高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定茶湯中7種苯甲酰脲類農(nóng)藥殘留

薛芝敏， 付鳳富

(1.福建出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，福建福州 350001； 2.福州大學(xué)食品安全分析與檢測教育部重點實驗室，福建福州 3501116)

苯甲酰脲類農(nóng)藥具有低劑量、低環(huán)境持久性、易生物降解和對哺乳動物低毒等特點，越來越多地被用于作物病蟲害的控制[1，2]。苯甲酰脲類農(nóng)藥雖然對哺乳動物的毒性相對較低，但植物中的苯甲酰脲類農(nóng)藥殘留仍可通過食物鏈對人體健康造成傷害。美國環(huán)境保護署(EPA)已將一些苯甲酰脲類農(nóng)藥歸類為毒性Ⅲ級或Ⅳ級的中等毒性物質(zhì)[3]。目前，許多國家都已規(guī)定了針對茶葉的有關(guān)苯甲酰脲類農(nóng)藥的最大殘留限量值(MRL)。我國有關(guān)茶葉中苯甲酰脲類農(nóng)藥殘留的研究報道還較少，但國家標(biāo)準(zhǔn)(GB 2763-2012)規(guī)定茶葉中除蟲脲的最大殘留限量為20 mg/kg。目前，檢測機構(gòu)主要通過檢測成品茶葉中的農(nóng)藥殘留。但茶葉是一種飲料，許多研究表明，茶湯中農(nóng)藥殘留不僅取決于成品茶中的農(nóng)藥殘留，也取決于農(nóng)藥的溶出特性[4，5]。因此，研究同時檢測茶湯中多種苯甲酰脲類農(nóng)藥的高靈敏和快速分析方法具有十分重要的意義。

迄今為止，有關(guān)苯甲酰脲類農(nóng)藥的分析檢測方法主要有高效液相色譜法和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，并已被廣泛應(yīng)用于食品中苯甲酰脲類農(nóng)藥的測定[6 - 12]。然而，有關(guān)茶湯中多種苯甲酰脲類農(nóng)藥的同時檢測的研究報道還比較少見[4，5]。本研究中，我們開發(fā)了一種基于高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)，結(jié)合溶劑提取和固相萃取，同時分析檢測茶湯中氟啶脲、除蟲脲、啶蜱脲、伏蟲隆、氟鈴脲、氟蟲脲和殺鈴脲7種苯甲酰脲類農(nóng)藥的分析方法，以期為更加準(zhǔn)確地評價茶葉的消費安全提供方法支持。

1 實驗部分

1.1 儀器及工作條件

安捷倫1290/6410 HPLC-MS/MS儀(美國，安捷公司)，配置安捷倫Zorbax SB-C18高效色譜柱。流動相為2 mmol/L乙酸銨溶液和甲醇，按下面程序進行梯度洗脫：70%(V/V)的甲醇在7 min內(nèi)線性增加到100%的甲醇，然后在0.5 min內(nèi)線性降至70%的甲醇并保持3 min。流動相的流速為0.3 mL/min，柱溫為35 ℃。質(zhì)譜儀配備電噴霧離子源(ESI)，采用負離子掃描模式，多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)。離子源電壓為±4 kV，離子源溫度為300 ℃，霧化壓力為50 psi，干燥氣體(N2)流量為8.0 L/min，干燥氣的溫度為350 ℃，采用完整MS2掃描方式在m/z100～550范圍內(nèi)進行掃描。用于每種苯甲酰脲類農(nóng)藥檢測的離子以及其分子式和分子量如表1所示。

表1 7種苯甲酰脲類農(nóng)藥的分子式、母體離子和用于HPLC-MS/MS測定的選擇性離子

1.2 試劑

7種苯甲酰脲類農(nóng)藥氟啶脲(CHLO)，除蟲脲(DIFL)，啶蜱脲(FLUA)，氟蟲脲(FLUF)，氟鈴脲(HEXA)，伏蟲隆(TEFL)和殺鈴脲(TRIF)標(biāo)準(zhǔn)品均為德國Dr.Ehrenstorfer公司生產(chǎn)，購自北京振翔工貿(mào)有限責(zé)任公司。用甲醇稀釋、溶解以上標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，制備100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，在-5 ℃保存并在3個月內(nèi)使用。乙酸銨(色譜級)為美國ROE公司生產(chǎn)，甲醇(色譜級)為美國天地公司生產(chǎn)。弗羅里硅土(60～100目)購自美國SUPELCO公司，活性炭(36～50目)購自中國國藥公司。實驗中所用的水為Mili-Q水(18.2 MΩ·cm)。

1.3 實驗方法

實驗中所測定的茶葉由福建茶檢中心提供，已確認含有苯甲酰脲類農(nóng)藥殘留。茶葉的沖泡方法與日常消費者的習(xí)慣泡茶方法相同。取約5 g的茶葉樣品，加入開水110 mL浸泡2 min后，分離出茶湯溶液(第1次茶湯)。殘留茶葉再重復(fù)用110 mL沸水沖泡2次，每次沖泡的時間分別為3 min和5 min，得到第2次茶湯和第3次茶湯。茶湯冷卻后，用于7種苯甲酰脲類農(nóng)藥的檢測。

首先，移取50 mL的茶湯到分液漏斗，加入15 mL二氯甲烷，充分振蕩萃取5 min，靜置后分離出有機相溶液。殘留的茶湯溶液用相同的方法再重復(fù)萃取1次，2次萃取的有機相溶液合并獲得總萃取溶液?？傒腿∪芤涸?5 ℃水浴條件下，用氮吹儀濃縮至約1 mL。然后，把濃縮后的二氯甲烷萃取液移入固相萃取小柱(6×1 cm i.d.填有0.50 g弗羅里硅土和0.05 g活性炭，預(yù)先用10 mL 25%的乙腈和75%甲苯混合溶液淋洗)。接著，用20 mL的乙腈和甲苯混合溶劑(1∶3,V/V)洗脫吸附在固相萃取小柱上的苯甲酰脲類農(nóng)藥，并在45 ℃水浴條件下用氮吹儀將洗脫液吹至近干，殘留物重新用1 mL甲醇再次溶解，最終的甲醇溶液用于HPLC-MS/MS分析。同時，在另一組茶湯樣品中加入終濃度為1 ng/mL的7種苯甲酰脲類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，然后按上述同樣的方法進行萃取、預(yù)富集和測定以獲得回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 茶湯中7種苯甲酰脲類農(nóng)藥殘留的提取和前處理優(yōu)化

2.1.1提取溶劑的選擇考慮到本文研究的7種苯甲酰脲類農(nóng)藥的溶解性質(zhì)和提取溶劑的溶解度，二氯甲烷和乙酸乙酯被嘗試用于提取茶湯中的7種苯甲酰脲類農(nóng)藥。實驗結(jié)果表明，二氯甲烷能有效提取全部7種苯甲酰脲類農(nóng)藥。因此，本文采用二氯甲烷作為提取溶劑。

提取溶劑與茶湯樣品的體積比是提取茶湯中所有苯甲酰脲類農(nóng)藥的另一個重要因素。實驗結(jié)果表明，提取溶劑體積與茶湯樣品體積的最佳比例為3∶10。比例太高將提高試劑空白的背景，損失了方法檢測限；而比例偏低，則提取效率較低，最終也導(dǎo)致方法靈敏度的降低。

2.1.2提取時間對提取效率的影響實驗分別選擇提取時間1、2、5、7、10 min，考察提取時間對提取效率的影響。結(jié)果表明，提取時間在1～5 min內(nèi)，提取效率隨提取時間的增加而增加，但在5～10 min內(nèi)，隨著提取時間的增加提取效率基本上不再變化、達到最大值，所以選擇5 min為最佳提取時間。

在上述最佳提取溶劑/茶湯樣品體積比和提取時間下，經(jīng)過2次提取，茶湯中所有苯甲酰脲類農(nóng)藥的提取率可達90%以上。

2.1.3提取液預(yù)處理條件優(yōu)化文獻報道活性炭可以有效去除茶葉提取液中的色素，而弗羅里硅土可以有效去除茶葉提取液中其他雜質(zhì)比如糖類、酯類等[13]。所以，在本實驗中我們利用一根長6 cm、內(nèi)徑1 cm的弗羅里硅土和活性炭固相萃取小柱對茶湯提取液中的苯甲酰脲類農(nóng)藥進行預(yù)富集，并去除色素和糖類、酯類等干擾物質(zhì)。實驗結(jié)果表明，在長6 cm、內(nèi)徑1 cm的小柱中填充0.5 g弗羅里硅土和0.05 g活性炭，可以去除茶湯提取液中大部分的色素、糖類和酯類等干擾物質(zhì)，并獲得滿意回收率。

圖1 7種苯甲酰脲類農(nóng)藥的色譜圖Fig.1 The chromatograms of 7 benzoylurea pesticides(A)Mixed standards solution of 7 benzoylurea pesticides(10 ng/mL CHLO,100 ng/mL DIFL,20 ng/mL FLUA,100 ng/mL FLUF,5 ng/mL HEXA,20 ng/mL TEFL and 20 ng/mL TRIF);(B)Oolong tea infusion;(C)Green tea infusion;(D)blank.

根據(jù)7種苯甲酰脲類農(nóng)藥的極性，乙腈和甲苯的混合物被用于洗脫吸附在活性炭/弗羅里硅土固相小柱上的苯甲酰脲類農(nóng)藥。通過使用不同體積比的乙腈和甲苯混合液(1∶1，1∶2，1∶3，1∶4)為溶劑對乙腈和甲苯的比例進行優(yōu)化，結(jié)果表明乙腈/甲苯(V/V)=1/3是最好的選擇。利用20 mL乙腈和甲苯混合溶劑可以把吸附在活性炭/弗羅里硅土固相小柱上的苯甲酰脲類農(nóng)藥完全洗脫下來。

2.2 方法線性范圍、重現(xiàn)性和檢測限

樣品經(jīng)上述提取和預(yù)處理后，利用HPLC-MS/MS對烏龍茶和綠茶茶湯樣品中的7種苯甲酰脲類農(nóng)藥的濃度進行了測定，其色譜圖如圖1所示。可以清楚地觀察到7種苯甲酰脲類農(nóng)藥在6.5 min內(nèi)被完全分離，基本沒有基質(zhì)干擾。繪制了校準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明氟啶脲在0.25～10 ng/mL的濃度范圍內(nèi)，除蟲脲和氟蟲脲在5.0～250 ng/mL的濃度范圍內(nèi)，啶脾脲、氟苯脲和殺鈴脲在0.5～20 ng/mL的濃度范圍內(nèi)，氟鈴脲在0.13～5.0 ng/mL的濃度范圍內(nèi)，其色譜峰鋒面積和濃度呈良好的線性關(guān)系。其線性方程、檢測限和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)見表2。從表2可知，7種苯甲酰脲類農(nóng)藥的檢測限(DL)和定量限(QL)分別為0.08～1.00 ng/mL和0.09～3.02 ng/mL。6次重復(fù)測定的RSD小于8%(n=6)。

表2 方法線性回歸方程、線性范圍、重現(xiàn)性、檢測限和定量限

aX=concentration(ng/mL),Y=counts(peak area);bInstrument detection limit(IUPAC criterion);cIUPAC criterion;dEURACHEM criterion(RSD,10%).

2.3 茶湯樣品的測定

7種苯甲酰脲類農(nóng)藥的測定結(jié)果和回收率見表3和表4。從表3、4和圖1，可以發(fā)現(xiàn)茶湯中7種苯甲酰脲類農(nóng)藥實現(xiàn)基線分離，沒有明顯的基質(zhì)干擾，7種苯甲酰脲類農(nóng)藥的加標(biāo)回收率在90%～105%之間，5次重復(fù)測定的RSD小于7.0%，說明了方法的可靠性。

表3 烏龍茶湯中苯甲酰脲類農(nóng)藥殘留的分析結(jié)果(n=5)

表4 綠茶茶湯中苯甲酰脲類農(nóng)藥殘留的分析結(jié)果(n=5)

3 結(jié)論

建立了一種基于HPLC-MS/MS法，結(jié)合溶劑提取和固相富集技術(shù)同時分析檢測茶湯中7種苯甲酰脲類農(nóng)藥殘留的分析方法。在最佳條件下，7種苯甲酰脲類農(nóng)藥在6.5 min內(nèi)被完全分離，沒有明顯的基質(zhì)干擾。該方法具有耗時短、靈敏度高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，有助于茶葉安全飲用的準(zhǔn)確評價。