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    檸檬酸熒光碳點的合成及其在Fe(Ⅲ)檢測和細(xì)胞成像中的應(yīng)用

    2015-10-16 05:14:32葉志強(qiáng)張德蒙馬小軍譚明乾袁景利
    分析科學(xué)學(xué)報 2015年1期
    關(guān)鍵詞:碳點檸檬酸熒光

    唐 榮, 李 琛, 葉志強(qiáng), 張德蒙, 馬小軍, 譚明乾*, 袁景利

    (1.大連理工大學(xué)精細(xì)化工重點實驗室,遼寧大連 116023; 2.中科院大連化學(xué)物理研究所生物技術(shù)部,遼寧大連 116023; 3.長春市疾病預(yù)防控制中心,吉林長春 130033)

    熒光碳點作為碳納米材料家族的新成員,因具有突出的性能,例如:良好的水溶性和光穩(wěn)定性、無光眨眼、抗光漂白、低的細(xì)胞毒性,以及良好的生物相容性等,受到越來越多的關(guān)注[1 - 4]。熒光碳點的顯著特性在于其激發(fā)光譜較寬,且發(fā)射光譜隨著激發(fā)波長的變大而發(fā)生紅移,可發(fā)出不同顏色的熒光[5]。熒光碳點的合成方法已有很多文獻(xiàn)報道,主要有激光消融法[6]、電化學(xué)法[7]、化學(xué)氧化法[8]、水熱法[9]以及微波法[10]等。這些合成方法大多是通過一步合成形成熒光碳點,操作簡單。另外,可以用來合成熒光碳點的原料來源廣泛,例如草木灰[11]、有機(jī)小分子[12]、糖類[13,14]以及面包食品[15]等均可以用來制備熒光碳點。合成熒光碳點的原料來源廣泛和合成方法簡單為其應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

    熒光碳點良好的生物相容性和較低的細(xì)胞毒性,使其在生物成像領(lǐng)域[5,16,17]得到廣泛的應(yīng)用。隨著研究的進(jìn)展,熒光碳點的應(yīng)用已經(jīng)不再局限于生物成像,研究者們利用熒光碳點的光穩(wěn)定性好、無光閃爍等優(yōu)點,將其用于光催化[18]和LED燈[19]中。由于合成熒光碳點的原料大部分為含碳的有機(jī)物質(zhì),因此在反應(yīng)的過程中表面會形成大量的官能團(tuán),如-NH2、-COOH等,可以直接或間接地用于金屬離子的檢測[20,21]。因此,熒光碳點的這些優(yōu)良性能及廣譜的應(yīng)用性使其有望成為一種新型的、有潛力的熒光納米材料。

    本研究基于熒光碳點的這些優(yōu)良的性能,選擇檸檬酸為碳源,以水熱法合成了表面帶有羧基和羥基的熒光碳點。利用羧基和羥基與Fe(Ⅲ)絡(luò)合導(dǎo)致碳點的熒光猝滅的特性,建立了檢測Fe(Ⅲ)的新方法,該方法具有良好的選擇性和較寬的線性范圍,并被成功用于自來水中Fe(Ⅲ)的檢測。同時還對檸檬酸熒光碳點進(jìn)行了細(xì)胞熒光成像評價。結(jié)果表明,檸檬酸熒光碳點在金屬離子檢測和細(xì)胞成像方面有潛在的應(yīng)用價值。

    1 實驗部分

    1.1 儀器與試劑

    LS55熒光分光光度計(美國,PerkinElmer公司);Burker Vector 22 傅里葉紅外光譜儀 (德國,BRUKER公司);UV-2550 紫外分光光度計(日本,島津公司);FV 1000共聚焦顯微鏡(日本,奧林巴斯公司);Bruker DRX400核磁共振譜儀(瑞士,Bruker公司);JEM-2000透射電子顯微鏡(日本,JEOL公司);動態(tài)光散射納米粒徑分析儀(英國,Malvern Instruments公司)。

    HEPES(百靈威),葡聚糖G -25凝膠(上海葉源生物有限公司),硫酸奎寧(阿拉丁),氫氧化鈉(中國天津大陸化學(xué)試劑有限公司),磷酸(中國天津恒興化學(xué)試劑有限公司),硼酸(中國天津保地化學(xué)試劑有限公司),鹽酸(北京化工廠),檸檬酸(天津市大茂化學(xué)試劑廠),三氯化鐵(沈陽市試劑五廠),氯化鈉、氯化鉀(天津石英鐘廠霸州市化工分廠),氯化鈣(阿拉丁),氯化鋇(天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司),無水硫酸鎂(沈陽新興試劑廠),氯化銅(天津市天大化學(xué)試劑廠)。所有試劑為分析純。實驗用水為去離子水。

    1.2 實驗方法

    1.2.1碳點的制備以檸檬酸為原料,采用水熱法合成熒光碳點。稱取1.15 g檸檬酸,將其溶于20 mL去離子水中,超聲使其充分溶解。將配好的溶液轉(zhuǎn)入30 mL含有聚四氟乙烯內(nèi)襯的水熱反應(yīng)釜中,于馬弗爐中200 ℃反應(yīng)4 h。待反應(yīng)結(jié)束后,將反應(yīng)體系自然冷卻到室溫,移出上清液,依次過0.45、0.22 μm的水系濾膜,最終得到淡黃色的碳點溶液。

    1.2.2碳點的表征熒光發(fā)射光譜和紫外吸收光譜分別使用LS55熒光分光光度計和UV-2550 紫外分光光度計,所有的熒光光譜檢測的狹縫寬度均為10 nm,掃描速度為500 nm/min。熒光猝滅曲線使用FV 1000共聚焦顯微鏡,樣品濃度為19 mg/mL,使用405 nm激光器作為激發(fā)源,功率為13.0%,HV值為700,Gain值為2.00,Offset值為0,掃描速度為2.0 s/Pixel。

    時間分辨熒光使用Horiba Jobin Yvon FluoroMax-4熒光分光光度計,用376 nm激光器作為激發(fā)光源,發(fā)射波長范圍為390~620 nm,狹縫寬度為6.0 nm,掃描速度為500 nm/min,記錄最大發(fā)射波長447 nm處的熒光壽命。采用Horiba公司提供的商業(yè)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

    透射電鏡(TEM)使用功率為200 kV的JEM-2000透射電子顯微鏡觀察。

    Zeta電位使用動態(tài)光散射納米粒度儀(Zetasizer Nano ZS90,英國Malvern Instruments公司)記錄,樣品濃度為19 mg/mL。

    紅外(IR)光譜表征使用Burker Vector 22 傅里葉紅外光譜儀,將樣品與溴化鉀混合研磨制片,記錄500~4 000 cm-1范圍內(nèi)的數(shù)據(jù)。

    1.2.3量子產(chǎn)率的計算將硫酸喹啉溶于0.1 mol/L的H2SO4中作為標(biāo)準(zhǔn)物,其在360 nm處的標(biāo)準(zhǔn)熒光量子產(chǎn)率值為0.54,用熒光分光光度計記錄其在360 nm激發(fā)下的發(fā)射光譜,同時測量其在360 nm處的吸光度值。所合成的檸檬酸碳點測量其在310 nm處的吸光度和熒光發(fā)射光譜。以上所測得的所有熒光發(fā)射光譜都用Origin軟件求得峰面積。熒光碳點的量子產(chǎn)率根據(jù)如下公式計算:Фx=ФR×(Ix/IR)×(AR/Ax)×(nx/nR)2。式中,I指代熒光發(fā)射曲線的峰面積,A指代吸光光度值,Ф指代熒光量子產(chǎn)率值,n代表溶劑的折射率,下標(biāo)x代表待測物,下標(biāo)R代表標(biāo)準(zhǔn)物。

    1.2.4Fe(Ⅲ)的檢測在5 mL離心管中依次加入2.3 mL 10 mmol/L HEPES緩沖溶液(pH=7.0),100 mL 34.3 mg/mL的熒光碳點,100 mL不同濃度的Fe(Ⅲ)溶液,空白加入100 mL去離子水,所有的樣品平行配制三份。熒光光譜的激發(fā)波長皆為310 nm,發(fā)射波長范圍為330~580 nm,狹縫寬度為10 nm,掃描速度為500 nm/min。以415 nm處的熒光強(qiáng)度I對Fe(Ⅲ)的濃度繪制曲線。

    1.3 細(xì)胞標(biāo)記與共聚焦顯微鏡成像

    在24孔板中,加入500 mL小鼠黑色素瘤細(xì)胞(B16-F10,6×104cells/mL)懸浮液,使用含10% 胎牛血清及青霉素、鏈霉素各100 U/mL的RPMI1640作為培養(yǎng)液,在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。而后將培養(yǎng)液換成含5 mg/mL熒光碳點的RPMI1640,孵育12 h。移去培養(yǎng)液并用PBS溶液洗滌2~3次以除去細(xì)胞外圍的熒光碳點。對照試驗組僅加入不含熒光碳點的培養(yǎng)基,其它操作與試驗組完全一致。最后利用FV 1000共聚焦顯微鏡,分別選用405 nm與488 nm激光作為激發(fā)光源,在425~475 nm,500~600 nm范圍采集發(fā)射光信號進(jìn)行體外細(xì)胞成像。激光器功率為10%,HV值為700,Gain值為2.00,Offset值為0,掃描速度為2.0 s/Pixel,掃描分辨率800成像。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 熒光碳點的物化性質(zhì)

    采用水熱法,以檸檬酸為原料合成的熒光碳點,僅僅需要一種原料,無需強(qiáng)酸堿等苛刻反應(yīng)條件就可以一步制備熒光碳點。從表1中可以看出,所合成的熒光碳點的最大激發(fā)波長為310 nm,最大發(fā)射波長為415 nm。以硫酸喹啉作為參照物,計算得出所合成的熒光碳點在310 nm處的量子產(chǎn)率(QY)為5.3%。Zeta電位為-35 mV,說明其表面帶有負(fù)電荷,推測可能含有羧基和羥基。熒光碳點的熒光壽命為5.3 ns。

    表1 熒光碳點的物化性質(zhì)

    2.2 熒光碳點的透射電鏡表征

    圖1為所合成的熒光碳點的透射電鏡(TEM)圖,從圖中可以看出所合成的熒光碳點呈比較規(guī)則的球形,且分布均勻,通過統(tǒng)計120個納米粒得到粒徑分布柱形圖,其粒徑主要分布在1.4~5.0 nm范圍內(nèi),平均粒徑為2.9 nm。檸檬酸碳點在紫外燈下發(fā)出肉眼可見的明亮藍(lán)色熒光(λex=312 nm)。

    圖1 熒光碳點的透射電子顯微鏡(TEM)圖(a)及粒徑統(tǒng)計分布圖(b);插圖是熒光碳點在紫外燈下的照片F(xiàn)ig.1 TEM image (a) and particle size histograms (b) of fluorescent carbon dots;Inset is the fluorescence picture under irradiation of ultraviolet lamp

    2.3 熒光碳點的紫外-可見吸收和熒光發(fā)射光譜

    圖2為熒光碳點的紫外-可見吸收光譜和熒光發(fā)射光譜。從圖中可以看到,用檸檬酸合成的熒光碳點在可見光區(qū)域內(nèi)沒有顯著的吸收峰,但是在200~300 nm之間有明顯吸收。其發(fā)射光譜隨著激發(fā)波長紅移而向長波方向移動,且熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,這與之前文獻(xiàn)所報道[18]的相一致。其發(fā)射帶較寬,從405 nm一直延伸到520 nm,說明檸檬酸熒光碳點可以發(fā)出多色的熒光。

    2.4 熒光碳點的紅外光譜

    為了考察檸檬酸以及用其合成的熒光碳點官能團(tuán)的變化,我們做了紅外(IR)光譜表征。如圖3所示,圖中3 295 cm-1為O-H的伸縮振動吸收峰,而形成熒光碳點之后,O-H伸縮振動吸收峰由3 295 cm-1處的尖峰變成3 082 cm-1處的寬峰,這可能是由于所合成的熒光碳點更容易形成氫鍵的原因。1 757 cm-1和1 690 cm-1為C=O的伸縮振動吸收峰,因為檸檬酸分子本身含有兩種類型的羧基,所以才會在紅外光譜中出現(xiàn)兩種類型的羰基伸縮振動吸收峰。1 402 cm-1為C-H的變形振動峰,1 217 cm-1為C-O的伸縮振動吸收峰,947 cm-1為二聚體O-H的變形振動吸收峰。紅外光譜表征結(jié)果表明,合成的熒光碳點所含有的官能團(tuán)與檸檬酸本身相似,表面含有羧基和羥基,這與我們之前所測得的Zeta電位為負(fù)值相符。

    圖2 熒光碳點的紫外-可見吸收和熒光發(fā)射光譜Fig.2 UV-Vis absorption and fluorescence emission spectra of fluorescent carbon dots

    圖3 熒光碳點和檸檬酸(CA)的紅外光譜Fig.3 Infrared spectra of carbon dots and citric acid(CA)

    2.5 熒光碳點的光穩(wěn)定性

    光穩(wěn)定性是評價熒光材料的一項重要指標(biāo)。圖4為熒光碳點的光穩(wěn)定性圖,從圖中可以看出,在405 nm光源激發(fā),激發(fā)光源激光功率為13%,HV值為700的條件下,經(jīng)過1 000 s照射后,熒光素的熒光強(qiáng)度猝滅為30%,而所合成熒光碳點的熒光強(qiáng)度猝滅僅為7%,說明檸檬酸熒光碳點具有較好的光穩(wěn)定性。該結(jié)果與已經(jīng)報道的草木灰[11]和天然糖類[22]制備的碳點的光穩(wěn)定結(jié)果相一致。

    2.6 熒光碳點的pH穩(wěn)定性

    圖5是pH值對熒光碳點的影響。與利用活性炭合成的熒光碳點不同[23],從圖5可以看出,所合成的熒光碳點在pH=2~11范圍內(nèi)具有良好的pH穩(wěn)定性。這種性質(zhì)與利用草木灰合成的熒光碳點相似[11],揭示出檸檬酸熒光碳點的激發(fā)輻射復(fù)合過程不受pH值變化的顯著影響,預(yù)示該種熒光碳點可能在較寬泛的pH范圍內(nèi)具有很好的應(yīng)用前景。

    圖4 熒光碳點的光穩(wěn)定性Fig.4 Photostability of carbon dots

    圖5 pH對熒光碳點的影響Fig.5 The effect of pH to carbon dots(CDs) B-R buffer(pH=2-11).cCDs=1.73 mg/mL.λex=310 nm,λem=415 nm.

    圖6 熒光碳點對Fe(Ⅲ)(700 μmol/L)的選擇性Fig.6 Selectivity of carbon dots towards Fe(Ⅲ)(700 μmol/L)

    2.7 熒光碳點對Fe(Ⅲ)的選擇性

    圖6是不同金屬離子對熒光碳點熒光強(qiáng)度的影響。結(jié)果表明,除了Cu(Ⅱ)和Fe(Ⅱ)會對碳點的熒光強(qiáng)度產(chǎn)生一定的影響以外,其他的金屬離子幾乎都不會使熒光碳點的熒光發(fā)生改變,而向熒光碳點中加入700 μmol/L Fe(Ⅲ) 后,熒光碳點的熒光強(qiáng)度幾乎完全被猝滅(熒光強(qiáng)度衰減80%),說明我們所合成的檸檬酸熒光碳點對Fe(Ⅲ) 具有較好的選擇性。熒光碳點熒光猝滅的原因,根據(jù)文獻(xiàn)的報道[24],可能是因為Fe(Ⅲ)可以與熒光碳點表面的羥基和羧基發(fā)生絡(luò)合反應(yīng),從而產(chǎn)生非特異性相互作用,猝滅了熒光碳點的熒光所致。

    2.8 線性范圍與檢出限

    考察了不同濃度的Fe(Ⅲ)對檸檬酸熒光碳點熒光強(qiáng)度的影響。圖7(A)是熒光滴定曲線,圖7(B)是相對應(yīng)的415 nm處的熒光強(qiáng)度與Fe(Ⅲ)濃度的關(guān)系。結(jié)果表明:隨著F(Ⅲ)濃度的增加,熒光碳點的熒光強(qiáng)度逐漸降低,在100~500 μmol/L范圍內(nèi),熒光碳點的熒光強(qiáng)度與Fe(Ⅲ)的濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,線性相關(guān)系數(shù)為0.99,線性方程為:I=-0.20cFe(Ⅲ)+177.93。其中,cFe(Ⅲ)為Fe(Ⅲ)的濃度(μmol/L),I為熒光碳點在415 nm處的熒光強(qiáng)度, 計算得到檢出限(3S0/k)為112.5 nmol/L。

    圖7 (A) 加入不同濃度的Fe(Ⅲ)后熒光碳點的熒光光譜;(B) I415與Fe(Ⅲ)濃度的關(guān)系,插圖為標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 (A) Fluorescence spectra of carbon dots with different concentrations of Fe(Ⅲ);(B) The correlation of Fe(Ⅲ) concentration and fluorescence intensity at 415 nm(I415),inset shows the standard curve

    2.9 回收率測定

    為了進(jìn)一步證明熒光碳點可以用來檢測Fe(Ⅲ),進(jìn)行了自來水和去離子水樣品的加入回收試驗。選取250和300 μmol/L兩個濃度點,結(jié)果如表2所示。從表中可以看出,無論在自來水還是去離子水中,所合成的熒光碳點對Fe(Ⅲ)的檢測都有較好回收率,且相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)都較小,說明這種方法具有較高的準(zhǔn)確度和精確度。

    表2 自來水和去離子水中Fe(Ⅲ)的回收率試驗結(jié)果(n=3)

    圖8 檸檬酸熒光碳點(CA-CDs)及對照組的B16-F10細(xì)胞成像圖。最右列是明場(Bright-field)和藍(lán)色激光(Ex=405 nm)及綠色激光(Ex=488 nm)激發(fā)下的疊加圖。標(biāo)尺為100 μmFig.8 Confocal fluorescence imaging of B16-F10 cells incubated with CA-CDs and medium(control).Right column is the overlay of bright-field and fluorescence image excited with 405 nm laser and 488 nm laser.Scale bar is 100 μm

    2.10 細(xì)胞成像

    熒光碳點因其優(yōu)良的理化性質(zhì)已經(jīng)被應(yīng)用于活細(xì)胞成像。如圖8所示,將檸檬酸熒光碳點應(yīng)用于小鼠黑色素瘤細(xì)胞的熒光成像。從圖中可以看出檸檬酸熒光碳點跟B16-F10細(xì)胞共孵育12 h后,在405 nm和488 nm激發(fā)光下,細(xì)胞呈現(xiàn)明亮的藍(lán)色或綠色熒光,而熒光信號主要分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)。相比較而言,未加入熒光碳點的對照組細(xì)胞在相同的拍攝條件下卻沒有發(fā)出任何熒光信號。說明所合成的檸檬酸熒光碳點成功地進(jìn)入到了細(xì)胞內(nèi),且有部分熒光碳點進(jìn)入到了細(xì)胞核內(nèi),同時可以發(fā)出多色熒光,實現(xiàn)了細(xì)胞的多色成像。

    3 結(jié)論

    本文以檸檬酸為原料,通過水熱法合成了水溶性的熒光碳點,并用來檢測水樣中的Fe(Ⅲ)及細(xì)胞成像。實驗結(jié)果表明,所合成的檸檬酸熒光碳點在310 nm處的量子產(chǎn)率為5.3%,粒徑主要分布在1.4~5.0 nm范圍內(nèi),平均粒徑為2.9 nm。紅外光譜和Zeta電位表明,在熒光碳點表面分布著-COOH和-OH等帶負(fù)電荷的基團(tuán)。由于表面的-COOH和-OH可以與Fe(Ⅲ)絡(luò)合,使得碳點的熒光猝滅,從而可以用于Fe(Ⅲ)的檢測。Fe(Ⅲ)濃度在100~500 μmol/L范圍內(nèi),熒光碳點的熒光強(qiáng)度I與Fe(Ⅲ)濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,檢出限為112.5 nmol/L。該方法操作簡單,選擇性好,靈敏度高,而且有望用于實際水樣中Fe(Ⅲ)的檢測。細(xì)胞成像結(jié)果顯示,所合成的檸檬酸熒光碳點可以同時進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核內(nèi),并在不同的激發(fā)光源下發(fā)出多色的熒光,說明檸檬酸熒光碳點可以作為熒光探針用于細(xì)胞標(biāo)記。

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