槲皮素-Al3+-十六烷基三甲基溴化銨體系熒光光度法測定總黃酮

張海容， 梁曉春， 陳金娥

(忻州師范學(xué)院生化分析技術(shù)研究所，山西忻州 034000)

槲皮素(Quercetin)屬黃酮醇類化合物，它廣泛存在于大自然的植物界，如高良姜、桑寄生、魚腥草、槐米及銀杏葉中[1]。槲皮素具有廣泛的生物活性和藥理作用，如抗病毒抗腫瘤、抗癌防癌、抗自由基抗氧化、抗抑郁心肌肥厚、抗血小板聚集、降血脂降血壓等[2，3]。槲皮素的熒光測定方法主要通過形成金屬配合物提高其熒光量子產(chǎn)率、改進(jìn)分析特性[4 - 6]。相關(guān)槲皮素-Al3+體系熒光測定報道比較少見[7，8]。姚本林等[7]用槲皮素-Al3+絡(luò)合物的熒光測定槐米提取物中槲皮素含量，線性范圍2.5×10-6～4.0×10-5mol/L；余琳等[8]在槲皮素-Al3+熒光體系加入膠束Tween-80增敏熒光，線性范圍4.0×10-6～1.4×10-4mol/L，檢出限2.0× 10-6mol/L，分析特性、靈敏度明顯不足。但在槲皮素-Al3+體系中加入十六烷基三甲基溴化銨(CTMAB)熒光增敏法測定槲皮素則未見報道。

本文用熒光法研究了影響槲皮素-Al3+-CTMAB三元體系的各種因素，分析特性顯著改善，與已經(jīng)報道的槲皮素-Al3+熒光體系相比，不僅操作簡便，線性范圍寬，且有較低的檢出限，方法用于銀杏葉片中黃酮含量的測定，結(jié)果滿意。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

RF-5301PC型熒光光度計(日本，島津公司);AB204-N型電子分析天平(Mettler-Toleclo Group);pHS-3TC型精密數(shù)顯酸度計(上海天達(dá)儀器有限公司)。

無水槲皮素(分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)儲備溶液：2.0×10-3mol/L;無水AlCl3(分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)溶液:2.0×10-3mol/L；十二烷基磺酸鈉(SDS，分析純，中國上海試劑廠)溶液：1.0×10-1mol/L;十六烷基三甲基溴化銨(CTMAB，分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)溶液：1.0×10-2mol/L;聚氧乙烯月桂醚(Brij-35，Alfa Aesar公司)溶液：1.0×10-5mol/L；β-環(huán)糊精(β-CD，生化試劑，北京奧博生物技術(shù)責(zé)任有限公司)；三酸緩沖溶液按文獻(xiàn)方法[9]配制;其余試劑皆為分析純。實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 實驗方法

1.2.1試樣制備取不同銀杏葉片(1#為華鈉大藥廠生產(chǎn)；2#為涿州東樂制藥有限公司生產(chǎn))各2片，分別用95%乙醇在100 mL的錐形瓶中溶解，并用超聲波提取，設(shè)定溫度為25 ℃，功率為100 W，時間為30 min。最后，轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中，用95%乙醇定容。用移液管分別移取樣品1#、樣品2#上層清液2 mL于100 mL容量瓶中，并用95%乙醇定容，備用。

1.2.2槲皮素測定方法在比色管中依次加入1 mL樣品溶液，1 mL Al3+標(biāo)準(zhǔn)溶液，1 mL的CTMAB溶液，2 mL的三酸緩沖液，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，室溫靜置15 min后，測定熒光強(qiáng)度,激發(fā)和發(fā)射狹縫均為10 nm。

2 結(jié)果與討論

圖1 激發(fā)和發(fā)射的光譜圖Fig.1 Excitation and emission spectra cquercetin:2.0×10-5 mol/L; cAl3+:2.0×10-4 mol/L.1.quercetin;2.Al3+;3.quercetin-Al3+;4.quercetin-Al3+-CTMAB.

2.1 槲皮素-Al3+-CTMAB光譜特征

實驗分別測定了槲皮素、Al3+、槲皮素-Al3+及其槲皮素-Al3+-CTMAB的熒光光譜，發(fā)現(xiàn)槲皮素或Al3+單獨存在時兩者均無熒光發(fā)射；形成槲皮素-Al3+配合物后，在λex/λem=450/539 nm處出現(xiàn)熒光激發(fā)和發(fā)射峰；當(dāng)加入一定量CTMAB時，熒光強(qiáng)度顯著增大，結(jié)果如圖1所示。

2.2 不同介質(zhì)對槲皮素-Al3+熒光強(qiáng)度的影響

實驗分別考察了SDS、Brij-35、CTMAB三種不同類型的表面活性劑及β-CD對該體系熒光強(qiáng)度的影響。 實驗表明，在酸性條件下，CTMAB對槲皮素-Al3+體系的增敏作用最強(qiáng)，因此本文選擇陽離子表面活性劑CTMAB為介質(zhì)。

2.3 CTMAB濃度對體系熒光強(qiáng)度的影響

在酸性介質(zhì)(pH=6.10)中，固定槲皮素濃度為2.0×10-5mol/L、Al3+濃度為2.0×10-4mol/L，改變CTMAB濃度并測定體系的熒光強(qiáng)度，結(jié)果如圖2所示。CTMAB超過1.0×10-3mol/L時的熒光強(qiáng)度不再增大，故選擇CTMAB的濃度為1.0×10-3mol/L。

2.4 pH的選擇

在pH=2.97～12.10范圍內(nèi)測定槲皮素-Al3+-CTMAB體系的熒光強(qiáng)度。如圖3所示，在pH=4.01～7.03范圍內(nèi)熒光強(qiáng)度較強(qiáng)且穩(wěn)定不變，所以選擇pH=6.10的三酸緩沖溶液控制體系的酸度。

圖2 CTMAB濃度對熒光強(qiáng)度的影響Fig.2 Effect of CTMAB concentration on fluorescence intensity

圖3 pH對熒光強(qiáng)度的影響Fig.3 Effect of pH on fluorescence intensity

圖4 Al3+濃度對熒光強(qiáng)度的影響Fig.4 Effect of Al3+concentration on fluorescence intensity

2.5 Al3+濃度的選擇

在上述選定最佳條件下，加入不同濃度的Al3+后測定體系的熒光強(qiáng)度。如圖4所示，Al3+濃度為2.0×10-4mol/L時熒光強(qiáng)度最大且恒定不變，故選擇2.0×10-4mol/L為最佳濃度。

2.6 靜置時間的選擇

實驗研究了靜置時間對體系熒光強(qiáng)度的影響。在溶液配制好后每隔10 min測定一次，結(jié)果表明，在靜置70 min時間范圍內(nèi)熒光強(qiáng)度保持穩(wěn)定不變，足以完成各種熒光性質(zhì)測定。

2.7 分析特征

在最佳實驗條件下，該體系的熒光強(qiáng)度的對數(shù)lgIF與槲皮素濃度的對數(shù)lgc呈良好的線性關(guān)系，線性范圍在4.0×10-8～1.0×10-5mol/L之間,線性回歸方程式為:lgIF=0.5744lgc+5.0995,相關(guān)系數(shù)R2=0.9969,以3σ/K法得到檢出限為1.24×10-8mol/L。

2.8 實際樣品分析及回收率實驗

按實驗方法操作，分別測定1#和2#樣品中黃酮的含量，結(jié)果見表1。同時進(jìn)行了回收率實驗，結(jié)果見表2。

表1 樣品測定結(jié)果

表2 樣品回收率的測定結(jié)果

3 結(jié)論

建立了槲皮素-Al3+-CTMAB熒光體系測定樣品總黃酮的新方法。在最佳實驗條件下，測定線性范圍為4.0×10-8～1.0×10-5mol/L，檢出限為1.24×10-8mol/L。