腺嘌呤誘導(dǎo)慢性高尿酸血癥大鼠模型實驗研究

樂心逸，劉　藝，李默影，孫　艷，沈龍海

（上海醫(yī)藥工業(yè)研究院，上?！?00437）

腺嘌呤誘導(dǎo)慢性高尿酸血癥大鼠模型實驗研究

樂心逸，劉藝，李默影，孫艷，沈龍海

（上海醫(yī)藥工業(yè)研究院，上海200437）

目的通過對飼料中添加不同劑量腺嘌呤誘導(dǎo)的慢性高尿酸血癥大鼠模型比較研究，篩選出飼料中添加腺嘌呤的最佳造模劑量。 方法將42只成年雄性SD大鼠隨機(jī)分組：正常組（N）、模型1～6組（M1～6），每組6只。按不同比例的腺嘌呤粉末（1%、0.75%、0.5%、0.25%、0.1%）加入M1～5組大鼠的日常飼料中， 自由采食。M6組大鼠每日一次灌服腺嘌呤（200 mg/kg）， 持續(xù)21 d。實驗期間與結(jié)束，主要觀察大鼠體征、死亡率、血尿酸（UA）、尿素氮（BUN）、肌酐（CRE）及腎臟形態(tài)學(xué)變化。 結(jié)果M1～5組UA、BUN、CRE均隨造模時間的增加不斷上升，其中M1、M2、M3組在7 d時UA、BUN、CRE已出現(xiàn)明顯升高（P＜0.05）； M4、M5、M6組在20 d 其UA才出現(xiàn)顯著上升（P＜0.05），整個實驗過程中M1、M2組大鼠均有死亡，其余各組無死亡。實驗結(jié)束解剖發(fā)現(xiàn)各組大鼠均有不同程度的腎腫大，M6組大鼠腎臟病變尤其嚴(yán)重。 結(jié)論通過對大鼠死亡率、血液生化指標(biāo)和大鼠腎臟損害程度等因素綜合比較，飼料中添加0.5%腺嘌呤為最佳的造模劑量。

慢性高尿酸血癥； 腺嘌呤； 慢性腎?。?痛風(fēng)

隨著人們生活水平的提高、飲食結(jié)構(gòu)和生活習(xí)慣的改變，動物蛋白、脂肪攝入大量增加，導(dǎo)致了高尿酸血癥（hyperuricemia，HUA）的發(fā)病率逐年上升。臨床上， HUA常與高血壓、肥胖、糖尿病、心腦血管疾病和腎臟疾病等并發(fā)［1，2］。長期的HUA可導(dǎo)致慢性間歇性腎炎和尿酸石的形成，從而嚴(yán)重影響患者的日常生活［3］。故對高尿酸血癥腎損害的預(yù)防和治療已引起越來越多的關(guān)注。合理的動物模型是篩選新型降尿酸藥物的重要工具，但目前仍缺乏公認(rèn)的高尿酸血癥腎損害動物模型。借鑒現(xiàn)有文獻(xiàn)資料［4-8］，作者選擇飼料中添加不同劑量的腺嘌呤與直接灌胃的造模方法，希望能夠找到穩(wěn)定可靠、可重復(fù)、合理的慢性高尿酸血癥大鼠模型用于藥物研究。

1　材料與方法

1.1實驗動物

SPF級SD雄性大鼠42只， 體質(zhì)量160±20 g由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供［SCXK 2008-0016］，實驗前在動物房飼養(yǎng)一周，全部實驗過程中大鼠自由飲食飲水［SYXK（滬）2014-0018］，飼料由上海斯萊克實驗動物責(zé)任有限公司提供［滬飼證（2014）04001］。

1.2儀器和試劑

日立7080全自動血清生化分析儀； 腺嘌呤， 批號：Lot.X01012MA13， 購自上海源葉生物科技有限公司。

1.3動物分組和造模

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為正常組（N）、模型1～6組（M1～6），每組6只。正常組實驗過程中正常飼養(yǎng)，M1～5組按照不同比例的腺嘌呤粉末加入大鼠每日的日常飼料中造模（比例依次為1%、0.75%、0.5%、0.25%、0.1%），M6組為每日一次腺嘌呤灌胃（200 mg/kg），連續(xù)21 d。

1.4指標(biāo)檢測

在造模7 d、14 d、21 d， 大鼠眼底靜脈叢插管取血0.5 mL， 冰浴靜置0.5 h后， 4 ℃， 13.8×g， 離心5 min， 取血清通過日立全自動血清生化分析儀檢測血清尿酸（UA）、尿素氮（BUN）和肌酐（CRE）水平。

1.5組織學(xué)檢查

造模結(jié)束后大鼠麻醉處死，剝離腎臟，固定，石蠟包埋切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1模型大鼠體質(zhì)量和存活率

正常大鼠在飼養(yǎng)過程中狀態(tài)穩(wěn)定， 體質(zhì)量持續(xù)上升，模型組大鼠隨著飼養(yǎng)天數(shù)增加而日漸消瘦并伴有排泄增多、體毛干枯不齊、活動減少、耳鼻蒼白等情況。M1、M2組大鼠于造模19 d和20 d出現(xiàn)死亡，造模結(jié)束動物死亡率為33.3%， 其余各組均未出現(xiàn)動物死亡。對死亡動物的解剖發(fā)現(xiàn)其腎臟均出現(xiàn)了嚴(yán)重病變，肉眼觀察發(fā)現(xiàn)病變腎臟呈深棕色， 表明布滿棕黃色顆粒， 體質(zhì)量比較發(fā)現(xiàn)， M 1、M2組造模7 d與正常大鼠有極顯著差異（P＜0.001），詳見表1。

表1　實驗期間各組大鼠體質(zhì)量的變化　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　g

2.2大鼠血清UA、BUN、CRE水平

與正常大鼠相比M1～M3造模7 d 時UA值出現(xiàn)極顯著上升（P＜0.001），其后2周也維持在較為穩(wěn)定的數(shù)值，與正常組相比均有極顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.001）； M4～M6造模14 d 時UA值出現(xiàn)顯著上升（P＜0.01）。

除M5外其余各組模型在造模7 d后BUN水平均出現(xiàn)顯著上升（P＜0.05），且BUN上升的幅度與飼料中腺嘌呤的含量有一定劑量依賴性，整個造模過程中各組BUN水平均持續(xù)升高。

與正常組相比，M1～M3、M6在造模7 d后CRE水平均顯著上升（P＜0.01）， 且上升的趨勢和腺嘌呤含量呈正比； 造模14 d后除M5， 各組與正常組相比CRE均有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）， 以M6組CRE的升高最為顯著（P＜0.001），21 d時，各組CR水平均進(jìn)一步上升（P＜0.05）， 有明顯的劑量依賴性。

表2　實驗期間各組大鼠血清UA、BUN、CRE水平比較　　　　　　　　　　　μmol·L-1

2.3模型大鼠腎臟病理學(xué)觀察

腎臟病理形態(tài)改變（圖1）： 正常對照組大鼠腎臟結(jié)構(gòu)清晰，皮、髓質(zhì)結(jié)構(gòu)正常，腎小球、腎小管及間質(zhì)均無異常改變（圖1A）。與正常對照組比較，各模型組均可見腎小管內(nèi)有大量結(jié)晶物沉著，有異物肉芽腫形成，占據(jù)整個管腔，腎小管上皮濁腫、壞死、脫落， 腎小管顯著擴(kuò)張成囊狀，皮、髓質(zhì)間質(zhì)纖維組織增生，有大量炎性細(xì)胞浸潤，可見纖維素樣壞死（圖1B、C、D、E、F）。且隨著腺嘌呤灌胃劑量的增加其腎臟的損傷程度不斷加重，其中腺嘌呤灌胃組腎損傷最嚴(yán)重（圖1G），出現(xiàn)明顯的腎臟膨大。

3　討論

腺嘌呤為實驗室建立慢性高尿酸血癥動物模型最常用的藥物之一，但在造模過程中腎功能損傷程度不易控制，大劑量時可導(dǎo)致動物死亡。不同文獻(xiàn)報道的腺嘌呤慢性高尿酸血癥造模的方法和劑量相差甚大，這可能與給藥時間、給藥方法、動物屬種和體質(zhì)差異等多項因素有關(guān)［9-13］。腺嘌呤造模一般采取灌胃方法，劑量范圍在50～300 mg/kg，造模成功的時間7～30 d不等，但造模成功后模型組血尿酸水平隨采血時間的不同存在一定的波動，同時劑量不容易控制，劑量過高會導(dǎo)致短時間內(nèi)尿酸急劇升高、嚴(yán)重腎損傷，影響相關(guān)實驗進(jìn)行劑量過低不易造成慢性高尿酸血癥模型［14，15］。本實驗專門探討了在普通大鼠飼料中添加腺嘌呤，自由采食的條件下，簡便、迅速、穩(wěn)定的建立慢性高尿酸血癥模型方法［16］。

由實驗結(jié)果可知，腺嘌呤飼料造模的M1～3組在7 d內(nèi)均造模成功，與正常組相比UA值有極顯著的升高（P＜0.001），并在之后的兩周內(nèi)保持在相對穩(wěn)定的水平，M 4～6組UA上升較慢且上升效果弱于前三組。M 1、M 2、M 6在造模的7 d BUN值有明顯上升（P＜0.01）， 在第二周時各模型組均有顯著差異（P＜0.05）， BUN水平隨造模天數(shù)不斷上升， 有一定劑量依賴性； 與正常組相比， M 1、M 2、M 3 M 6在造模 7 d時 CRE值均有明顯上升（P＜0.01）， 上升的趨勢和腺嘌呤含量呈正比， M 6的CRE值上升最明顯。這些指標(biāo)說明使用腺嘌呤造模時大鼠腎功能已受到嚴(yán)重?fù)p害， 并且腎臟的損害程度隨著腺嘌呤劑量的增加而增加， 其中灌胃給藥的方法對腎臟的損傷最大。此結(jié)果與大鼠腎臟病理學(xué)切片觀察相符

圖1　大鼠腎臟組織病理學(xué)觀察

本研究結(jié)果說明腺嘌呤灌胃法對腎臟的損傷遠(yuǎn)大于飼喂法，且在尿酸升高方面無明顯優(yōu)勢?？紤]到在篩選藥物實驗時如果幾個指標(biāo)過快上升很難對藥物的藥效學(xué)進(jìn)行評價，特別是對于藥理作用比較溫和的中藥，更難判斷，最后結(jié)合大鼠的體質(zhì)量、死亡率以及造模時間的考察，判斷腺嘌呤飼料0.5%的造模方法最為簡便、有效和合理用于篩選降尿酸藥物以及腎功能保護(hù)作用的研究。

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Investigation on Helicobacter spp. Infection in Rat，Mouse， Guinea Pig and Rabbit

FENG Jie1， ZHANG Rong2， XIE Jian-yun1， LI Rui-jiao3， HU Jian-hua1， GAO Cheng1
（1. Shanghai Laboratory Animal Research Center， Shanghai Quality Monitoring Center of Laboratory Animals，Shanghai， 201203， China； 2. Institute of Neuroscience， Chinese Academy of Sciences， Shanghai 200031， China；3. College of Chemistry， Chemical Engineering and Biotechnology， Donghua University， Shanghai 201620， China）

ObjectiveTo survey the Helicobacter spp. among rats， mice， guinea pigs and rabbits in Shanghai and surrounding area. MethodThe ileocecal region contents of rats， mice， guinea pigs and feces of rabbits were collected， and the bacterial genomic DNA were extracted. Both traditional PCR and multiplex PCR test were performed to investigate the Helicobacter spp. infection. ResultThe positive rate of Helicobacter spp. in rat， mouse， guinea pig and rabbit were 50.5%（105/208）， 37.9%（204/538）， 36.7% （36/98） and 4.9%（12/247） respectively. In addition， the triplex PCR test results of H.hepaticus， H.bilis， H. rodentium showed that H.hepaticus， H.bilis， infection can be detected in rabbit. H.bilis， H.rodentium can be detected in guinea pig. H.hepaticus， H.bilis， H.rodentium can be detected in rat and mouse. Conclusions There are different degrees of Helicobacter spp. infection in rats， mice， guinea pigs and rabbits of Shanghai and surrounding area.

Helicobacter spp.； PCR； Rodent； Rabbit

Q95-33

B

1674-5817（2015）02-0125-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.02.008

2014-10-13

上海市科學(xué)技術(shù)委員會科技支撐項目（編號： 13401900700）

樂心逸（1987-）， 女， 研究實習(xí)員， 研究方向： 藥理學(xué)。E-mail： eyeeye88@163.com

沈龍海， 研究員。E-mail： 2443280705@qq.com