以金納米溶膠為中間體同時(shí)制備陽(yáng)離子及反相模式整體柱

王 雪， 高 超， 楊棟磊， 楊長(zhǎng)龍

(齊齊哈爾大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161006)

液相色譜自問世以來(lái)，色譜柱填充材料經(jīng)歷了4個(gè)發(fā)展階段，包括從形狀不規(guī)則的填充顆粒到球形顆粒、從大的填充顆粒到小的顆粒、從不純的填充材料到高純的球形硅膠顆粒以及目前的整體柱，一直在向著提高柱效和實(shí)現(xiàn)快速分離的方向發(fā)展。整體柱的制備及應(yīng)用在近年來(lái)也得到了快速的發(fā)展，層出不窮的新型整體柱已被廣泛用于色譜高效分離分析、固相萃取及酶反應(yīng)器等方面。整體柱與傳統(tǒng)的填充柱相比，具有分辨率高、制備成本低、使用壽命長(zhǎng)、穩(wěn)定性好、吸附容量高、功能修飾方法簡(jiǎn)便等優(yōu)越的性能。根據(jù)整體柱固有的諸多優(yōu)點(diǎn)，通過合成不同種類的色譜固定相[1 - 4]及在固定相上進(jìn)行不同功能的衍生，使其被廣泛應(yīng)用于各種生物分離分析[5 - 7]。目前，通過采取不同的實(shí)驗(yàn)方法和引入不同的化學(xué)基團(tuán)來(lái)修飾整體柱表面已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，例如：巰基化合物在金表面能進(jìn)行自組裝和交換的性質(zhì)已被廣泛用于各種載體的修飾[8 - 10]。

金納米粒子(AuNPs)具有獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)( 表面等離子體吸收和共振光散射)，以及特殊的穩(wěn)定性、小尺寸效應(yīng)、量子效應(yīng)、表面效應(yīng)，易進(jìn)行表面修飾且生物相容性良好[11]等優(yōu)點(diǎn)，在生物分析和生物醫(yī)藥等領(lǐng)域中應(yīng)用廣泛[12，13]。而在色譜領(lǐng)域中，金納米粒子(AuNPs)改性的色譜柱在分離生物大分子中廣受學(xué)者的關(guān)注。鑒于AuNPs與巰基基團(tuán)(-SH)之間具有很高的親和力并且易共價(jià)鍵合的特點(diǎn)，本文以AuNPs為中間體制備了表面具有陽(yáng)離子交換和疏水作用兩種模式的整體柱，并用于三種多肽混合物的分離。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀(大連依利特儀器有限公司)，由P200型高壓恒流泵、UV200型紫外可變波長(zhǎng)檢測(cè)器以及Echrom2006色譜工作站組成。

環(huán)形中心移熱外部式反應(yīng)器(自制)；HH-601型超級(jí)恒溫?zé)崴?江蘇榮華儀器有限公司)；AS3120超聲波清洗器，DHG-9035A型電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；HLB1040型平流泵(東臺(tái)市燕山儀表總廠);PB-10酸度計(jì)。

甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)、二甲基丙烯酸乙二酯(EDMA)、過氧化苯甲酰(BPO)，均為Acros Organics公司(美國(guó))產(chǎn)品；金納米溶膠(10 nm，英國(guó)BBInternational公司)；十二醇，半胱胺、十八烷硫醇、2-巰乙基磺酸，環(huán)己醇(分析純)，乙醇(分析純)，磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉(分析純)，肌紅蛋白、核糖核酸酶、細(xì)胞色素等試劑均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1整體柱基質(zhì)的制備[14](1)將引發(fā)劑BPO(1wt%單體體積)溶于40%的單體混合物(含60% GMA，40% EDMA)中，緩慢加入60%的制孔劑混合物(含90% 環(huán)己醇，10%十二醇)，混合物的總體積為50 mL。將配制的聚合混合物密封，在-18 ℃下保存12 h；(2)組裝環(huán)形反應(yīng)器，并將反應(yīng)器垂直浸入到恒溫水浴中。(3)當(dāng)恒溫水浴達(dá)到所設(shè)定的溫度55 ℃時(shí)，將所配制的聚合混合物以一定流速緩慢加入到已恒溫的反應(yīng)器中。(4)將反應(yīng)器密封恒溫24 h。(5)制孔，調(diào)節(jié)柱長(zhǎng)21 mm，裝入腔體，乙醇萃取。(6)組裝色譜柱部件，用乙醇溶液沖洗。

1.2.2GMA-EDMA-陽(yáng)離子交換整體柱的制備用HLB1040型平流泵，將所配制的0.25 mol/L半胱胺溶液以2 mL/min的流速在徑向整體柱內(nèi)循環(huán)約24 h，然后用去離子水沖洗柱子直至流出液為中性。在同樣條件下，向GMA-EDMA-SH柱中通入AuNPs 約24 h，然后用去離子水沖洗柱子。在GMA-AuNPs柱中循環(huán)2-巰乙基磺酸鈉約48 h，得到離子交換柱GMA-AuNPs-SCX，然后用水和乙腈沖洗柱子。

1.2.3GMA-EDMA-C18整體柱的制備向GMA-AuNPs-SCX中通入正十八烷硫醇，循環(huán)48 h左右。 然后用水和乙腈沖洗柱子，得到反相色譜柱GMA-AuNPs-C18。

2 結(jié)果與討論

2.1 GMA-EDMA整體柱的形貌及結(jié)構(gòu)表征

圖1 環(huán)型GMA-EDMA整體固定相(a)及其承載腔體(b)Fig.1 Annular GMA-EDMA monolithic stationary phases(a) and housing(b)

圖1顯示了該有機(jī)聚合整體固定相的外在形貌以及承載該柱子的腔體，該整體柱基質(zhì)的孔體積大約24 mL，屬于徑向流動(dòng)的色譜柱。在操作過程中，增加了流動(dòng)相與固定相的接觸面積，使單次操作的上樣量提高，在高流速下可以快速完成蛋白質(zhì)混合物分離。

對(duì)GMA-EDMA整體基質(zhì)的不同部位(外、中、內(nèi))做了掃描電鏡(SEM)測(cè)試。從圖2中看出不同部位的整體材料的微觀形貌基本相同，表明所制備的大體積整體柱的結(jié)構(gòu)均一，內(nèi)部孔道相互貫通，形成一個(gè)網(wǎng)狀流動(dòng)通道，是一種快速有效分離大分子化合物的有機(jī)聚合整體柱。

圖2 GMA-EDMA整體基質(zhì)外部(a)、中部(b)、內(nèi)部(c)的掃描電鏡圖Fig.2 SEM image of outer (a)，middle (b)，center (c) of GMA-EDMA monolith

圖3 GMA-EDMA的共聚物與半胱胺的反應(yīng)Fig.3 Reaction of poly(glycidyl methacrylate-co-ethylene dimetharcylate) with cysteamine

2.2 整體基質(zhì)和半胱胺修飾后的整體柱的紅外表征

紅外(IR)光譜表征手段可以觀察鍵的振動(dòng)并對(duì)存在的官能團(tuán)提供證據(jù)。如圖3所示，半胱胺與GMA-EDMA整體基質(zhì)的反應(yīng)實(shí)質(zhì)就是環(huán)氧乙環(huán)的開環(huán)反應(yīng)。從圖4中可以看到GMA-EDMA基質(zhì)中主要官能團(tuán)的振動(dòng)吸收峰。在圖5中可以看到，在3 400 cm-1左右出現(xiàn)一個(gè)比較寬的特征吸收峰，而O-H、N-H的吸收特征峰其中心大約在3 300 cm-1處，表明-SH官能團(tuán)修飾成功。

2.3 色譜性能的測(cè)試

2.3.1GMA-EDMA-SCX分離多肽混合物2-巰乙基磺酸鈉在GMA-EDMA-AuNPs上修飾后，得到了陽(yáng)離子色譜柱GMA-EDMA-SCX，在離子交換模式中，基于三種混合物質(zhì)的pI值不同，采用氯化鈉溶液的梯度洗脫，快速分離三種多肽混合物(圖6)。

圖4 GMA-EDMA整體基質(zhì)的紅外光譜圖Fig.4 IR spectrum of GMA-EDMA monolith

圖5 GMA-EDMA-SH整體基質(zhì)的紅外光譜圖Fig.5 IR spectrum of GMA-EDMA-SH monolith

2.3.2GMA-EDMA-C18分離多肽的混合物通過在GMA-EDMA-SCX整體基質(zhì)表面上修飾正十八烷硫醇，使得整體基質(zhì)表面上的2-巰乙基磺酸鈉被正十八烷硫醇替換，得到了反向色譜柱GMA-EDMA-C18，用于分離三種多肽物質(zhì)的混合物(圖7)。

圖6 GMA-EDMA-SCX陽(yáng)離子色譜分離的三種蛋白混合物Fig.6 Chromatogram of three proteins by GMA-EDMA-SCX columnColumn:42×21 mm i.d.column;mobile phase:A:0.05 mol/L phosphate buffer,pH=8.0; mobile phase B:2 mol/L sodium chloride in mobile phase A; gradient conditions:in 6 min B from 0 to 60% in A; flow rate：5 mL/min; injection volume：100 μL;UV detection:210 nm.peaks:myoglobin(1),ribonuclease A(2),and cytochrome c(3).

圖7 GMA-EDMA-C18反相色譜分離三種蛋白混合物Fig.7 Chromatogram of three proteins by GMA-EDMA-C18 columnColumn:42×21 mm i.d.column,mobile phase：A：0.2% aqueous formic acid.mobile phase B：0.2% formic acid in acetonitrile；gradient conditions：in 6 min B from 0 to 60% in A;flow rate：5 mL/min；injection volume：100 μL；UV detection：210 nm.peaks:ribonuclease A(1),cytochrome c(2),myoglobin(3).

如圖6以及圖7所示，可以看出在同一柱子下以AuNPs為中間體，改變整體基質(zhì)的表面化學(xué)性質(zhì)可以得到不同模式的色譜柱，經(jīng)AuNPs修飾后的整體柱并沒有影響它的通透性，在整個(gè)修飾過程中始終沒有壓強(qiáng)變化。

3 結(jié)論

提出了以AuNPs為中間體制備有機(jī)聚合整體柱的新方法，使原來(lái)單一的整體柱可以被用于不同的分離模式，避免了柱子的重復(fù)合成，簡(jiǎn)化了色譜柱的制備，增加了整體柱的應(yīng)用范圍，具有廣闊應(yīng)用前景。