DPP－4抑制劑和纈沙坦對(duì)糖尿病腎臟組織CTGF表達(dá)的影響

武紅梅，鄧麗萍，胡園園，沈明靜，龍愛(ài)梅，黃瑩

(深圳市龍崗中心醫(yī)院，廣東深圳 518116)

糖尿病腎病 (Diabeticnephropathy，DN)是糖尿病 (Diabetes mellitus，DM)常見(jiàn)和嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥，是導(dǎo)致終末期腎衰竭的主要原因之一，其確切發(fā)病機(jī)制目前尚未完全清楚，亦無(wú)特異性治療方法。有關(guān)腎臟局部CTGF在DN表達(dá)的變化，研究報(bào)道還非常少見(jiàn)，且給予DPP－4抑制劑–維格列汀、血管緊張素受體拮抗劑－纈沙坦及聯(lián)合阻抑DN的發(fā)生發(fā)展目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑

健康雄性SD大鼠50只，2月齡，體質(zhì)量180～200 g，主要試劑:鏈脈佐菌素 (STZ，廈門(mén)星隆達(dá)化學(xué)試劑有限公司)，DPP－4抑制劑維格列汀、纈沙坦 (諾華制藥有限公司)，尿蛋白試劑盒 (購(gòu)自南京建成科技有限公司)，血糖試紙 (美國(guó)強(qiáng)生公司生產(chǎn))，CTGF、SP試驗(yàn)盒 (Ⅱ抗)、生物素標(biāo)記羊抗兔IgG、DAB顯色劑 (購(gòu)自武漢博士德生物有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠模型制作及分組 50只SD大鼠，單次腹腔注射65 mg/kg STZ，STZ用0.1 mmol/L無(wú)菌枸櫞酸緩沖液配制 (pH=4.5)。待72 h以后，尾靜脈取血測(cè)定血糖，血糖≥16.67 mmol/L的大鼠入組為糖尿病大鼠 (未成模8只，舍去)。連續(xù)4 w測(cè)定血糖、24 h尿蛋白，連續(xù)3 d隨機(jī)血糖≥16.67 mmol/L，并且24 h尿蛋白＞30 mg/(kg·d)，糖尿病腎病 (DN)大鼠模型成立［1］，(未成模6只，舍去)。均不用藥物干預(yù)。DN的大鼠36只再隨機(jī)分為4組:DN組9只 (予等量PBS緩沖液皮下注射)、維格列汀治療組 (VL)9只予8 mg/(kg·d)灌胃、纈沙坦治療組 (VT)9只予30 mg/(kg·d)灌胃，聯(lián)合用藥組 (VV)9只，予8 mg/(kg·d)灌胃+30 mg/(kg·d)灌胃，治療12 w。用代謝籠收集24 h尿，記錄尿量，留取少量尿標(biāo)本保存于－20℃冰箱待測(cè)尿蛋白，尾靜脈采血測(cè)空腹血糖 (FBG)，腹腔靜脈取血后，取出腎臟，置于10%中性福爾馬林中固定，用于光鏡與免疫組化。

1.2.2 各組大鼠生化指標(biāo)測(cè)定 (1)尾靜脈采血，強(qiáng)生血糖儀檢測(cè)血糖;(2)代謝籠收集24 h尿液，723型可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)尿蛋白含量。

1.2.3 免疫組化檢測(cè)腎組織CTGF蛋白表達(dá) 腎臟蠟塊制成4 μm厚切片，按照試劑盒操作，最后進(jìn)行脫水、透明、封片。在高倍鏡下，依據(jù)染色面積和強(qiáng)度，隨機(jī)取10個(gè)視野和腎小球，應(yīng)用計(jì)算機(jī)圖像分析軟件，進(jìn)行半定量分析，以陽(yáng)性目標(biāo)總面積與統(tǒng)計(jì)場(chǎng)總面積比值表示，陽(yáng)性結(jié)果為棕黃色顆粒。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血糖、24 h尿蛋白的比較

見(jiàn)表1。

2.2 腎組織免疫組化

第12周，DN組:腎組織著色廣泛、濃集，在腎小球系膜細(xì)胞區(qū)、腎小管上皮細(xì)胞、及間質(zhì)區(qū)均有表達(dá)，以腎小球表現(xiàn)最為突出。與DN相比，維格列汀、纈沙坦組，著色范圍相似，但程度明顯減輕 (P＜0.05)，聯(lián)合治療組最為明顯 (P＜0.01)，維格列汀、纈沙坦組兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但與聯(lián)合治療組比較 (P＜0.05)，見(jiàn)表2，圖1。

表1 各組大鼠血糖、24 h尿蛋白的比較

表2 各組大鼠腎組織CTGF的平均光密度值()

表2 各組大鼠腎組織CTGF的平均光密度值()

注:VL、VT與DN組相比，*P＜0.05;VV與DN組相比，＊＊P＜0.01;VL與VV組相比，▲P＜0.05

分組 n CTGF DN 9 3.11±0.59 VL 9 1.92±0.24*VT 9 2.10±0.31*VV 9 1.20±0.12＊＊▲

3 討 論

腸促胰素類藥物是目前用于治療2型糖尿病較新的一類藥物，腸促胰素類藥物有兩類:一類是GLP－1(胰高血糖素樣肽－1)類似物，一類是DPP－4(二肽基肽酶)抑制劑，它能通過(guò)抑制DPP－4的活性，減少DPP－4對(duì)GLP－1和GIP(葡萄糖依賴促胰島素多肽)的降解，提高循環(huán)中的GLP－1和GIP水平，而GLP－1具有葡萄糖濃度依賴的促胰島素分泌的特點(diǎn)，調(diào)節(jié)胰島B細(xì)胞和a細(xì)胞對(duì)血糖的敏感性。有文獻(xiàn)報(bào)道，GLP－1類似物艾塞那肽，能夠延緩糖尿病腎病的進(jìn)程［2］，同時(shí)發(fā)現(xiàn)在高糖狀態(tài)下，GLP－1類似物艾塞那肽干預(yù)的人腎小球系膜細(xì)胞轉(zhuǎn)化生子因子Bl和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子的表達(dá)亦相應(yīng)減少［3］。GLP－1受體激動(dòng)劑對(duì)腎臟的保護(hù)作用在DPP－4抑制劑中也得到了證實(shí)，如在T1DM小鼠中，經(jīng)DPP－4抑制劑治療后，能夠減少蛋白尿，改善腎臟組織學(xué)改變［4］。在T2DM小鼠中，DPP－4抑制劑西格列汀表現(xiàn)出了相似的腎保護(hù)效應(yīng)［5］，阿格列汀聯(lián)合ARB也能夠顯著減少尿蛋白。在人體研究中發(fā)現(xiàn)［6］，T2DM患者應(yīng)用DPP－4抑制劑阿格列汀治療24 w后，尿蛋白的排泄顯著減少。

近年來(lái)，臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，許多細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)DN的發(fā)生和發(fā)展起著一定的作用。其中，研究較多的是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF－β1，CTGF作為T(mén)GF－β1的下游因子，介導(dǎo)了TGF－β1的功能，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)積聚和腎組織纖維化等DN的特征性改變［7］，被認(rèn)為對(duì)糖尿病腎損傷的進(jìn)展起重要作用。我們的研究結(jié)果亦證明了這一點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)利用免疫組化檢測(cè)了腎皮質(zhì)CTGF的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，糖尿病大鼠腎組織CTGF表達(dá)明顯增多，經(jīng)維格列汀、纈沙坦治療后糖尿病大鼠腎組織CTGF表達(dá)明顯減少。

纈沙坦是非肽類 AngⅡ 拮抗劑 (angiotensin receptor blocter，ARB)類藥物，主要通過(guò)拮抗受體AT1，抑制腎臟局部腎素－血管緊張素－醛固酮系統(tǒng)，降低腎小球內(nèi)毛細(xì)血管壓力，減少細(xì)胞生長(zhǎng)因子及炎癥介質(zhì)，減輕腎臟細(xì)胞的增殖及細(xì)胞外基質(zhì)的積聚，起到降低尿蛋白，保護(hù)腎功能的作用［8］。近來(lái)研究還顯示，在早期DN患者應(yīng)用纈沙坦能有效減少尿白蛋白排泄，保護(hù)其腎臟功能［9］。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)纈沙坦組能減少糖尿病腎病大鼠尿蛋白水平，且與維格列汀聯(lián)合應(yīng)用作用更顯著。

本研究通過(guò)測(cè)定DN大鼠的血糖及24 h尿蛋白，觀察腎小球的CTGF表達(dá)水平，證實(shí)糖尿病腎病大鼠腎組織中存在CTGF的高表達(dá)，DPP－4抑制劑維格列汀及ARB類纈沙坦可下調(diào)其表達(dá)，而其聯(lián)合應(yīng)用對(duì)其下調(diào)的作用更顯著，而且本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)隨著糖尿病腎病腎組織CTGF表達(dá)水平的降低，尿蛋白也明顯下降，提示降低糖尿病腎病腎臟CTGF高表達(dá)是其腎保護(hù)作用機(jī)制之一，DPP－4抑制劑維格列汀聯(lián)合纈沙坦應(yīng)用可能更有利于糖尿病腎病的治療，為臨床治療糖尿病腎病提供了方向。

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圖1 各組大鼠腎組織C TG F 的蛋白表達(dá)水平