母體糖尿病環(huán)境對(duì)體外受精胚胎早期發(fā)育的影響

強(qiáng)蘇靜，陶凌云，劉麗均，徐　平，3，高　誠(chéng)

（1. 上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，上海 201615；2. 上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，上海 201203；3. 中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院，上海 201615）

母體糖尿病環(huán)境對(duì)體外受精胚胎早期發(fā)育的影響

強(qiáng)蘇靜1，陶凌云2，劉麗均1，徐平1，3，高誠(chéng)2

（1. 上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，上海 201615；2. 上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，上海 201203；3. 中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院，上海 201615）

目的通過(guò)腹腔注射鏈脲佐菌素（streptozotocin， STZ）構(gòu)建小鼠糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）模型后， 運(yùn)用體外受精技術(shù)研究母體高血糖環(huán)境對(duì)早期胚胎發(fā)育的影響。方法選取6～8周齡ICR雌鼠經(jīng)2次腹腔注射小劑量STZ構(gòu)建小鼠糖尿病模型，并設(shè)實(shí)驗(yàn)對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)?zāi)甘篌w外受精得到2-細(xì)胞胚胎，統(tǒng)計(jì)受精率等，并將2-細(xì)胞胚胎移植至代孕母鼠體內(nèi)。取14 d胎齡的胚胎提取總RNA，用Agilent 2100 Bioanalyzer系統(tǒng)對(duì)總RNA進(jìn)行質(zhì)檢合格后，經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄、標(biāo)記、雜交、洗脫，芯片結(jié)果用Affymetrix Scanner 3000進(jìn)行掃描，用Command Console Software 3.1讀取原始數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，比較實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的基因表達(dá)的差異情況。結(jié)果較高血糖組（血糖為9.5～15.5 mmol/L）母鼠卵子體外受精后發(fā)育到2-細(xì)胞胚胎的比例為52.3%與對(duì)照組的72.1%存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），高血糖組（血糖值＞15.5 mmol/L）胚胎發(fā)育到2-細(xì)胞的比例為44.2%與對(duì)照組相比也存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。芯片篩選出差異表達(dá)基因121個(gè)（P＜0.05），其中有119個(gè)基因?qū)嶒?yàn)組的表達(dá)量是對(duì)照組的0.5倍以下，2個(gè)基因?qū)嶒?yàn)組的表達(dá)量是對(duì)照組的2倍以上。結(jié)論糖尿病小鼠的卵子與正常精子體外受精后發(fā)育到2-細(xì)胞的比例較對(duì)照組小鼠低，并且血糖值越高比例越低。由此說(shuō)明母體糖尿病環(huán)境能影響其卵子的生長(zhǎng)發(fā)育，并且這些影響可能是通過(guò)上調(diào)代謝相關(guān)基因和下調(diào)發(fā)育相關(guān)基因產(chǎn)生的。

鏈脲佐菌素（STZ）； 體外受精； 基因芯片； 差異表達(dá)

代謝疾病如肥胖癥、糖尿病和心血管疾病已成為一個(gè)世界范圍內(nèi)的社會(huì)和健康問(wèn)題，為深入研究這些疾病的發(fā)病機(jī)理，利用動(dòng)物模型進(jìn)行研究是有效途徑之一。作者前期實(shí)驗(yàn)表明，用正常ICR雄鼠與糖尿病模型雌鼠交配，受精率僅為46.9%，流產(chǎn)率高達(dá)73.9%，胚胎畸形率為9%，仔鼠出生死亡率為20%［1］。因此本實(shí)驗(yàn)采取體外受精的方法，排除母體本身在交配環(huán)節(jié)對(duì)受精率的影響著重研究高血糖母體對(duì)卵細(xì)胞的影響，并且這種影響是否持續(xù)到胚胎發(fā)育期。

研究認(rèn)為［2］，糖尿病胎兒發(fā)育異常與基因表達(dá)改變有關(guān)，糖尿病引起的神經(jīng)管缺失與神經(jīng)管表面的細(xì)胞凋亡有關(guān)，并觀察到糖尿病小鼠胚胎中腦和后腦的神經(jīng)管中Pax-3 mRNA表達(dá)明顯下降； 對(duì)鏈脲佐菌素（streptozotocin， STZ）誘發(fā)的大鼠糖尿病模型研究表明，12 d胚胎的卵黃囊細(xì)胞膜的損傷與細(xì)胞凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)通路的破壞有關(guān)， 發(fā)現(xiàn)卵黃囊細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bax蛋白表達(dá)上升，而細(xì)胞生存因子Akt酶活力下降［2］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)基因芯片的方法檢測(cè)高糖母體的體外受精胚胎中的一些基因表達(dá)情況，并與正常對(duì)照組進(jìn)行比較，研究糖尿病與這些基因表達(dá)的相關(guān)性，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供研究方向

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與環(huán)境條件

SPF級(jí)雌性ICR小鼠，6～8周齡，28～30 g，購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司［SCXK（滬）2008-0016］，飼養(yǎng)于上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心（上海市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站）屏障系統(tǒng)內(nèi)［SYXK（滬）2008-0056］， 密度≤5只/每盒， 溫度20℃～24 ℃，相對(duì)濕度40%～60%，喂以配方飼料，自由采食和飲水，自動(dòng)光控（12 h/12 h）。

1.2試劑及儀器

鏈脲佐菌素（STZ）、超促排卵所需激素（PMSG、hCG）、配置胚胎體外培養(yǎng)液HTF所需試劑、胚胎沖洗液M2均購(gòu)自Sigma公司；枸櫞酸鈉為國(guó)產(chǎn)分析純； 血糖試紙為羅氏公司產(chǎn)品；RNA抽取試劑盒（RNeasy Mini Kit）購(gòu)自Qiagen公司； 小鼠RNA表達(dá)譜芯片為Affymetrix Mouse 430 2.0芯片（上海伯豪生物技術(shù)有限公司，生物芯片上海國(guó)家工程研究中心）。另有羅氏羅康全活力型血糖測(cè)定儀（羅氏公司）； 紫外分光光度儀ND-1000（NanoDrop），Stemi2000C顯微解剖鏡（Zeiss公司）； Micro Galaxy CO2培養(yǎng)箱（60 mm×15 mm）（Becton Dickinson公司）； GeneChip?Scanner 3000 掃描儀（Cat#00-00212，Affymetrix， Santa Clara， CA， US）等。

1.3糖尿病動(dòng)物模型的建立

將實(shí)驗(yàn)小鼠分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組， 實(shí)驗(yàn)組30只，對(duì)照組15只。實(shí)驗(yàn)組用0.05 mmol/L pH 4.5 的無(wú)菌枸櫞酸鈉緩沖液配制成10 mg/mL的STZ溶液后按10 mL/kg體質(zhì)量的劑量腹腔注射（即小鼠腹腔注射STZ的劑量為100 mg/kg體質(zhì)量），對(duì)照組腹腔注射按10 mL/kg體質(zhì)量注射無(wú)菌枸櫞酸鈉緩沖液，1 周后按上述劑量再次腹腔注射實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠。將空腹血糖值9.5～15.5 mmol/L作為較高血糖模型小鼠， 血糖值＞15.5 mmol/L為高血糖小鼠， 觀察并記錄小鼠癥狀、體征和死亡情況。

1.4血清葡萄糖濃度和體質(zhì)量測(cè)定

每次注藥后一周測(cè)定實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠的血清葡萄糖濃度和體質(zhì)量，采用空腹尾尖采血，直接用血糖試紙測(cè)定。

1.5實(shí)驗(yàn)小鼠的超促排卵和體外受精

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠用6 IU PMSG和hCG進(jìn)行超排卵。注射hCG 14 h后， 小鼠脫臼處死。取出雌鼠的卵子與正常的ICR雄鼠的精子進(jìn)行體外受精。體外受精24 h后， 計(jì)數(shù)發(fā)育到2-細(xì)胞的胚胎。并將2-細(xì)胞胚胎轉(zhuǎn)移入正常的同期假孕雌鼠的輸卵管內(nèi)， 12.5 d后剖宮取14 d胚胎。由于高血糖組雌鼠體外受精后得到的2-細(xì)胞比較少，發(fā)育狀態(tài)也不佳，故未做移植。

1.614 d胚胎總RNA提取

分別提取10個(gè)實(shí)驗(yàn)組和10個(gè)對(duì)照組14 d胚胎總RNA， 操作按試劑盒進(jìn)行。紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA/DNA濃度（260 nm）， 經(jīng)紫外波譜掃描分析RNA/DNA純度，D260/D280值在2.0左右，D260/D230值＞D260/D280值，說(shuō)明核酸純度較高。

1.7芯片實(shí)驗(yàn)與數(shù)據(jù)分析

采用Affymetrix表達(dá)譜芯片配套試劑盒和標(biāo)準(zhǔn)操作流程對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組胚胎總RNA中的mRNA進(jìn)行放大、標(biāo)記和純化， 獲得帶有生物素（biotin）標(biāo)記的cRNA。按照Affymetrix表達(dá)譜芯片配套提供的雜交標(biāo)準(zhǔn)流程和配套試劑盒， 在滾動(dòng)雜交爐中16h滾動(dòng)雜交， 雜交完成后在洗滌工作站按照Affymetrix提供的標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行芯片的洗滌。芯片結(jié)果采用Gene Chip?Scanner 3000進(jìn)行掃描，用Command Console Software 3.1讀取原始數(shù)據(jù)， 質(zhì)控合格的數(shù)據(jù)采用Gene Spring Software 11.0進(jìn)行歸一化處理，所用的算法為MAS5.0?；虮磉_(dá)差異用差異倍數(shù)值（foldchange）表示， 差異基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)為差異倍數(shù)值≥2為上調(diào)基因， 差異倍數(shù)值≤0.5為下調(diào)基因。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)用Mean±SE表示， 采用SPSS19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。差異顯著性檢驗(yàn)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因子方差分析（one way ANOVA）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1糖尿病模型

對(duì)實(shí)驗(yàn)組30只雌性小鼠第一次注射STZ后一周，小鼠血糖與對(duì)照組無(wú)明顯差異， 體質(zhì)量小幅下降（圖1），不表現(xiàn)多飲、多食、多尿， 活動(dòng)正常； 第二次注射STZ后1周， 76.6%的小鼠血糖值≥9.5 mmol/L， 其間表現(xiàn)多飲、多食、多尿， 活動(dòng)減少， 體質(zhì)量下降明顯（圖1）， 沒(méi)有出現(xiàn)小鼠死亡。由圖2可見(jiàn)， 63.3%小鼠血糖值（12.08±0.47 mmol/L， n=19）明顯升高， 較對(duì)照組（6.16±0.24 mmol/L， n=15）有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001）， 其中13.3%小鼠血糖值＞15.5 mmol/L （n=4）。

2.2實(shí)驗(yàn)小鼠體外受精后的2-細(xì)胞比例

由圖3可見(jiàn)，模型小鼠超排卵子與正常雄鼠的精子體外受精后， 卵子的個(gè)數(shù)較正常小鼠少， 并且發(fā)育到2-細(xì)胞的個(gè)數(shù)較少。由表1可見(jiàn)，較高血糖組小鼠超排后卵子與正常雄鼠的精子體外受精后，發(fā)育到2-細(xì)胞的比例為52.6%， 較對(duì)照組72.1%有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），高血糖組小鼠超排后卵子與正常雄鼠的精子體外受精后，發(fā)育到2-細(xì)胞的比例為43.3%，較對(duì)照組亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。

2.3芯片雜交

共檢測(cè)了45 101個(gè)點(diǎn)， 檢出25 978個(gè)點(diǎn)， 檢出率為57.6%， 圖4為基因芯片雜交信號(hào)強(qiáng)度的散點(diǎn)圖。X軸、Y軸分別以實(shí)驗(yàn)組g1和對(duì)照組g2的熒光強(qiáng)度值為坐標(biāo)， 每一個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)代表芯片上一個(gè)基因點(diǎn)的雜交信號(hào)， 數(shù)據(jù)點(diǎn)顏色越紅表示雜交信號(hào)越強(qiáng)

2.4差異基因分析

共檢出差異表達(dá)基因121個(gè)（P＜0.05），其中有119個(gè)基因表達(dá)量下調(diào)，2個(gè)基因表達(dá)量上調(diào)。這些基因包括發(fā)育因子、細(xì)胞因子、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、代謝酶、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、免疫調(diào)節(jié)因子和一些Cdna（圖5）。發(fā)現(xiàn)部分差異基因與胚胎發(fā)育和代謝有關(guān)，部分基因如表2示，另觀察到一些印跡基因在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組表達(dá)有差異（表3）。

圖1　小鼠體質(zhì)量變化平均值Figure 1 Average value about weight change in treated mice

圖2　STZ處理后實(shí)驗(yàn)小鼠血糖平均值Figure 2 Average value about blood glucose levels in treated mice

圖3　實(shí)驗(yàn)組（左圖）與對(duì)照組（右圖）單只母鼠卵細(xì)胞體外受精后的2-細(xì)胞胚胎（× 80）Figure 3 Two-cell embryos of treated group （left） and control group （right） after in vitro fertilization（× 80）

表1　實(shí)驗(yàn)小鼠體外受精后的受精率Table 1 The ratio of fertilization after in vitro fertilization

圖4　胚胎的熒光強(qiáng)度值Figure 4 Fluorescence intensity value of the embryo

圖5　胚胎差異基因功能分布圖Figure 5 Distribution figure of embryo's different genes function

表2　胚胎部分差異顯著基因簡(jiǎn)略表Table 2 Brief table of partial embryo's different expression genes

3　討論

前期實(shí)驗(yàn)表明，用正常的雄性小鼠與糖尿病雌鼠交配，其受精率可能與母體的高血糖有關(guān)［1］。因此本實(shí)驗(yàn)采取體外受精的方法，排除母體環(huán)境對(duì)受精率的影響，而主要研究高血糖的母體對(duì)卵細(xì)胞的影響。將模型小鼠用PMSG和hCG超促排卵后，與正常精子進(jìn)行體外受精， 經(jīng)過(guò)24 h的體外培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)模型小鼠的胚胎發(fā)育到2-細(xì)胞的比例明顯低于對(duì)照組的小鼠，且血糖越高比例越低，這可能與母體的高血糖有關(guān)。林錕等研究了高血糖對(duì)卵母細(xì)胞和早期胚胎細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果表明糖尿病小鼠的卵泡破裂和卵母細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)間都比正常小鼠延遲，卵母細(xì)胞大小較正常明顯減?。?］。體外細(xì)胞培養(yǎng)亦觀察到高濃度葡萄糖環(huán)境下排卵后卵母細(xì)胞培養(yǎng)存活率下降，提示高糖對(duì)卵母細(xì)胞存在著一定的細(xì)胞毒性作用，母體的高血糖對(duì)其卵子的發(fā)育是有不良影響的［4］。本實(shí)驗(yàn)將模型小鼠的卵子與正常小鼠的精子體外受精，發(fā)現(xiàn)受精率偏低，鑒于精子是正常的，排除精子對(duì)受精率的影響后，表明受精率偏低主要是由于卵子質(zhì)量下降引起的。本實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)果和林錕等研究是一致的，而且是從胚胎發(fā)育學(xué)角度來(lái)證明高糖對(duì)卵母細(xì)胞存在著一定的細(xì)胞毒性作用，并為其提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

表3　胚胎印跡基因表達(dá)差異Table 3 Different expression of placenta's imprinting genes

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)基因芯片檢測(cè)出差異表達(dá)基因121個(gè)， 其中有119個(gè)基因表達(dá)量下調(diào)， 2個(gè)基因表達(dá)量上調(diào)。其中差異較明顯的印跡基因有Xist、Xlr4c、Grb10（growth factor receptor-bound protein 10）、Meg3、Impact、Gab1、Sgce、Phlda2等。X染色體失活特異轉(zhuǎn)錄物（X inactive transcript， Xist）是母源印跡基因，它是一種非編碼的RNA。Xist基因在X染色體失活過(guò)程中起著關(guān)鍵性作用［5］，Xist的表達(dá)為雌性胚胎發(fā)育過(guò)程中X染色體失活的起始和劑量補(bǔ)償所必需。印跡基因Grb10為母源等位基因表達(dá)，Grb10基因干擾導(dǎo)致小鼠胚胎及胎盤(pán)的過(guò)渡生長(zhǎng)，以致出生時(shí)胎兒及胎盤(pán)均比正常的大30%左右，說(shuō)明Grb10是強(qiáng)大的生長(zhǎng)抑制劑［6，8］。在小鼠上，Gab1基因定位于染色體8C31，Gab1在小鼠的胚胎期就開(kāi)始表達(dá)，利用基因敲除研究Gab1的基因功能顯示， Gab1基因敲除小鼠于胚胎期12.5～17.5 d死亡，并表現(xiàn)出胎盤(pán)、心臟、皮膚等多器官發(fā)育障礙［7，9］。Sgce （Epsilon-Sarcoglycan） 基因是父源等位基因表達(dá)，Sgce基因在早期和晚期胎盤(pán)中呈現(xiàn)組成性的高表達(dá)，且Sgec基因純合性缺失的小鼠胚胎由于無(wú)法著床而死去，提示該基因的表達(dá)產(chǎn)物可能在細(xì)胞增殖、分化和滋養(yǎng)層細(xì)胞侵入子宮壁的過(guò)程中，對(duì)細(xì)胞之間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起著重要作用［10］。Phlda2在胎盤(pán)中是父源印跡、母源表達(dá)的基因，表達(dá)于人胎盤(pán)絨毛的細(xì)胞滋養(yǎng)層及小鼠胎盤(pán)迷路滋養(yǎng)層。Phlda2通過(guò)參與不同滋養(yǎng)層細(xì)胞間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，使各滋養(yǎng)層按比例協(xié)調(diào)生長(zhǎng)，維持胎盤(pán)功能的穩(wěn)定［11］。Phlda2基因敲除的小鼠，胎盤(pán)過(guò)度增生，但以海綿滋養(yǎng)層增生為主，母-胎營(yíng)養(yǎng)傳遞的關(guān)鍵部位一迷路滋養(yǎng)層的比例相對(duì)減少，且胎盤(pán)毛細(xì)血管數(shù)量減少［11］。

上述幾個(gè)印跡基因與胚胎和胎盤(pán)的發(fā)育密切相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)中小鼠母體的高血糖環(huán)境可能是引起這些基因異常表達(dá)的重要原因之一，因?qū)嶒?yàn)設(shè)置了同樣進(jìn)行體外受精的對(duì)照組，故胚胎體外操作的影響可以忽略不計(jì)。這些基因的異常表達(dá)是否引起胚胎發(fā)育乃至成年期以后的異常，將通過(guò)后續(xù)研究進(jìn)行驗(yàn)證。通過(guò)篩選出這些差異基因，為進(jìn)一步研究糖尿病影響胚胎的遺傳發(fā)育和代謝性疾病的分子機(jī)理提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

［1］邵偉娟， 陶凌云， 趙茹茜， 等. 不同劑量STZ 誘導(dǎo)小鼠糖尿病模型及生殖能力的研究［J］. 上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)： 農(nóng)業(yè)科學(xué)版， 2007， 25（6）：541-546.

［2］Sun FY， Kawasakia E， Akazawac S. Apoptosis and its pathway in early post-implantation embryos of diabetic rats Diabetes ［J］. diabetes Res Clin Pract， 2005， 67（2）：110-118.

［3］Vesela J， Cikos S， Hlinka D， et al. Effects of impaired insulin secretion on the fertilization of mouse oocytes ［J］. Hum Reprod， 1995， 10（12）：3233- 3236.

［4］林錕. 高血糖對(duì)卵母細(xì)胞和早期胚胎細(xì)胞凋亡的影響［J］.醫(yī)學(xué)綜述， 2009， 15（19）：2932-2934.

［5］Okamura K， Wintle RF， Scherer SW. Characterization of the differentially methylated region of the Impact gene that exhibits Glires-specific imprinting［J］. Genome Biol， 2008， 9 （11）：160-170.

［6］劉齊， 王燕， 陳巖， 等. Grb10 基因在小鼠胚期特異性表達(dá)分析［J］. 遺傳， 2009， 31（7）：732-740.

［7］胥傳飛， 盧晟盛， 王友亮， 等. 接頭蛋白Gabl的結(jié)構(gòu)及功能研究進(jìn)展［J］. 生物技術(shù)通訊， 2009， 20（6）：839-842.

［8］Shiura H， Nakamura K， Hikichi T， et al. Paternal deletion of Meg1/Grb10 DMR causes maternalizationof the Meg1/ Grb10 cluster in mouse proximal chromosome11 leading to severe pre- and postnatal growth retardation［J］. Hum Mol Genet， 2009， 18（8）：1424-1438.

［9］Park CH， Uh KJ， Mulligan BP， et al. Analysis of imprinted gene expression in normal fertilized and uniparental preimplantation porcine embryos［J］. PLoS One， 2011， 6（7）：e22216.

［10］ Frank D， Fortino W， Clark L， et al. Placental over growth in mice lacking the imprinted gene IPI［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 2002， 99（11）：7490-7495.

［11］ Himes KP， Koppes E， Chaillet JR. Generalized disruption of inherited genomic imprints leads to wide-ranging placental defects and dysregulated fetal growth ［J］. Dev Biol， 2013， 373 （1）：72-82.

Effect of Maternal Diabetic Environment on Development of Early Mouse Embryo by in vitro Fertilization

QIAANG Su jing1， TAO Ling-yun2， LIU Li-jun1， XU Ping1，3， GAO Cheng2
（1. Shanghai SLAC Laboratory Animal Ltd. Co.， Shanghai 201615 China；2. Shanghai Laboratory Animal Research Center， Shanghai 201203， China；3. Shanghai Institute for Biological Sciences， Chinese Academy of Sciences， Shanghai 201615， China）

ObjectiveThe experimental mice were induced to be diabetes mellitus （DM） mice through streptozotocin （STZ） intraperitoneal injection， in order to study the effect of maternal hyperglycemia on early mouse embryo development by in vitro fertilization. MethodsICR mice aged 6～8 weeks were intraperitoneally injected with STZ to established DM models， and the normal mice were considered as control group . The model mice were superovulated by intraperitoneal injection with PMSG and hCG， then the oocytes were fertilized with sperms from normal male mice in vitro. The rates of fertilization were counted and 2-cell embryos were transferred to pseudopregnant mice. Finally 14-dold embryos were obtained to extract. total RNA. After detected by Agilent 2100 Bioanalyzer system，total RNA were reversed transcription， labeled， hybridized， eluted and the data of microarray was scanned by Affymetrix Scanner 3000. Basic data were read by Command Console Software 3.1. The experiments were repeated three times， then the expression of genes between treated group and control group were compared. ResultsThe ratio of two-cell embryo in hyperglycemia group （52.3%）， was significantly lower than that in the control group （77.2%） （P＜0.01）. A total of 121 differentially expressed genes （P＜0.05） were screened out. One hundred and nineteen genes expression levels of the experimental group was less 0.5 times than those of the control group， while 2 genes showed a more than 2-fold up regulation. ConclusionAfter oocytes of model mice fertilizing with sperms of normal male mice in HTF， the rate of embryo developing to two-cell was lower than normal mice. The higher of blood glucose level， the lower of two-cell rate. The growth and development of the oocytes were affected by maternal diabetes environment through up-regulating the metabolism-related genes and down-regulated development-relating genes .

Streptozotocin（STZ）； In vitro fertilization； Microarray； Differentially expression

Q95-33

A

1674-5817（2015）02-0155-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.02.014

2014-06-30

上海市科委“創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃”重點(diǎn)項(xiàng)目（10140900700）； 國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題（2013BAK11B02）

強(qiáng)蘇靜（1987-）， 女， 碩士研究生， 研究方向： 動(dòng)物學(xué)。liyang_sujing@163.com

高誠(chéng)， 研究員。E-mail： gaochengdgb@126.com