甲巰咪唑的電化學(xué)行為及其與DNA相互作用的研究

杜芳靜， 羅賢文， 李曉霞*

(延安大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，陜西延安 716000)

甲巰咪唑(Thimazole,TMZ)是臨床上治療人甲狀腺機能亢進癥的常用藥物，但過量服用會引發(fā)腎炎、肝硬化、皮膚過敏和咽炎發(fā)燒等[1]。因此，建立簡單、快速、靈敏測定TMZ的方法十分重要。目前測定TMZ的方法有可見分光光度法[2，3]、萃取浮選法[4]、高效液相色譜法[5，6]及電化學(xué)分析法[7 - 9]等。采用電化學(xué)分析法已分別研究了TMZ在聚四氨基鈷酞菁膜修飾玻碳電極上、血紅素修飾碳糊電極上及酞菁鈷修飾碳糊電極上的電化學(xué)行為。碳納米管因其良好的電化學(xué)性能被廣泛用于藥物、蛋白和DNA等的分析中。

生物體的正常生命活動及突變、癌變等異常生命活動均與DNA密切相關(guān)。藥物分子與DNA通過各種模式的相互作用方式，影響到基因的調(diào)控和表達(dá)，因此，研究藥物分子與DNA的相互作用具有實際意義[10]。本文研究了TMZ在多壁碳納米管修飾玻碳電極(MWNTs/GCE)上的電化學(xué)行為，建立了測定TMZ的電化學(xué)分析新方法。采用線性掃描伏安法(LSV)和紫外光譜法研究了TMZ與DNA之間的相互作用，計算了兩者的結(jié)合比及結(jié)合常數(shù)。所建立的方法簡單、快速、靈敏，可望用于實際藥物的分析檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CHI660E電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)，三電極系統(tǒng)：工作電極為多壁碳納米管/玻碳電極(MWNT/GCE)或玻碳電極(GCE)，參比電極為飽和甘汞電極(SCE)，對電極為鉑絲。紫外-可見分光光度計(日本，島津公司)。

多壁碳納米管(MWNTs，純度>95%，深圳納米港)。甲巰咪唑(TMZ)標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：準(zhǔn)確稱取TMZ標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所)0.0571 g，溶于水，定容于100 mL棕色容量瓶中，濃度為5.0 mmol/L，于陰冷處避光保存。鯡魚精DNA(hsDNA，上海伯奧)，其純度計算參考文獻(xiàn)方法[10]。

1.2 實驗方法

GCE的預(yù)處理和MWNTs的酸化處理分別參考文獻(xiàn)方法[11]。稱取3 mg處理好的MWNTs，加入3 mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，超聲分散2 h形成懸濁液。吸取5 μL 1 mg/mL懸浮液滴涂在處理好的GCE上，晾干即得MWNTs/GCE。

先將MWNTs/GCE在pH=7.0的磷酸鹽緩沖液(PBS)中進行循環(huán)伏安(CV)掃描(0～0.6 V)，直至曲線穩(wěn)定為止。然后置于不同濃度的TMZ溶液中，記錄0～0.6 V范圍的CV曲線和LSV曲線。在研究TMZ與DNA的相互作用時， 固定TMZ的濃度為50 μmol/L，加入不同濃度的DNA進行分析。最后固定DNA的濃度為10 μmol/L，加入不同濃度的TMZ，進行結(jié)合比、結(jié)合常數(shù)測定。紫外光譜的測定參照文獻(xiàn)方法[12]。

2 結(jié)果與討論

2.1 TMZ在MWNT/GCE上的電化學(xué)行為及其分析測定

2.1.1TMZ的電化學(xué)行為圖1為GCE和MWNTs/GCE在PBS(pH=7.0)和TMZ溶液中的循環(huán)伏安圖。由圖中曲線a和d可以看出，在電位0～0.6 V范圍，GCE和MWNTs/GCE在PBS中未發(fā)現(xiàn)任何峰。GCE分別在300 μmol/L(曲線b)和500 μmol/L(曲線c)TMZ溶液中掃描時，在0.31 V處有一不可逆氧化峰，且隨TMZ濃度的增大峰電流變大。 MWNTs/GCE分別在300 μmol/L(曲線e)和500 μmol/L(曲線f)TMZ溶液中掃描時，在0.29 V處有一不可逆氧化峰。比較曲線e、f和b、c發(fā)現(xiàn)，TMZ在MWNT/GCE上的氧化峰較裸GCE上負(fù)移100 mV，氧化峰電流增大約4倍。分別將MWNTs/GCE和GCE進行循環(huán)伏安和電化學(xué)阻抗表征，結(jié)果表明，MWNTs/GCE在[Fe(CN)6]3-/4-溶液中的電位差△E和電化學(xué)阻抗Ret值，較GCE明顯降低，表明修飾電極能提高電子的傳遞。根據(jù)Randles-Sevcik方程，測定出MWNTs/GCE有效面積是GCE的2.1倍，說明修飾MWNTs明顯增加了電極的有效面積，使得電極的導(dǎo)電性增強，TMZ在修飾電極上更易被催化氧化。

2.1.2多壁碳納米管滴涂量的選擇MWNTs/GCE上MWNTs的滴涂量影響待測物質(zhì)的電化學(xué)響應(yīng)。實驗考察了MWNTs的滴涂量在2～10 μL之間對電化學(xué)信號的影響。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)瓮苛繛? μL時，TMZ的氧化峰電流達(dá)到最大。繼續(xù)增大滴涂量，TMZ峰電流略有減小。因此，實驗中選擇8 μL為最佳滴涂量。

2.1.3底液及pH的選擇研究了TMZ在B-R緩沖溶液、PBS、NaOH溶液等不同底液中的電化學(xué)行為。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TMZ在PBS中峰形最好。因此，本實驗選擇PBS為底液?？疾霻MZ在pH=5.8～8.0的PBS中的LSV圖(圖2)，發(fā)現(xiàn)TMZ的峰電位隨pH的增大而逐漸負(fù)移，峰電流隨pH的變化，分別在pH為6.0 和7.0 時出現(xiàn)了兩個峰電流極大值，可能此條件下TMZ開始大量以Rs-形式存在，更易發(fā)生氧化，因而峰電流突然增大，這一結(jié)果與文獻(xiàn)報道[8]一致。實驗選擇pH=7.0的PBS為底液。同時發(fā)現(xiàn)TMZ的峰電位隨著pH的增大負(fù)移，說明有質(zhì)子參與TMZ的氧化反應(yīng)。TMZ的峰電位E與pH呈良好的線性關(guān)系，線性方程為:Epa=-33.38pH+555.31，r=0.9951，斜率為33.38 mV/pH。將測定斜率值33.38 mV/pH 與理論斜率59.2 mV/pH相比較可知，TMZ的氧化反應(yīng)是等電子對應(yīng)等質(zhì)子的反應(yīng)[12]。

圖1 甲巰咪唑在裸GCE(a、b、c)和MWNTs/GCE(d、e、f)上的循環(huán)伏安圖Fig.1 Cyclic voltammograms of TMZ on bare GCE(a，b，c) and MWNT/GCE (d，e，f) in pH=7.0 PBSa,d:cTMZ =0;b,e:cTMZ=300 μmol/L;c,f:cTMZ=500 μmol/L;scan rate:100 mV/s.

圖2 不同pH值下TMZ的線性掃描伏安圖Fig.2 Linear sweep voltammograms of 100 μmol/L TMZ obtained in different pH buffer solutiona-h:pH:5.8,6.0,6.2,6.6,7.0,7.4,7.8,8.0.

圖3 不同掃速下TMZ在MWNTs/GCE上的循環(huán)伏安圖；內(nèi)插圖為峰電流(a)和峰電位與掃速的關(guān)系曲線Fig.3 Cyclic voltammograms of 300 μmol/L TMZ obtained in PBS (pH=7.0) at different scan rates from 50～400 mV/s at the MWNTs/GCE;Insert:the linear relationship with scam rate of peak currents(a) and peak potential(b)

2.1.4掃速的影響考察了掃描速度對TMZ峰電流及峰電位的影響。從圖3可以看出，峰電流和峰電位均隨掃速的增加而增大。掃速v在50～400 mV/s范圍，TMZ的峰電位Ep與lnv1/2呈線性關(guān)系，線性方程為：Ep(V)=0.126+0.0138lnv1/2，r=0.9954。TMZ的峰電流Ipa與v1/2呈良好的線性關(guān)系，其線性方程為：Ipa(μA)=2.57v1/2-11.05，r=0.9992，表明TMZ在MWNT/GCE上的電化學(xué)氧化過程是受擴散控制的電極反應(yīng)過程，計算出修飾電極在TMZ溶液中的擴散系數(shù)為9.12×10-8cm2/s。根據(jù)電化學(xué)動力學(xué)原理[13]，以lgIpa對lgc作關(guān)系曲線，線性方程為：lgIpa=1.027lgc-0.6587(r=0.9950)。斜率為1.027，接近1，表明TMZ在MWNT/GCE上的氧化反應(yīng)為準(zhǔn)一級反應(yīng)。實驗中選擇掃速為100 mV/s。

2.1.5工作曲線和檢出限在優(yōu)化實驗條件下，利用MWNTs/GCE對TMZ進行測定。圖4為不同濃度的TMZ在MWNTs/GCE上的LSV圖。TMZ的氧化電流Ipa與其濃度c在3.0～100 μmol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性方程為：Ipa(μA) =-0.1019+0.2501c(mol/L)，r=0.9988，檢出限(S/N=3)為1.0 μmol/L。同一支修飾電極對30 μmol/L的TMZ平行測定11次，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.3%，表明該修飾電極具有良好的重現(xiàn)性。

2.2 TMZ與hsDNA相互作用的研究

基于TMZ的電化學(xué)行為，研究了TMZ與DNA的相互作用。圖5為MWNT/GCE在TMZ溶液及加入了不同濃度DNA溶液中的LSV圖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在0.1～0.6 V范圍內(nèi)TMZ有一不可逆氧化峰，加入DNA后未見新峰，但是TMZ的峰電流明顯降低，峰電位略有正移(Ep=0.335 mV→Ep=0.336 mV,△E=1 mV)。在50～200 mV/s掃速范圍內(nèi)，研究掃速與峰電流的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)存在DNA時，峰電流與掃速的平方根成正比，表明該電極過程也受擴散控制。 根據(jù)掃速與TMZ-DNA峰電流的關(guān)系：Ipa(μA)=0.22v1/2-0.69(v,mV/s)，計算出MWNTs/GCE在TMZ-DNA溶液中的擴散系數(shù)為2.67×10-8cm2/s。與TMZ溶液相比(9.12×10-8cm2/s)，TMZ-DNA溶液中的擴散系數(shù)減小，表明TMZ與DNA發(fā)生了嵌插作用，形成了TMZ-DNA復(fù)合物，由于復(fù)合物的相對分子質(zhì)量較大，引起擴散系數(shù)減小，峰電流降低[14]。

測定了DNA、TMZ及TMZ-DNA體系在200～400 nm波長范圍的紫外吸收光譜(圖6)，260 nm 處有DNA的吸收峰(曲線a)，TMZ的吸收峰波長為251 nm(曲線b)。加入DNA 后TMZ的波長略有紅移(λ=252 nm)且吸光度值增加，為紅移增色效應(yīng)。根據(jù)Long理論，增色效應(yīng)、紅移現(xiàn)象是該物質(zhì)與DNA發(fā)生了嵌插作用。說明TMZ嵌插入到DNA雙鏈之間，引起堿基之間的疏水作用力和范德華力發(fā)生改變，影響了DNA構(gòu)象與結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，從而引起紫外光譜紅移增色[15]。此結(jié)論與本實驗電化學(xué)研究結(jié)果一致。

圖4 TMZ在MWNT/GCE上的線性掃描伏安圖Fig.4 Linear sweep voltammograms of TMZ at MWNT/GCE in PBScTMZ:a.3 μmol/L;b.5 μmol/L;c.8 μmol/L;d.10 μmol/L;e.30 μmol/L;f.50 μmol/L;g.80 μmol/L;h.100 μmol/L.Inser:the resulting calibration curve.

圖5 TMZ與DNA作用的線性掃描伏圖Fig.5 Linear sweep voltammograms of interaction between TMZ and herring sperm DNAcTMZ=50.0 μmol/L;a.cDNA=0;b.cDNA=5.0 μmol/L;c.cDNA=10.0 μmol/L.

實驗中利用LSV法考察并計算了TMZ與hsDNA的結(jié)合數(shù)m和結(jié)合常數(shù)b[16，17]。固定DNA濃度為10 mmol/L，改變TMZ濃度得到峰電流的變化曲線，圖7中曲線a，b分別為加入DNA前后的峰電流Ip與TMZ濃度的關(guān)系曲線；曲線c為a和b的峰電流差值△Ip與TMZ濃度的關(guān)系曲線。假定TMZ與DNA只形成一種簡單的締合物DNA-mTMZ，則反應(yīng)式為：

經(jīng)推導(dǎo)可得到：

lg[△Ip/(△Ipmax-△Ip)] =lgβ+mlgcTMZ

式中,△Ipmax為加入DNA前后TMZ峰電流差值(△Ip)的最大值(△Ipmax=2.52 mA)。

若TMZ和DNA只形成單一締合物，則lg[△Ip/(△Ipmax-△Ip)]～lgcTMZ的關(guān)系曲線應(yīng)為一直線。如圖7，線性方程為：lg[△Ip/(△Ipmax-△Ip)]=6.997+1.54lgcTMZ(c,mol/L)，r=0.9968；由曲線斜率求得結(jié)合數(shù)m≈2，由截距求得b=9.93×106L/mol，表明DNA與TMZ形成1∶2型締合物。

圖6 紫外吸收光譜 Fig.6 UV absorption spectra PBS(pH=7.0);a.cDNA=50.0 μmol/L;b.cTMZ=50.0 μmol/L; c.cTMZ=50.0 μmol/L.cDNA=50.0 μmol/L.

圖7 DNA加入前(a)與加入后(b)Ip與cTMZ及△Ip與cTMZ(c)的關(guān)系曲線圖Fig.7 The relationship of Ip with cTMZ before (a) and after (b) the addition of DNA and of △Ip with cTMZ(c)

3 結(jié)論

本文基于多壁碳納米管修飾玻碳電極研究了TMZ的電化學(xué)行為，并建立了快速靈敏測定TMZ的電化學(xué)分析新方法，對TMZ與DNA的相互作用進行了探索。與裸玻碳電極相比，多壁碳納米管修飾電極上TMZ的峰電流顯著提高。hsDNA與TMZ發(fā)生嵌插作用，結(jié)合形成1∶2型的嵌合物，其結(jié)合常數(shù)β為9.93×106L/mol。