金納米粒的綠色合成及其在銅離子檢測中的應(yīng)用

何紫君，石國榮，劉雅婷，張建輝，陳方來，廖全瑤

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，湖南 長沙410128；2.湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖南 長沙410111）

銅是人體必需的微量元素，在調(diào)節(jié)體內(nèi)多種生理活動(dòng)中發(fā)揮著十分重要的作用，但體內(nèi)銅過量也會對腎臟等器官造成危害[1］。因此，建立一種快速、準(zhǔn)確且靈敏地檢測食品中Cu2＋的方法具有十分重要的意義。

納米金具有良好的穩(wěn)定性和獨(dú)特的生物相容性，其小尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)和光學(xué)效應(yīng)使其在生物醫(yī)藥[2－4］、分析檢測[5－10］和催化[11］等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景?；瘜W(xué)還原法是目前廣泛應(yīng)用的金納米材料制備方法，即在保護(hù)劑聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等高聚物及十二烷基苯磺酸鈉、十六烷基三甲基溴化銨等離子型表面活性劑的存在下，通過加入硼氫化鈉、檸檬酸鈉、殼聚糖和抗壞血酸等還原劑還原金的化合物。此法能在短時(shí)間內(nèi)還原出大量的金納米粒子，并通過保護(hù)劑的保護(hù)作用抑制其團(tuán)聚[12－13］，但在合成過程中具有很大的環(huán)境和生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。以細(xì)菌[14］、放線菌[15］、真菌[16］和植物提取物[17］等為還原劑的環(huán)境友好的綠色合成方法是合成金納米粒（AuNPs）的發(fā)展趨勢。

近年來，基于Cu2＋對AuNPs的熒光猝滅作用建立的微量Cu2＋的熒光猝滅測定法引起了廣泛關(guān)注。Chen等[18］以谷胱甘肽（GSH）為穩(wěn)定劑和還原劑，在室溫下與氯金酸反應(yīng)4d合成了谷胱甘肽－金納米簇（GSH－AuNCs），建立了微量Cu2＋的檢測方法。張浩琪等[19］采用高溫加熱法，在90℃下將GSH與氯金酸加熱回流5h合成了具有較好熒光性能的GSHAuNCs，建立了檢測自來水和湖水中Cu2＋含量的新方法。Xie等[20］采用綠色合成法，以牛血清白蛋白（BSA）為穩(wěn)定劑和還原劑合成了具有紅色熒光的AuNCs。Durgadas等[1］利用 Cu2＋與包 覆 在 BSAAuNCs表面的BSA結(jié)合所導(dǎo)致的熒光猝滅現(xiàn)象成功檢測了活細(xì)胞中的Cu2＋。作者采用綠色合成方法，以改性酵母細(xì)胞為還原劑，在不額外加入穩(wěn)定劑的情況下，于水溶液中還原氯金酸，合成了具有較好熒光性能的AuNPs，基于Cu2＋對該AuNPs的熒光猝滅作用，建立了一種快速靈敏分析微量Cu2＋的方法，并已成功用于檢測食品中的微量Cu2＋。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

氯金酸（HAuCl4·4H2O，Au含量為47.8%）、NaOH、CuSO4、NaH2PO4、Na2HPO4均為分析純；經(jīng)過自溶處理后的改性酵母細(xì)胞凍干物；實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

F－2500型熒光分光光度計(jì)、UV－2450型雙光束紫外分光光度計(jì)、XRD－6000型X－射線衍射儀，Shimadzu公司；iCAPQ型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP－MS），Thermo Fish Scientific公司；PHS－3B 型pH 計(jì)，上海精科儀器有限公司；HZQ－C型空氣浴振蕩器，哈爾濱東明醫(yī)療儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 AuNPs的制備

將100mg改性酵母細(xì)胞、2mmol·L－1的HAuCl4溶液和0.5mol·L－1的NaOH溶液充分混勻后，置于37℃空氣浴振蕩器中反應(yīng)7d。在3 000r·min－1條件下離心10min，上清液用水定容至50 mL，4℃保存?zhèn)溆谩Ｔ揂uNPs溶液能穩(wěn)定存放3個(gè)月以上，ICP－MS測得 Au含量為21.0mg·L－1。

1.2.2 Cu2＋的測定

將AuNPs溶液用50mmol·L－1PBS緩沖溶液稀釋5倍，取0.50mL于10mL比色管中，加入1.00 mL Cu2＋溶液，用50mmol·L－1PBS緩沖溶液定容至5mL，混勻，室溫下反應(yīng)30min。以311nm為激發(fā)波長、398nm為發(fā)射波長測定熒光強(qiáng)度（F），在相同條件下測定試劑空白的熒光強(qiáng)度（F0）。計(jì)算相對熒光強(qiáng)度（F／F0）。

1.2.3 樣品中Cu2＋含量的測定

稱取一定量的大米或豆干樣品，加入1mL濃硝酸，經(jīng)過炭化、灰化后轉(zhuǎn)入580～600℃馬弗爐中灼燒至灰白色，加水溶解，必要時(shí)滴加10%的硝酸。完全溶解后轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中，用水定容，得食品樣品溶液，備用。

取食品樣品溶液0.50mL于10mL比色管中，按照1.2.2方法分別測定熒光強(qiáng)度F和F0，計(jì)算F／F0值，根據(jù)AuNPs的熒光猝滅標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中Cu2＋含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 AuNPs的表征

2.1.1 AuNPs的紫外可見（UV－Vis）光譜

在改性酵母細(xì)胞和HAuCl4的混合溶液中加入NaOH溶液后，立即變?yōu)樽仙?。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，溶液逐漸變?yōu)樯罴t色，其UV－Vis光譜如圖1所示。

圖1 不同反應(yīng)時(shí)期金納米粒溶液的UV－Vis光譜Fig.1 UV－Vis Absorption spectra of gold nanoparticles solution prepared for different periods of time

由圖1可以看出，反應(yīng)0.5h后，溶液在520nm附近出現(xiàn)較明顯的金納米粒等離子特征吸收峰，表明形成了金納米粒[17］。在相同條件下，以改性酵母細(xì)胞水提取液代替改性酵母細(xì)胞反應(yīng)7d，溶液顏色始終未變，說明該金納米粒是由酵母細(xì)胞合成后，從細(xì)胞上脫落而來。

2.1.2 AuNPs的X－射線衍射（XRD）圖譜（圖2）

圖2 金納米粒的XRD圖譜Fig.2 XRD Pattern of gold nanoparticles

由圖2可以看出，2θ為38.26°、44.50°、64.62°和77.68°的衍射峰分別對應(yīng)于金的（111）、（200）、（220）和（311）晶面，表明該金納米粒為面心立方結(jié)構(gòu)[15］。根據(jù) Scherrer公式 D＝0.94λ／β1／2計(jì) 算，其粒徑為25.53nm。

2.1.3 AuNPs的熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜（圖3）

圖3 金納米粒的熒光激發(fā)光譜（a）和發(fā)射光譜（b）Fig.3 Fluorescence excitation（a）and emission（b）spectra of gold nanoparticles

由圖3可以看出，AuNPs的最大激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為311nm和398nm。

2.2 Cu2＋檢測的條件優(yōu)化

2.2.1 緩沖溶液pH值的影響（圖4）

由圖4可以看出，緩沖溶液pH值顯著影響Cu2＋對AuNPs的熒光猝滅作用。當(dāng)pH值為11.5時(shí)，體系的F／F0值最小，表明當(dāng)緩沖溶液的pH值為11.5時(shí)，Cu2＋對AuNPs的熒光猝滅作用最強(qiáng)。

圖4 pH值對Cu2＋猝滅金納米粒熒光強(qiáng)度的影響Fig.4 Effect of pH value on the fluorescence quenching of gold nanoparticles induced by Cu2＋

2.2.2 緩沖溶液濃度的影響

當(dāng)Cu2＋濃度為0.2μg·mL－1、pH 值為11.5時(shí)，PBS緩沖溶液濃度對Cu2＋猝滅AuNPs熒光強(qiáng)度的影響如圖5所示。

圖5 PBS緩沖溶液濃度對Cu2＋猝滅金納米粒熒光強(qiáng)度的影響Fig.5 Effect of PBS concentration on the fluorescence quenching of gold nanoparticles induced by Cu2＋

由圖5可以看出，當(dāng)PBS緩沖溶液濃度為50 mmol·L－1時(shí)，體系的F／F0值最小，說明濃度為50 mmol·L－1的PBS緩沖溶液最有利于Cu2＋猝滅AuNPs的熒光。

2.2.3 反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間的影響

在pH值為11.5的50mmol·L－1PBS緩沖溶液中，0.2μg·mL－1Cu2＋在20℃、30℃、40℃和50℃下對AuNPs的熒光猝滅程度相差很小，即反應(yīng)溫度對Cu2＋猝滅AuNPs熒光強(qiáng)度的影響很小。故選擇在室溫下進(jìn)行測定。

室溫下，反應(yīng)時(shí)間對Cu2＋猝滅AuNPs熒光強(qiáng)度的影響如圖6所示。

由圖6可以看出，在室溫下，加入Cu2＋后，體系熒光強(qiáng)度會急劇下降，30min后，體系熒光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定。因此，選擇反應(yīng)30min后進(jìn)行測定。

2.2.4 共存離子的影響

圖6 反應(yīng)時(shí)間對Cu2＋猝滅金納米粒熒光強(qiáng)度的影響Fig.6 Effect of reaction time on the fluorescence quenching of gold nanoparticles induced by Cu2＋

當(dāng)測定誤差不超過5%時(shí)，1 000倍As5＋和Li＋、500倍 K＋、150倍 Ca2＋和 Cd2＋、100倍Ba2＋、Sn2＋和Zn2＋、50 倍 Pb2＋和 Mg2＋、5 倍 Mn2＋、Al3＋、Fe3＋、Fe2＋、Hg2＋、Co2＋和 Ni＋及等量的 Cr3＋不會干擾0.2 μg·mL－1Cu2＋的檢測。

2.2.5 檢測的線性范圍

室溫下，在pH 值為11.5的50mmol·L－1的PBS緩沖溶液中，AuNPs的熒光強(qiáng)度隨Cu2＋濃度的增大而減弱。當(dāng)Cu2＋濃度在0.001～0.2μg·mL－1范圍內(nèi)時(shí)，AuNPs的熒光猝滅程度與Cu2＋濃度（c）呈良好的線性關(guān)系，其回歸方程為F／F0＝0.0421＋0.7749c，相關(guān)系數(shù)為0.9980。

2.3 樣品檢測

為了考察該方法在實(shí)際樣品分析中的應(yīng)用，按照1.2.3方法測定了大米和豆干標(biāo)樣中Cu2＋的含量，5次平行測定的結(jié)果如表1 所示。

表1 食品中Cu2＋含量的測定（n＝5）Tab.1 Determination of Cu2＋in food products（n＝5）

由表1 可知，2種食品樣品5次測定的相對誤差分別為－4.2%和－0.71%，而變異系數(shù)均小于5%，表明該方法的準(zhǔn)確度和精密度能夠滿足食品分析的要求，可用于食品中微量Cu2＋的檢測。

3 結(jié)論

在水相中以改性酵母細(xì)胞為穩(wěn)定劑和還原劑合成了穩(wěn)定性好且具有較好熒光性能的AuNPs。該合成方法綠色環(huán)保，無需添加除了金前驅(qū)體和NaOH以外的其它化學(xué)試劑?；贑u2＋對AuNPs的熒光猝滅作用，建立了一種快速靈敏地檢測微量Cu2＋的新方法，Cu2＋濃度在0.001～0.2μg·mL－1范圍內(nèi)，AuNPs的熒光猝滅程度與Cu2＋濃度間呈良好的線性關(guān)系。已成功用于檢測大米和豆干等食品中的微量Cu2＋。

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