺為抑制劑進行抑制實驗。實驗結(jié)束后大鼠處死、取材。每次掃描結(jié)束后進行數(shù)據(jù)重建，分別計算不同時間點（20 s、90 s、5min、10min、20min、30min和45min）肝臟標準攝取值（SUV），分析比較其與病理結(jié)果之間的聯(lián)系及相關(guān)性。結(jié)果：對照組與實驗組90 s、5min、10min SUV值具有顯著性差異；實驗組組內(nèi)各時間點SUV值無顯著性差異。實驗組SUV值與病理免疫組化結(jié)果之間具有良好相關(guān)性。對照組抑制實驗呈陽性結(jié)果，而實驗組抑制實驗呈陰性結(jié)果，且隨肝纖維化程度加重，抑制效率減低。結(jié)論：［11C］N-甲基乙酰唑胺PET/CT肝臟顯像能夠用于檢測早期纖維化時功能受損，進而評估肝纖維化的嚴重程度，對肝臟纖維化分期。

肝硬化；乙酰唑胺；正電子發(fā)射斷層顯像術(shù)

肝纖維化是肝內(nèi)纖維結(jié)締組織的異常增生與沉積，是各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)階段，其發(fā)生與發(fā)展伴隨肝內(nèi)血管、肝組織細胞功能的變化。水通道蛋白（Aquaporin，AQP）分布于全身不同臟器，介導不同類型細胞膜上跨膜水分子轉(zhuǎn)運［1-2］。學者研究發(fā)現(xiàn)AQP1在肝臟纖維化的過程中，通過提高內(nèi)皮侵襲，促進腫瘤血管的生成［3］。肝臟組織中肝細胞上AQP隨著肝臟纖維化程度不同，AQP表達也隨之發(fā)生變化。目前，研究認為早期肝纖維化可以實現(xiàn)逆轉(zhuǎn)。PET/CT將解剖圖像與功能成像相融合，可從分子水平無創(chuàng)、定量測定人體內(nèi)代謝變化，具有很高的敏感性。有報道乙酰唑胺能夠與AQP1、AQP4特異性結(jié)合，本研究采用全自動化方法合成［11C］N-甲基乙酰唑胺后，對大鼠肝臟纖維化模型進行PET/CT成像，觀察大鼠在不同階段肝纖維化過程中對［11C］N-甲基乙酰唑胺的攝取，進而評價其在早期纖維化中的診斷價值。

1　資料與方法

1.1實驗對象及模型建立

健康Wistar大鼠（中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院動物部），雄性26只，重量平均29 240 g。隨機分為對照組（n=8）及實驗組（n=18）。實驗組建立肝纖維化模型：硫代乙酰胺（TAA）滅菌注射水配制成質(zhì)量濃度40mg/mL的溶液，每周3次 （每周1、3、5）按300mg/kg予對照組大鼠腹腔注射，注射藥物前稱重記錄，按照以下方法調(diào)整模型劑量：①較前次體質(zhì)量下降5%以內(nèi)者維持原用量；②較前次體質(zhì)量下降5%～10%者用量減少100mg/kg；③較前次體質(zhì)量下降10%以上暫停注射，待體質(zhì)量停止下降，再調(diào)整用量，以避免死亡；④大鼠體質(zhì)量連續(xù)增加5%以上用量增加40mg/kg。對照組正常飼養(yǎng)，不予處置。

1.2材料與方法

1.2.1主要材料

大鼠 AQP1抗體 （美國，Alpha Diagnostic公司），乙酰唑胺（美國，Sigma/Aldrich公司），TAA，本院使用GE公司MINItrace II和TracerLab FXc全自動化合成［11C］N-甲基乙酰唑胺。

1.2.2［11C］N-甲基乙酰唑胺合成方法

利用TRACERlab FXC pro合成儀平臺，堿性條件下［11C］CH3I與乙酰唑胺在80℃條件反應(yīng)。然后以磷酸緩沖液為淋洗液，通過高性能液體色譜（High performance liquid chromatography，HPLC）分離獲得［11C］N-甲基乙酰唑胺。合成效率50%以上、放射化學純度＞98%。

1.2.3［11C］N-甲基乙酰唑胺PET/CT掃描

實驗前動物禁食禁水12 h，實驗對象10%水合氯醛麻醉，取大鼠仰臥位固定，建立鼠尾靜脈通路，注射 ［11C］N-甲基乙酰唑胺，放射性活度（0.4± 0.12）mCi/mL，體積（1.0±0.2）mL，采用GE Discovery Elite PET/CT的VIP掃描模型，層厚3.25mm，進行連續(xù)動態(tài)掃描45min。存活大鼠待體內(nèi)11C衰減接近本底時，進行抑制試驗，同時注射0.5mL（1g/L）乙酰唑胺及［11C］N-甲基乙酰唑胺，再進行掃描。圖像融合采用GE AW4.5和Xeleris 3.0工作站提供的軟件完成，同時獲得橫斷、矢狀和冠狀面及三維PET 及CT以及兩者的融合圖像。掃描結(jié)束后采用Sharp IR+VUE Point HD圖像重建技術(shù)對采集圖像進行重建，采用OSEM迭代重建法。以上步驟由1名醫(yī)師、3名技師協(xié)作完成。

1.2.4圖像分析及數(shù)據(jù)處理

通過CT定位，在融合PET/CT圖像上選擇肝臟感興趣（ROI），面積20mm2，自動生成大鼠肝臟的時間放射性曲線（圖1）。分別獲得抑制實驗前后，在注射 ［11C］N-甲基乙酰唑胺后20 s、90 s、5min、10min、20min、30min和45min肝臟組織的標準攝取值（SUV），再計算肝臟攝取值變化率，公式如下所示：

圖1　ROI選取及大鼠肝臟時間放射曲線。Figure 1.Selection of ROI and the time radiation curve of rat liver.

1.3病理學分析

掃描結(jié)束后處死大鼠，進行心臟灌洗，肝中葉取材對應(yīng)所取ROI，將所取標本分成兩份，分別置于10%甲醛溶液中固14 d后分別行天狼星染色后于200倍光鏡下觀察及免疫組化AQP1染色定量分析。免疫組化具體方法如下：①切片的脫蠟；②抗原修復；③封閉內(nèi)源性過氧化物；④封閉非特異性抗原；⑤染色；⑥脫水封片。染色結(jié)束后對切片進行平均光密度值計算，進行定量分析。肝纖維化分期標準采用Scheuer分類法：S0：無肝纖維化；S1：無匯管區(qū)擴大纖維化及局限竇周纖維化；S2：匯管區(qū)周圍纖維化或纖維間隔形成小葉結(jié)構(gòu)保留；S3：大量纖維間隔形成伴小葉結(jié)構(gòu)紊亂無肝硬化；S4：早期肝硬化。實驗組模型大鼠以病理結(jié)果進行分組。

1.4統(tǒng)計學分析

2　結(jié)果

2.1［11C］N-甲基乙酰唑胺PET/CT結(jié)果

2.1.1［11C］N-甲基乙酰唑胺在對照組大鼠動態(tài)分布以及乙酰唑胺的影響

［11C］N-甲基乙酰唑胺和［11C］N-甲基乙酰唑胺+乙酰唑胺抑制劑在對照組大鼠從尾靜脈注射后各時間點體內(nèi)分布（圖2），肝臟攝取值見表1。實驗組肝臟攝取值較對照組增高，且抑制劑使用前，90 s、5min 及10min，對照組與實驗組SUV值均具有顯著性差異。使用抑制劑后，雖然對照組與實驗組抑制均成陽性，但無顯著性差異。

圖2　對照組大鼠各時間點抑制劑前后冠狀面PET圖像。Figure 2.PET images at each time point of the control group before and after use of inhibitors.

表1　對照組和實驗組大鼠［11C］N-甲基乙酰唑胺PET/CT顯像肝臟SUV結(jié)果

2.1.2［11C］N-甲基乙酰唑胺在實驗組大鼠動態(tài)分布以及乙酰唑胺的影響

［11C］N-甲基乙酰唑胺90 s時在不同程度肝纖維化大鼠體內(nèi)分布（圖3）；乙酰唑胺抑制劑注射前后肝臟攝取值表2。抑制劑使用前，實驗組各程度纖維化大鼠SUV值見無顯著性差異。使用抑制劑后，雖然抑制結(jié)果均為陽性，但無顯著性差異，然而可以看出，隨肝纖維化程度加重，肝臟攝取值逐漸增高，抑制率卻隨纖維化加重而減低。

表2　實驗組大鼠［11C］N-甲基乙酰唑胺PET/CT顯像肝臟SUV結(jié)果

圖3　不同階段肝纖維化冠狀面PET圖像。Figure 3.PET images of different stages of liver fibrosis.

2.2病理學結(jié)果

肝臟纖維化S1、S2、S3期肝組織AQP1表達免疫組織如圖4所示。

圖4　各期病理與免疫組化結(jié)果。上列依次為S0～S3期大鼠天狼星染色結(jié)果。隨纖維化分期進展，可見肝內(nèi)膠原纖維和網(wǎng)狀纖維數(shù)量從少到多，從稀疏到致密，分布從散在到廣泛范圍擴大，纖維化程度逐漸加重。下列依次為與天狼星染色對應(yīng)的S0～S3期大鼠AQP1免疫組化結(jié)果。Figure 4.　Pathologic and immunohistochemical results of different stages of liver fibrosis.The above section：Sirius dyeing results of S0～S3 rats.With the progress of liver fibrosis，the amount of collagen and reticular fiber in liver became increased，denser and wider.The following section：immunohistochemical results of AQP1 of S0～S3 rats.

2.3SUV值與免疫組化相關(guān)性分析

不同階段肝纖維化大鼠用數(shù)字表示其嚴重程度，1：S0期，2：S1期，3：S2+S3期，使用Spearman相關(guān)性分析得出不同階段肝纖維化與光密度值具有統(tǒng)計學差異，且呈正相關(guān)（P=0.023，R=0.672）（表3）。

表3　大鼠肝臟纖維化模型肝臟SUV值與肝臟AQP1分子病理之間關(guān)系

3　討論

3.1肝臟纖維化過程AQP表達改變

肝纖維化是多種原因引起的慢性肝損害所致的病理改變，表現(xiàn)為肝內(nèi)細胞外間質(zhì)成分過度異常地沉積，導致肝細胞功能受損、肝內(nèi)血管的變化，正常肝 臟 內(nèi) 含 有 AQP1、AQP3、AQP4、AQP7、AQP8、AQP9和AQP11［4］，而AQP1主要分布在毛細血管上［5］，Robert等通過研究證實，肝硬化中AQP1高表達，其原因可能是AQP增強了滲透水的滲透率，加速了成纖維細胞生長因子誘導的肝竇內(nèi)皮細胞膜的皺縮，從而在肝硬化的過程中帶動了侵入和病理性血管生成［2］。

3.2［11C］N-甲基乙酰唑胺PET/CT在肝臟纖維化診斷的價值

目前認為早期肝纖維化尚有逆轉(zhuǎn)為正常的可能。PET提供詳盡的功能與代謝等分子信息，對病變更加靈敏、準確、特異。11C-AQP［6］作為特異性受體，與AQP1結(jié)合，其表達的增高間接反映了AQP的改變。本研究中發(fā)現(xiàn)肝臟纖維化過程中，SUV值顯著增加 （90 s：Z=-2.11，P=0.035；5 min：Z=-2.167，P= 0.03；10min：Z=-2.444，P=0.015），而不同分期肝纖維化之間SUV值尚無統(tǒng)計學意義。SUV值代表AQP1表達程度具有良好相關(guān)性，因此我們認為肝纖維化過程中，可以通過［11C］N-甲基乙酰唑胺PET/ CT顯像早期發(fā)現(xiàn)。

關(guān)于AQP抑制劑乙酰唑胺的抑制效果意見不一。Wang等學者研究得出乙酰唑胺對AQP1、AQP3 及AQP4具有抑制作用［7］。李加慧等通過實驗室研究驗證乙酰唑胺抑制作用的同時，得到了最低有效劑量［8］。此后韓婷婷等在此基礎(chǔ)上，通過NH3·H20 PET/CT成像也得到了同樣的結(jié)論，并且證實水分子通過毛細血管與組織間隙并非依靠簡單的自由擴散，而是通過AQP介導［9］。本實驗中，使用乙酰唑胺后，對照組與實驗組中大鼠肝臟SUV明顯減低，抑制結(jié)果為陽性，且隨肝臟纖維化程度的加重，乙酰唑胺抑制率逐漸減低，這可能是肝纖維化過程中不僅伴隨著AQP數(shù)量的改變，其親和力可能也發(fā)生著改變。對照組與實驗組中肝臟攝取率為陽性，即乙酰唑胺可以有效抑制，而在實驗組中，隨肝臟攝取值增高，肝臟攝取率逐漸下降，其原因可能有如下幾種情況：①毛細血管代償能力。輕度肝纖維化時（S1），雖然毛細血管受損，但其還具有一定的代償能力，但中度度肝纖維化（S2～S3）時，毛細血管代償能力有限，肝臟結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，乙酰唑胺抑制率減低。②AQP自身親和力的減低造成的。肝臟纖維化雖然伴隨著AQP數(shù)量的增加，然而親和力可能減低，使其與抑制劑乙酰唑胺結(jié)合力減低，導致相同劑量的乙酰唑胺抑制效率減低。③隨著肝纖維化的發(fā)展，肝內(nèi)的AQP的種類發(fā)生了改變。肝臟內(nèi)不僅存在如上所述的AQP1、AQP3、AQP4，還有AQP8、AQP9、AQP11。乙酰唑胺對1、3、4具有抑制作用，然而對8、9、11的抑制作用尚無定論，因此，依據(jù)本實驗結(jié)果我們推測，利用乙酰唑胺抑制試驗可以鑒別不同分期肝臟纖維化嚴重程度。

本研究存在局限性：①實驗數(shù)據(jù)存在一定的重疊性。②本實驗主要研究肝臟內(nèi) AQP1、AQP3、AQP4，但實際肝臟內(nèi)還存在其他種類 AQP，如AQP8、AQP9、AQP11等，受體顯像及抑制試驗存在一定的局限性。③本實驗研究大鼠模型的數(shù)量有限，而且并未增加S4期模型，將在今后實驗研究中進一步補充。④大鼠肝臟纖維化模型與人類肝纖維化發(fā)生與發(fā)展存在一些差別，因此該方法應(yīng)用于臨床還需要進一步驗證。

綜上所述，［11C］N-甲基乙酰唑胺PET/CT顯像能夠用于檢測早期纖維化時功能受損，進而評估肝纖維化的嚴重程度。

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Evaluation of［11C］N-methyl acetazolam ide PET/CT in early diagnosis of liver fibrosis

DU Ming1，HAN Ting-ting1，ZHANG Xin1，CAO Li1，ZHAO Zhou-she2，LI Hong2，XIN Jun1，GUO Qi-yong1
（1.Department of Radiology，Shengjing Hospital of China Medical University，Shenyang 110004，China；2.General Electric Company Healthcare（China），Beijing 100176，China）

Objective：The［11C］N-methyl acetazolamide（［11C］N-MAC），as the imaging agent，was used to study the uptake rate of liver tissue in different stages of liver fibrosis by PET/CT，and then to investigate its value in evaluating early diagnosis of liver fibrosis.Method：Twenty-six Wistar rats（male，29 240 g weight）were included with 8 in the control group and 18 in the test group（mild liver fibrosis，S1，N=10 and severe liver fibrosis，S2+S3，N=8）.Liver fibrosis was induced by thioacetamide（TAA）.After PET/CT dynamic scanning with［11C］N-MAC，the mice which were alive in the second day，continued to receive inhibition test with acetazolamide.Data reconstruction was accomplished after scanning.The standard uptake value （SUV）of the liver at 5 s，20 s，90 s，5min，10min，20min，30min and 45min were calculated to analyze its correlation with pathological results.Results：The SUVs at different time points（90 s，5 min，10 min）of the control group and test group showed significant correlation.But there was no significant correlation between different stages of liver fibrosis.There was good correlation between the SUV values in the test group and the pathological results of immunohistochemistry.The results of inhibition tests were positive for the control group and negative for the test group.With the aggravation of hepatic fibrosis，the inhibiting efficiency decreased.Conclusion：The［11C］N-MAC PET/CT is a promising tool to detect the early tendency of liver fibrosis by the level of SUV values and then to distinguish the stages of liver fibrosis.

Liver cirrhosis；Acetazolamide；Positron-emission tomography

R657.3；R817.4

A

1008-1062（2015）03-0183-05

2014-07-28；

2014-09-16

杜名（1988-），男，遼寧丹東人，在讀碩士研究生。

辛軍，中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院放射科，110004。

國家自然科學基金（81471718、81271566）；遼寧省自然科學基金（2014021088）。