茯苓中多糖含量的測(cè)定方法研究*

張文芳，陳丹紅

（福建省測(cè)試技術(shù)研究所， 福建 福州 350003）

茯苓中多糖含量的測(cè)定方法研究*

張文芳，陳丹紅

（福建省測(cè)試技術(shù)研究所， 福建 福州 350003）

篩選分光光度法測(cè)定茯苓中多糖含量的最優(yōu)條件，以便快速準(zhǔn)確地進(jìn)行茯苓產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)價(jià)。方法：采用苯酚—濃硫酸比色法測(cè)定茯苓中總糖含量；采用3,5-二硝基水楊酸（DNS）比色定糖法測(cè)還原糖含量，相減得多糖含量；同時(shí)分別從水浴時(shí)間，苯酚和濃硫酸用量等方面考察最優(yōu)條件；進(jìn)行了精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、加樣回收率等方面試驗(yàn)。結(jié)果：茯苓總糖測(cè)定的最優(yōu)條件為6%苯酚1.0ml，濃硫酸5.0ml，沸水浴15 min；回歸方程為回歸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0056x，R2=0.9943；測(cè)茯苓還原糖的回歸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.7720x，R2=0.9903。方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，可用作茯苓中多糖含量的測(cè)定。

茯苓；總糖; 還原糖; 多糖；紫外分光光度法

茯苓為多孔菌科真菌茯苓Poria cocos(Schw.) Wolf的干燥菌核,為我國(guó)傳統(tǒng)的常用中藥材，具有祛濕利尿、健脾和胃、補(bǔ)體強(qiáng)身、安神寧心的作用。茯苓主要化學(xué)成分為茯苓多糖、三萜類、樹膠、蛋白質(zhì)和脂肪酸等化合物等。中外學(xué)者對(duì)茯苓的化學(xué)成分及生物活性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其所含的多糖與免疫功能的調(diào)節(jié)、細(xì)胞與細(xì)胞的識(shí)別、細(xì)胞間物質(zhì)的運(yùn)輸、癌癥的診斷與治療等，都有著密切的關(guān)系。大量研究表明植物多糖具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、抗腫瘤、抗病毒、抗衰老、降血糖、刺激造血等多種生物學(xué)功效，而且對(duì)機(jī)體幾乎沒有毒性。天然多糖化合物作為一種免疫調(diào)節(jié)劑已越來越多地用于腫瘤、肝炎等疾病的治療和康復(fù)。而艾滋病的肆虐更使天然多糖化合物特別是它的強(qiáng)抗病毒活性的衍生物，成為科學(xué)家們尤其是藥物學(xué)家們高度重視的對(duì)象。茯苓中多糖的含量與藥效的關(guān)系極大，建立茯苓多糖的分析測(cè)定體系對(duì)于茯苓藥材的內(nèi)在質(zhì)量控制具有重要意義。文章與以前僅采用采用苯酚—濃硫酸體系測(cè)總糖的方法不同，扣除了還原糖的含量，得到茯苓多糖的真實(shí)含量。該方法簡(jiǎn)便、快速，可為進(jìn)一步研究茯苓種植質(zhì)量和藥理活性提供分析數(shù)據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器（表1）

1.2 試劑

苯酚，濃硫酸：上?；瘜W(xué)試劑有限公司，分析純；其余均為化學(xué)純，市售。

表1 實(shí)驗(yàn)儀器

2 方法及結(jié)果

2.1 茯苓多糖測(cè)定方法的研究

2.1.1 原理

提取液中不僅含有多糖，還含有一些還原糖如單糖和寡糖，由于無法直接測(cè)得溶液中多糖的含量，因此用苯酚-硫酸法測(cè)得總糖含量，DNS法測(cè)得還原糖含量，然后兩者相減即得多糖含量。

茯苓多糖=茯苓總糖-茯苓還原糖

2.1.2 茯苓總糖測(cè)定---采用苯酚硫酸法

2.1.2.1 實(shí)驗(yàn)原理

苯酚-硫酸試劑可與游離的單糖或寡糖、多糖中的己糖、糖醛酸（或甲苯衍生物）起顯色反應(yīng)，己糖在490 nm（戊糖以及糖醛在480 nm）處有最大吸收，吸收值與糖含量呈線性關(guān)系。多糖在硫酸的作用下先水解成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后與苯酚生成橙黃色化合物。再以比色法測(cè)定。

2.1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

（1）取9支干凈的試管，然后按照表2提供的數(shù)據(jù)加樣。

（2）加完樣后靜置20min，待顯色穩(wěn)定

（3）以0號(hào)試管為空白對(duì)照，于490 nm下測(cè)溶液的吸光值。

（4）樣品含量的測(cè)定：取一定量的待側(cè)樣品，加水補(bǔ)足2 mL，按上述步驟，測(cè)490 nm的光密度，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總糖含量。

2.1.2.3 苯酚硫酸法測(cè)總糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）回歸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0056x，R2=0.9943。

2.1.3 還原糖含量測(cè)定

采用3,5-二硝基水楊酸（DNS）比色定糖法

2.1.3.1 實(shí)驗(yàn)原理

還原糖是指含自由醛基或酮基的單糖（如葡萄糖）和某些具有還原性的雙糖（如麥芽糖）。它們?cè)趬A性條件下，可變成非?；顫姷南┒?。遇氧化劑時(shí)，具有還原能力，烯二醇本身則被氧化成糖酸及其他產(chǎn)物。黃色的3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑與還原糖在堿性條件下共熱后，自身被還原為棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。在一定范圍內(nèi)，反應(yīng)液里棕紅色的深淺與還原糖的含量成正比，在波長(zhǎng)為540 nm處測(cè)定溶液的吸光度，查對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算，便可求得樣品中還原糖的含量。（DNS溶液共熱后被還原成棕紅色的氨基化合物，在一定的范圍內(nèi)還原糖的量和棕紅色物質(zhì)顏色深淺的程度成一定的比例關(guān)系。（該方法操作簡(jiǎn)單，快速，雜質(zhì)干擾較少）。

表2

圖1 苯酚硫酸法測(cè)總糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.3.2 實(shí)驗(yàn)試劑

3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑：

甲液：溶解6.9 g結(jié)晶酚于15.2 mL10%氫氧化鈉溶液中，并用水稀釋至69 mL，在此溶液中加6.9 g亞硫酸氫鈉。

圖2 3.5-二硝基水楊酸比色定糖法（DNS）測(cè)還原糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

乙液：稱取255 g酒石酸鉀鈉加到300 mL10%氫氧化鈉溶液中，再加入880 mL1%3,5-二硝基水楊酸溶液。

將甲乙二溶液相混合即得黃色試劑，貯于棕色瓶中備用。在室溫放置7～10d以后使用。

2.1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

(1) 取9支干凈的試管，編號(hào)0～8，分別按照表3加入試劑。

（2）加完樣后在沸水浴中加熱5min，取出，然后立即用流動(dòng)冷水冷卻。

（3）待樣品冷卻完全后每管中加入21.5 mL蒸餾水，充分搖勻。

（4）以0號(hào)管為空白對(duì)照，于520 nm下測(cè)光吸收值。

（5）樣品含量的測(cè)定：取一定量的待側(cè)樣品加水補(bǔ)足2 mL，按上述步驟，測(cè)得其520 nm的光吸收值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程即可算出還原糖含量。

表3

2.1.3.4 3.5-二硝基水楊酸比色定糖法（DNS）測(cè)還原糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）

回歸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.7720x，R2=0.9903。

2.2 茯苓多糖測(cè)定方法的優(yōu)化

2.2.1 對(duì)照品溶液制備：精密稱取105℃干燥 恒重的葡萄糖50mg與50ml容量瓶中用水溶解并定容，搖勻。精密吸取5ml于50ml容量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得 0.1mg.mL-1的對(duì)照品溶液。

2.2.2 苯酚用量選擇：精密稱取對(duì)照品溶液各1.0ml的5份，分別加入6%苯酚0.6、0.8、1.0、1.2、 1.4 mL，混勻，每份分別緩慢加入濃硫酸5 mL并攪拌，充分搖勻，靜至5min后再置沸水浴中 加熱15min，取出，冷卻至室溫，在490nm處測(cè)吸光度。結(jié)果如表4。選擇6%苯酚用量為1.0 mL。

2.2.3 濃硫酸用量選擇：精密稱取對(duì)照品溶液1.0ml的5份，各加入6%苯酚1.0ml，分別緩慢加入濃硫酸4.0，4.5 ， 5.0，5.5，6 mL，并攪拌，充分搖勻，靜至5min后再置沸水浴中 加熱15min，取出，冷卻至室溫，在490nm處測(cè)吸光度。結(jié)果如表5。選擇濃硫酸用量為5.0 ml。

2.2.4 水浴時(shí)間選擇：精密稱取對(duì)照品溶液1.0mL的5份，各加入6%苯酚1.0mL，分別緩慢加入濃硫酸5.0 mL 并攪拌，充分搖勻，靜至5min后再置沸水浴中加熱分別為5、10、15、20、25min，取出，冷卻至室溫，在490nm處測(cè)吸光度。結(jié)果如表6。選取水浴時(shí)間為15min。

2.2.5 樣品的測(cè)試及精密度實(shí)驗(yàn)： 稱取同一批茯苓粉末（過60目篩）各1.0g 6份，按上述測(cè)定總糖和還原糖方法測(cè)定后相減得多糖含量，平行測(cè)定茯苓多糖含量為0.725 mg.mL-1，RSD為1.07%(n=6)，結(jié)果見表7，表明精密度良好。

2.2.6 加樣回收率實(shí)驗(yàn)及標(biāo)準(zhǔn)偏差： 稱取同一批茯苓粉末（過60目篩）各1.0g 3份，分別加入葡萄糖供試品10 mL（1 mg.mL-1）的母液。按最優(yōu)的測(cè)定條件測(cè)總糖和還原糖，測(cè)定后相減得多糖含量，平行測(cè)定3次茯苓多糖的回收量，計(jì)算得平均回收率為：102.39%，RSD為0.36%(n=3)，表明回收率良好,結(jié)果見表8。

表4 6%苯酚不同用量實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表5 濃硫酸不同用量實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表6 水浴不同時(shí)間實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)：精確稱取同一供試液1 mL，按含量測(cè)定方法的最佳條件操作，以試劑空白作對(duì)照，每隔30min 測(cè)一次吸光度，考察樣品3h內(nèi)的穩(wěn)定性，結(jié)果表明供試樣品在3小h內(nèi)顯色穩(wěn)定。

3 結(jié)論

采用苯酚—濃硫酸比色法測(cè)定茯苓中總糖含量；采用3,5-二硝基水楊酸（DNS）比色定糖法測(cè)還原糖含量，相減得多糖含量；建立的這個(gè)方法體系測(cè)量結(jié)果比用苯酚—濃硫酸比色法算多糖的結(jié)果更精確；方法的重現(xiàn)性，穩(wěn)定性，精密度，回收率都達(dá)到了檢測(cè)要求，該方法未見報(bào)道可作為茯苓產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)控的有效方法。

表7 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表8 回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）

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O652

A

1007-550X（2015）05-0035-05

10.3969/j.issn.1007-550X.2015.05.002

*福建省科技廳項(xiàng)目----‘茯苓產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研制 ’（2011R1007-4）資助。

2015-04-13

張文芳（1963-），女，工程師。