液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法檢測人參和土壤中多菌靈的殘留動態(tài)

崔麗麗, 閆梅霞, 王春偉， 許允成， 王 燕， 高 潔*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所，吉林長春 130112； 2.吉林農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院,吉林長春 130118)

目前國內(nèi)外己有記載的人參病害有40余種，我國己發(fā)現(xiàn)的人參病害至少在25種以上[1，2]，國內(nèi)常見侵染性病害主要有黑斑病、灰霉病、立枯病、菌核病、疫病、銹腐病、猝倒病、根腐病、炭疽病等[3]。文獻報道在韓國影響人參產(chǎn)量的真菌病害有炭疽病(Colletotrichumgloeosporoides)、立枯病(Pythiumdebaryanum,Pythiumultimum,andRhizoctoniasolani)、疫病(Phytophthoracactorum)、灰霉病(Botrytiscinerea)、黑斑病(Alternariapanax)6種[4，5]。多菌靈(Carbendazim)屬苯并咪唑類高效低毒內(nèi)吸性廣譜殺菌劑[6]，可用于防治大田作物、蔬菜、果樹及經(jīng)濟作物的多種病害[7]。多菌靈主要用來防治人參立枯病和人參銹腐病[3,8]。我國已制定多菌靈在谷物(如大米、小麥和玉米)，油料(如大豆、花生仁和油菜籽)，蔬菜(如黃瓜、番茄、蘆筍、辣椒和韭菜)，水果(如葡萄、蘋果、梨、西瓜、油桃和香蕉)，甜菜和茶葉中的最大殘留限量(MRL)值為0.05～5.00 mg/kg[9]。日本、歐盟和韓國分別制訂了多菌靈在人參中的最大殘留限量標準，日本為3.0 mg/kg，歐盟為0.1 mg/kg，韓國為0.5 mg/kg(干人參和紅參)和0.2 mg/kg(鮮參)[10]，但我國尚未規(guī)定人參中多菌靈殘留限量值。

多菌靈在人參生長期的殘留動態(tài)已有文獻報道[8]，采用高效液相色譜法(HPLC)和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)測定人參及人參制劑、西洋參中多菌靈殘留量[11 - 16]。拌土施藥是多菌靈常用施藥方式，同時LC-MS/MS在食品、環(huán)境等領(lǐng)域的農(nóng)殘分析應用越來越廣泛，為此設(shè)計了兩年兩地殘留試驗研究50%多菌靈可濕性粉劑在人參中的殘留動態(tài)及最終殘留水平，建立了LC-MS/MS法檢測多菌靈殘留量。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

API 4000液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國，Applied Biosystems公司)，配有電噴霧離子源；組織搗碎機(20 000 r/min)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀SA31(瑞士，Büchi公司)；Mettler PL1500-s電子天平(0.01 g)；彩色單道移液槍(1、5、10 mL)(德國，Eppendorf有限公司)；GPR固相萃取柱(迪馬公司ProElut GPR，粒徑1.5 g/12mL)；離心機(10 000 r/min)。

多菌靈標準品(純度98.0%，購自國家標準物質(zhì)研究中心)；50%多菌靈(利民化工股份有限公司)；甲苯為色譜純；乙腈、甲酸均為分析純；水為GB/T6682規(guī)定的一級水。

供試作物：人參(二年人參)，產(chǎn)地吉林省撫松興參鎮(zhèn)和集安市榆林鎮(zhèn)，品種為大馬牙。

1.2 消解動態(tài)試驗

1.2.1人參試驗共設(shè)50%多菌靈和空白對照2個處理，3次重復，小區(qū)面積為15 m2。采用拌土施藥法施藥，施藥劑量為52 500 g a.i./hm2(高劑量)。施藥后0 d(在施藥拌土后2 h之內(nèi))、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d 5點法取樣，參根約1.0 kg。同期采集未施藥處理的人參樣品，標簽標記后，于-20 ℃條件下保存，待測。

1.2.2土壤選一塊15 m2的地塊，單獨進行拌土施藥，劑量52 500 g a.i./hm2，拌土后0 d(2 h)、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d 和收獲期分別采樣，另設(shè)清水空白對照。土壤樣本的采集：隨機取點5～10個，用土鉆采集0～10 cm的土壤1～2 kg，除去土壤中的碎石、雜草和植物根莖等雜物，混勻后用四分法取樣500 g，裝入樣本容器中，貼好標簽，貯存于-20 ℃冰柜中保存。

1.3 最終殘留試驗

試驗設(shè)2個施藥劑量35 000 g a.i./hm2和52 500 g a.i./hm2，拌土施藥1 次，每處設(shè)3次重復和1個未施藥的空白小區(qū)。采樣時間距離施藥間隔時間為在澆灌后28 d、35 d和收獲期的根和土壤樣品。采樣方法同消解動態(tài)。

1.4 樣品處理

1.4.1提取稱取-20 ℃冷凍保存的鮮人參、土壤各100 g，依次用搗碎機將樣品粉碎，取1 g樣品于50 mL離心管中，加入0.1%甲酸水溶液20 mL，用渦漩混勻器混合1 min后，以8 000 r/min離心5 min，取上清液，再向離心管中加入20 mL 0.1%甲酸水溶液，重復提取一次，合并上清液，于35 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，加入乙腈-0.1%甲酸(3∶1,V/V)5 mL溶解，待凈化。

1.4.2凈化用10 mL乙腈-0.1%甲酸(3∶1,V/V)預淋洗GPR固相萃取柱，流出液棄去。將5 mL溶解液傾入GPR固相萃取柱中，用20 mL乙腈-0.1%甲酸(3∶1,V/V)進行洗脫。收集全部洗脫液于雞心瓶中，于溫度35 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮至近干。用0.1%甲酸溶解殘渣并定容至5 mL，經(jīng) 0.22 μm 濾膜過濾后,供 LC-MS/MS法測定。

1.5 液相色譜與質(zhì)譜條件

色譜條件：Kromasil Eternity-5-C18色譜柱(150×2.1 mm)；流動相為0.1%甲酸水溶液(A)和乙腈(B)，流速250 μL/min。梯度洗脫程序：0～8 min,50%B;8～12.1 min,90%B;12.1 min,50%B,保持至25.0 min。柱溫：40 ℃；進樣量：10 μL。

質(zhì)譜條件：離子源溫度：725 ℃； 掃描方式：正離子掃描；多反應監(jiān)測；電噴霧電壓：5 500 V；霧化氣壓力：0.483 MPa；氣簾氣壓力：0.138 MPa；輔助加熱氣壓力：0.379 MPa；監(jiān)測離子對為m/z192.1/132.0，m/z192.1/160.1(定量離子)、碰撞氣能量分別為25、41 eV，去簇電壓27 V。

2 結(jié)果與討論

2.1 標準曲線與最低檢測濃度

用0.1%甲酸水溶液溶解多菌靈標準品，配制0.01、0.02、0.05、0.1、0.5 μg/mL系列標準溶液。以多菌類的質(zhì)量濃度(x)為橫坐標，以色譜峰面積(y)為縱坐標，繪制標準曲線。結(jié)果表明，多菌靈在0.01～0.5 μg/mL濃度范圍內(nèi)，其濃度與響應值有良好的線性關(guān)系(r2=0.9985)，線性方程為：y=9.54×106x+3.11×105，在優(yōu)化測定條件下多菌靈在人參和土壤中的最低檢出濃度為0.005 mg/kg。

2.2 添加回收率

取空白對照區(qū)人參和土樣進行添加回收率試驗，共設(shè)0.01 mg/kg、0.02 mg/kg和0.2 mg/kg 3個添加濃度，5次重復。從表1可看出，相對標準偏差(RSD)為2.85%～6.28%，表明使用上述檢測方法分析人參和土壤中多菌靈，結(jié)果精密度好、準確可靠。

表1 多菌靈回收率(n=5)

2.3 殘留動態(tài)試驗

2011年與2012年多菌靈的殘留動態(tài)試驗結(jié)果見表2、表3。分析樣品分別來自吉林省撫松縣(Sample 1)和集安市(Sample 2)。

撫松和集安兩年兩地的殘留數(shù)據(jù)結(jié)果表明多菌靈在人參中的半衰期為11.6～13.7 d，在土壤中的半衰期為10.4～13.0 d，說明多菌靈在人參和土壤中屬于易降解農(nóng)藥(t1/2<30 d)(表2和表3)。

表2 多菌靈在人參中的殘留動態(tài)

表3 多菌靈在土壤中的殘留動態(tài)

2.4 最終殘留試驗

在人參苗進行移栽時采用拌土施藥法施用50%多菌靈可濕性粉劑， 在35 000 g a.i./hm2、52 500 g a.i./hm2劑量下，施藥后65 d人參上的多菌靈最終殘留量均低于0.0332 mg/kg，土壤中的多菌靈最終殘留量均低于0.0428 mg/kg，結(jié)果見表4。

表4 多菌靈在人參和土壤中的最終殘留結(jié)果

3 結(jié)論

兩年兩地殘留試驗結(jié)果表明，50%多菌靈可濕性粉劑用藥量35 000～52 500 g a.i./hm2，施藥1次，采收間隔期為28 d、35 d、65 d，在人參中的半衰期為11.6～13.7 d，在土壤中的半衰期為10.4～13.0 d，殘留量分別是0.0075～0.0332 mg/kg(人參)和0.0068～0.0428 mg/kg(土壤)。因此，建議50%多菌靈可濕性粉劑在人參中的MRL值為0.5 mg/kg，最高用藥量52 500 g a.i./hm2，安全施藥間隔期 28 d。