反膠束固定化醇脫氫酶的制備及應(yīng)用研究

柳暢先*， 何進(jìn)星

(中南民族大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，分析化學(xué)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430074)

反膠束是表面活性劑分散于連續(xù)有機(jī)相中自發(fā)形成的與正常膠束結(jié)構(gòu)相反的一種含水聚合體。研究者在酶的分離純化和固定化方面進(jìn)行了深入探討，發(fā)現(xiàn)反膠束體系能較好地模擬酶的天然環(huán)境，因而大多數(shù)酶能保持活性和穩(wěn)定性[1]。反膠束體系在酶的定位和結(jié)構(gòu)[2，3]、動力學(xué)特征[4，5]、催化活性[6 - 9]等方面的理論研究，進(jìn)一步拓寬了反膠束技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域。Kamyshny等[10]用乙基己基琥珀酸酯磺酸鈉(AOT)-辛烷反膠束體系固定化葡萄糖氧化酶，研究顯示酶在反膠束溶液中的活力和穩(wěn)定性遠(yuǎn)大于水溶液，且活力決定于含水量。Hirakawa等[11]用AOT-異辛烷反膠束體系固定化酵母醇脫氫酶，發(fā)現(xiàn)該體系可增加酶的穩(wěn)定性，并延長輔酶的再生使用壽命。

作者曾經(jīng)以十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)-辛烷-己醇反膠束體系分離純化醇脫氫酶(ADH)[12]。本文從酶法測定的角度探討以該體系固定化ADH，考察了含水量、表面活性劑和助溶劑用量對于ADH固定化的影響，并對游離酶和固定化酶進(jìn)行催化動力學(xué)性質(zhì)研究。應(yīng)用該體系測定了試樣中微量組分。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

UV1100紫外可見分光光度計(jì)(北京瑞利分析儀器公司)；FA2004分析天平(上海精科天平)；pHS-3C精密pH計(jì)(上海雷磁儀器廠);WH-1微型旋蝸混合儀(上海滬西分析儀器廠)；CS-501恒溫水浴槽(重慶銀河實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。

乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.7 mol/L,用99.7%的無水乙醇配制)，ADH(Sigma公司)，氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD,上海伯奧生物科技有限公司)，CTAB(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，辛烷(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，己醇(天津市博迪化工有限公司)，三羥甲基氨基甲烷(Tris)-HCl緩沖溶液(0.05 mol/L)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1反膠束固定化ADH的制備于錐瓶中加入0.6 g CTAB，再加入己醇、辛烷共5.0 mL，然后邊振蕩邊加入含有乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液和ADH的緩沖液，最終形成均一透明的反膠束固定化ADH溶液。

1.2.2酶活力及底物濃度的測定于比色皿中加入3.0 mL反膠束溶液，20 μL 0.2 mol/L NAD溶液，混勻后立即在340 nm處測定吸光度變化值，計(jì)算酶活力：v=△A×V/(△t×ε×b)。式中,v為酶活力(酶促反應(yīng)速度,μmol/min或U)；△A為吸光度變化值；V為反應(yīng)液體積(mL)；△t為時(shí)間變化值(min)；ε為摩爾吸收系數(shù)(L/(mol·cm))；b為光程(cm)。相對酶活力=(酶活力/酶活力最大值)×100%。

根據(jù)米氏方程可求出底物濃度：1/v=Km/vmaxc+1/vmax。式中，v為酶促反應(yīng)速度(μmol/min)；Km為米氏常數(shù)(mmol/L)；vmax為最大酶促反應(yīng)速度(μmol/min)；c為底物濃度(mmol/L)。

2 結(jié)果與討論

2.1 反膠束固定化酶體系的形成條件

含水量(W0)是反膠束體系中的重要參數(shù)，決定反膠束水池的大小和性質(zhì)，且導(dǎo)致酶活力的變化。當(dāng)W0值較小時(shí)，酶不能充分水化，所以酶活力較低；當(dāng)W0值過大時(shí)，可能是由于膠束液滴中的水量增大，酶的構(gòu)象變化，不適于底物的結(jié)合，使酶活力下降。增加表面活性劑CTAB的濃度可以增加反膠束的數(shù)量和體積，增大對ADH的溶解能力，使ADH更多地進(jìn)入反膠束。但CTAB濃度過大時(shí)，可能在溶液中形成較復(fù)雜的聚合體，對蛋白質(zhì)的作用力減弱，而使ADH進(jìn)入反膠束的量減少。CTAB為單鏈陽離子表面活性劑，其非極性尾部較雙鏈表面活性劑小，所以需要加入助溶劑己醇才能形成穩(wěn)定的反膠束溶液。但隨著己醇含量的增加，反膠束中ADH活力逐漸降低，可能是己醇量過大使酶失活所致。固定化最佳條件為：W0=13，CTAB濃度0.35 mol/L，己醇濃度13%，見圖1。

圖1 含水量(a)、CTAB濃度(b)和己醇濃度(c)對酶固定化的影響Fig.1 Effects of W0，(a) concentraction of CTAB (b) and hexanol (c) on the immobilization of ADH

2.2 酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1溶液pH值和溫度對酶活力的影響在不同pH值的水溶液和反膠束溶液中分別對游離酶和固定化酶活力進(jìn)行測定，由于反應(yīng)介質(zhì)不同，會影響酶活性部位中重要基團(tuán)、酶-底物復(fù)合物以及底物的解離狀態(tài),從而影響酶活力的變化范圍，游離酶和固定化酶動力學(xué)反應(yīng)的最適宜pH值分別為8.2和8.8，見圖2?？煽闯龉潭ɑ笇H的變化很敏感，但只需在酶法測定時(shí)控制好測定條件就能得到準(zhǔn)確結(jié)果。在溫度5～50 ℃范圍內(nèi)測定溫度對酶活力的影響。如圖3所示，游離酶和固定化酶隨溫度變化的趨勢相似，即隨溫度升高酶的活力增大，溫度過高時(shí)則酶變性使其活力降低，但變化的溫度范圍不同，游離酶和固定化酶的最適反應(yīng)溫度分別為31 ℃和20 ℃，與游離酶相比，固定化酶適宜于在較低的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行催化反應(yīng)。

圖2 pH對酶活力的影響Fig.2 Effect of pH on the enzymatic activity1.free enzyme；2.immobilized enzyme.

圖3 溫度對酶活力的影響 Fig.3 Effect of temperature on the enzymatic activity 1.immobilized enzyme；2.free enzyme.

2.2.2米氏常數(shù)以乙醇為底物，在游離酶和固定化酶的最適條件下測定酶促反應(yīng)速度，繪制Lineweaver-Burk曲線，測出游離酶和固定化酶的米氏常數(shù)(Km)分別為12 mmol/L和7 mmol/L，見圖4。Km是反映酶與底物結(jié)合力的參數(shù)，Km越小則酶與底物親和力越大。固定化以后酶的Km減小，表明酶和底物的親和力有所增加，有利于其進(jìn)行酶促反應(yīng)，若采用速度法測定底物含量，Km越小，保持一定的初始速度所需酶量越少。

2.2.3酶的活力穩(wěn)定性在溫度10 ℃、30 ℃及最佳介質(zhì)條件下測定了游離酶和固定化酶的活力穩(wěn)定性。由圖5所示，30 ℃下游離酶150 min后失活90%，固定化酶失活50%，可見ADH在反膠束中較穩(wěn)定。這是由于反膠束能更好地模擬酶的天然環(huán)境，所以能較好地保持酶的活性和穩(wěn)定性。但過高的溫度會破壞反膠束，使固定化酶失活很快。因此，在常溫下用反膠束固定化酶進(jìn)行酶法測定是可行的。

圖4 Lineweaver-Burk曲線Fig.4 Lineweaver-Burk curves1.free enzyme；2.immobilized enzyme.

圖5 酶的活力穩(wěn)定性 Fig.5 The active stability of enzymes 1.immobilized enzyme,10 ℃;3.free enzyme,10 ℃; 2.immobilized enzyme,30 ℃;4.free enzyme,30 ℃.

2.3 用固定化酶進(jìn)行試樣測定

2.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線按實(shí)驗(yàn)方法測出乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液的酶促反應(yīng)速度，繪制1/v～1/c標(biāo)準(zhǔn)曲線，在2.5～57 mmol/L范圍內(nèi)具有線性關(guān)系?；貧w方程為：1/v=1.05/c+2.80，r=0.9954。檢出限為13 μmol/L。

2.3.3試樣測定及加標(biāo)回收測定了小牛血清試樣中乙醇的含量，并進(jìn)行加標(biāo)回收，結(jié)果見表1。

表1 試樣測定及加標(biāo)回收結(jié)果(n=5)

3 結(jié)論

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知酶的最佳固定化條件為：含水量13，CTAB濃度0.35 mol/L，己醇濃度13%。對游離酶和固定化酶的催化動力學(xué)性質(zhì)研究表明：游離酶與固定化酶的最適反應(yīng)pH分別為8.2與8.8，最適宜的反應(yīng)溫度分別為31 ℃和20 ℃。由Lieweaver-Burk曲線測出游離酶和固定化酶的米氏常數(shù)分別為12 mmol/L和7 mmol/L。在30 ℃及最佳介質(zhì)條件下測定了游離酶和固定化酶的活力穩(wěn)定性，游離酶存放150 min失活90%，而固定化酶失活50%，可見ADH在反膠束中更穩(wěn)定。