• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    一株石油烴降解菌的固定化及其降解特性研究

    2016-01-05 08:05:45盧方斌,李榮超,張蕾
    化學(xué)與生物工程 2015年11期
    關(guān)鍵詞:耐鹽

    一株石油烴降解菌的固定化及其降解特性研究

    盧方斌,李榮超,張蕾,王君

    (濱州學(xué)院生命科學(xué)系,山東 濱州 256600)

    摘要:從石油污染鹽漬土壤中篩選出一株對液蠟乳化效果明顯、對原油降解率達(dá)56.8%的菌株,命名為BZ-L。經(jīng)生理生化和16S rRNA序列分析,初步鑒定該菌株屬于沙雷氏菌屬。以海藻酸鈉和活性炭為包埋劑,對該菌株進(jìn)行固定化研究。結(jié)果表明,當(dāng)活性炭含量為0.8%時,固定化微球的破損率最低、滲透性最好;在接種量為35.0 g·L-1、NaCl濃度為6.0%時,固定化微球?qū)υ偷慕到饴士蛇_(dá)61.7%;菌株BZ-L的固定化微球?qū)υ偷慕到饴拭黠@高于游離菌,且比游離菌的耐鹽性能更強,可用于石油污染鹽漬土壤的生物修復(fù)。

    關(guān)鍵詞:石油烴降解菌;固定化微球;降解特性;耐鹽

    基金項目:國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃(201310449146),山東省科學(xué)技術(shù)發(fā)展計劃資助項目(2011YD21005)

    收稿日期:2015-06-02

    作者簡介:盧方斌(1993-),男,山東濟寧人,研究方向:微生物修復(fù)研究,E-mail:mxzlushang@126.com;通訊作者:王君,副教授,E-mail:ivywangjun@163.com。

    doi:10.3969/j.issn.1672-5425.2015.11.013

    中圖分類號:X 172文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

    在石油污染土壤或水體的修復(fù)技術(shù)中,微生物修復(fù)技術(shù)因安全、高效、不產(chǎn)生二次污染等優(yōu)點成為人們處置石油污染的重要手段[1-3]。土壤中的某些土著微生物可以降解原油,但由于單位菌濃度較低或受環(huán)境因素的影響,并不能很好地降解原油。固定化微生物技術(shù)是一種高效、可重復(fù)、不產(chǎn)生二次污染的治理技術(shù),具有微生物單位密度大、微生物流失少、抗外界脅迫能力強、產(chǎn)物易分離、反應(yīng)過程易控制的優(yōu)點[4-6]。

    關(guān)于石油降解菌的固定化技術(shù)已有報道,固定化手段和材料豐富多樣[7-9]。關(guān)曉燕等[10]報道了以聚氨酯泡沫為載體制備固定化菌的研究,在120 h內(nèi)該菌株對柴油的降解率達(dá)85%;單海霞等[11]以硅藻土/活性炭作為降解菌群的固定化載體,對最佳固定化條件進(jìn)行研究,其固定化菌群對柴油的平均降解率達(dá)65%。作者從黃河三角洲地區(qū)石油污染鹽漬土壤中分離篩選出一株耐鹽降解烴的菌株,采用包埋法對該菌株進(jìn)行了固定化研究,并測定了固定化微球?qū)υ偷慕到庑Ч湍望}程度。

    1實驗

    1.1 材料和培養(yǎng)基

    土壤樣品采自黃河三角洲濱州石油開采區(qū);原油來自勝利油田孤東采油廠。

    無機鹽培養(yǎng)基(g·L-1):(NH4)2SO44,NaH2PO41.5,K2HPO43.48,MgSO40.7。自然pH值,121 ℃滅菌30 min。

    富集培養(yǎng)基:在無機鹽培養(yǎng)基中添加液蠟2%(v/v)。

    降解培養(yǎng)基:在無機鹽培養(yǎng)基中添加原油0.5%(w/v)。

    牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(g·L-1):牛肉膏3,蛋白胨5,NaCl 5。pH值7.2,121 ℃滅菌30 min。

    1.2 石油降解菌的富集和分離純化

    將2 g土壤樣品加入200 mL富集培養(yǎng)基中,160 r·min-1、37 ℃下振蕩培養(yǎng)5 d后,以10%接種量轉(zhuǎn)接至新的富集培養(yǎng)基中培養(yǎng),連續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)數(shù)次。將富集培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋,涂布于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上培養(yǎng),挑取單菌落分別接種至富集培養(yǎng)基中,選取對液蠟乳化良好的菌株進(jìn)行下一步研究。

    1.3 菌種的鑒定

    1.3.1生理生化特征鑒定

    菌株的生理生化特征鑒定參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[12]。

    1.3.2菌株的16S rRNA分析

    用試劑盒提取已篩選菌的DNA,利用細(xì)菌16S rRNA基因通用引物27F和1492R擴增基因序列[13]。PCR反應(yīng)體系的反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,30個循環(huán);72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后送北京三博遠(yuǎn)志公司測序,測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST比對。利用Clustal 2.0和Mega 4.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

    1.4 固定化菌株的構(gòu)建

    1.4.1細(xì)胞懸液的制備

    將得到的石油降解菌株接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中,37 ℃恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)18 h,培養(yǎng)液于8 000 r·min-1離心5 min,沉淀加入無菌水重懸,使菌懸液中的細(xì)胞濃度為1.2×108個·mL-1,保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.4.2固定化微球的制備

    采用注射器滴落法制備固定化微球[14]。稱取0.7 g海藻酸鈉放入50 mL的燒杯中,加入10 mL水后用酒精燈加熱,邊加熱邊攪拌至海藻酸鈉完全溶化,用蒸餾水定容至10 mL。將溶化好的海藻酸鈉溶液冷卻到室溫,加入已制備好的細(xì)胞懸液和終含量分別為0.0%、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%的活性炭粉末,充分?jǐn)嚢枋蛊浠旌暇鶆?,再轉(zhuǎn)移至注射器中,以恒定的速度緩慢地將注射器中的溶液滴加到濃度為0.05 mol·L-1的CaCl2溶液中(CaCl2溶液需提前放入冰槽內(nèi))。反應(yīng)完成后將固定化微球取出,用生理鹽水洗滌,備用。

    1.5 固定化微球物理性能的測定

    1.5.1固定化微球的破損率

    隨機取活性炭含量分別為0.0%、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%的固定化微球各50顆,放入裝有100 mL蒸餾水的250 mL錐形瓶中,置于37 ℃、160 r·min-1恒溫?fù)u床中振蕩72 h,記錄微球的破碎顆數(shù)并計算破損率。

    1.5.2固定化微球的滲透性

    隨機取活性炭含量分別為0.0%、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%的固定化微球浸入墨水中,每隔 4 min 取球剖開,直到微球被墨水完全滲透為止[15],記錄所需的時間。

    1.6 固定化微球?qū)υ偷慕到?/h2>

    1.6.1接種量對原油降解率的影響

    分別向降解培養(yǎng)基中接種5.0 g·L-1、15.0 g·L-1、25.0 g·L-1、30.0 g·L-1、35.0 g·L-1、40.0 g·L-1的固定化微球,在37 ℃下振蕩培養(yǎng)10 d,測定原油降解率。

    1.6.2固定化微球?qū)aCl的耐受性

    配制NaCl濃度分別為0.5%、1.0%、2.0%、4.0%、6.0%、10.0%、15.0%的降解培養(yǎng)基,以35.0 g·L-1的接種量加入固定化微球,37 ℃下振蕩培養(yǎng)10 d,測定原油降解率,以游離菌株作為對照。

    1.7 原油降解率的測定

    由于固定化載體材料表面會吸附原油,簡單的萃取并不能將原油全部萃出。首先向原油培養(yǎng)基中加入50 mL正己烷,用膠塞緊塞瓶口,充分振蕩,萃取培養(yǎng)液中殘留原油,然后把固定化微球取出,用正己烷作溶劑進(jìn)行索氏抽提,最后合并兩部分含油溶液,用紫外分光光度法測定原油降解率[16]。

    2結(jié)果與討論

    2.1 菌種的篩選及分離

    經(jīng)富集培養(yǎng),從石油污染鹽漬土壤中篩選得到一株石油烴降解菌,命名為BZ-L。該菌株對液蠟具有明顯的乳化效果(圖1),且在NaCl濃度為4.0%時,對原油的降解率達(dá)到56.8%。

    A.實驗組 B.對照組 圖1 菌株BZ-L對液蠟的乳化 Fig.1 Emulsification of liquid paraffin by strain BZ-L

    2.2 菌株BZ-L的分類鑒定

    將菌株BZ-L接種在牛肉膏蛋白胨固體平板上,37 ℃下培養(yǎng)48 h,菌落呈橘紅色,圓形,邊緣整齊,表面光滑不透明,易挑??;革蘭氏染色為陰性,菌體呈短桿狀,兩端鈍圓。該菌株可利用葡萄糖、蔗糖、D-果糖發(fā)酵產(chǎn)酸,不能利用D-阿拉伯糖、D-木糖發(fā)酵產(chǎn)酸;不能利用尿素、精氨酸產(chǎn)生硫化氫;甲基紅、丙二酸、明膠、酯酶、檸檬酸鹽、賴氨酸脫氫酶、鳥氨酸脫氫酶、V-P反應(yīng)均為陽性。

    將擴增得到的 16S rRNA 基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對,發(fā)現(xiàn)菌株 BZ-L跟粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)的同源性最近,相似度達(dá)99%。采用Clustal 2.0和Mega 4.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,見圖2。

    圖2 菌株BZ-L與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹 Fig.2 Phylogenetic trees of BZ-L and related strains

    根據(jù)生理生化特征和16S rRNA序列分析,初步鑒定菌株BZ-L屬于沙雷氏菌屬。

    2.3 固定化微球物理性能的測定

    2.3.1固定化微球的破損率(圖3)

    圖3 活性炭含量對固定化微球破損率的影響 Fig.3 The effect of content of activated carbon on damage rate of immobilized microspheres

    由圖3可知,當(dāng)活性炭含量在0.0%~0.8%之間時,固定化微球的破損率隨著活性炭含量的增加而下降,這是由于活性炭可以提升固定化微球的韌性;而當(dāng)活性炭含量大于0.8%后,微球的破損率上升,可能是由于活性炭的過多加入導(dǎo)致固定化微球空隙過大、松散。

    2.3.2固定化微球的滲透性(圖4)

    圖4 活性炭含量對固定化微球滲透性的影響 Fig.4 The effect of content of activated carbon on permeability of immobilized microspheres

    由圖4可知,當(dāng)活性炭含量為0.8%時,固定化微球的滲透時間為16 min;再增加活性炭含量,固定化微球的滲透時間幾乎保持不變。因此,選取固定化微球中活性炭含量為0.8%。

    2.4 固定化微球?qū)υ偷慕到馓匦?/h2>

    2.4.1接種量對原油降解率的影響(圖5)

    圖5 接種量對原油降解率的影響 Fig.5 The effect of inoculation amount on degradation rate of crude oil

    由圖5可知,隨著接種量的增大,固定化微球?qū)υ偷慕到饴什粩嗌?;?dāng)接種量達(dá)到35.0 g·L-1時,

    固定化微球?qū)υ偷慕到饴蔬_(dá)到58.3%;再增大接種量,固定化微球?qū)υ偷慕到饴史炊陆怠?/p>

    2.4.2固定化微球?qū)aCl的耐受性(圖6)

    圖6 固定化微球和游離菌在不同NaCl濃度下對原油的降解率 Fig.6 Degradation rates of crude oil by immobilized microspheres and free strains in presence of different concentrations of NaCl

    由圖6可知,固定化微球在NaCl濃度為6.0%時,對原油的降解率最高,達(dá)到61.7%;而游離菌在NaCl濃度為4.0%時,對原油的降解率最高,為56.8%;當(dāng)NaCl濃度高達(dá)10.0%以上時,游離菌和固定化微球都對原油有一定的降解,并且在相同NaCl濃度下,固定化微球?qū)υ偷慕到庑Ч黠@好于游離菌。

    3結(jié)論

    從黃河三角洲石油污染的鹽漬土壤中分離得到一株石油烴降解菌BZ-L,初步鑒定為沙雷氏菌屬。用海藻酸鈉和活性炭對該菌進(jìn)行固定化,在活性炭含量為0.8%的條件下,固定化微球的破損率較低,并具有良好的滲透性。以35.0 g·L-1接種量接種至降解培養(yǎng)基中,發(fā)現(xiàn)該固定化微球?qū)υ偷慕到饴时扔坞x菌有顯著提高,達(dá)到61.7%,對NaCl的耐受性提高到6.0%。菌株BZ-L及其固定化微球在石油污染土壤的生物修復(fù)中有良好的應(yīng)用前景[17]。

    參考文獻(xiàn):

    [1]陸秀君,郭書海,孫清,等.石油污染土壤的修復(fù)技術(shù)研究現(xiàn)狀及展望[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2003,34(1):63-67.

    [2]徐金蘭,黃廷林,唐智新,等.高效石油降解菌的篩選及石油污染土壤生物修復(fù)特性的研究[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報,2007,27(4):622-628.

    [3]HEAD I M,JONES D M,ROLING W F.Marine microorganisms make a meal of oil[J].Nature Reviews Microbiology,2006,4(3):173-182.

    [4]胡文穩(wěn),王震宇,劉居?xùn)|,等.黃河三角洲原油污染土壤的微生物固定化修復(fù)技術(shù)[J].環(huán)境科學(xué)與技術(shù),2011,34(3):116-120.

    [5]ZEROUAL Y,MOUTAOUAKKIL A,BLAGHEN M.Volatilization of mercury by immobilized bacteria(Klebsiellapneumoniae) in different support by using fluidized bed bioreactor[J].Current Microbiology,2001,43(5):322-327.

    [6]ROBATJAZI S M,SHOJAOSADATI S A,KHALILZADEH R,et al.Continuous biodegradation of parathion by immobilizedSphingomonassp.in magnetically fixed-bed bioreactors and evaluation of the enzyme stability of immobilized bacteria[J].Biotechnology Letters,2013,35(1):67-73.

    [7]王玉建,李紅玉.固定化微生物在廢水處理中的研究及進(jìn)展[J].生物技術(shù),2006,16(1):94-96.

    [8]FENG Y,RACKE K D,BOLLAG J M.Use of immobilized bacteria to treat industrial wastewater containing a chlorinated pyridinol[J].Applied Microbiology and Biotechnology,1997,47(1):73-77.

    [9]JIANG B,ZHOU Z C,DONG Y,et al.Bioremediation of petrochemical wastewater containing BTEX compounds by a new immobilized bacteriumComamonassp.JB in magnetic gellan gum[J].Applied Biochemistry and Biotechnology,2015,176(2):572-581.

    [10]關(guān)曉燕,董穎,王擺,等.一株海洋石油降解菌的篩選鑒定及其固定化研究[J].遼寧師范大學(xué)學(xué)報,2013,36(3):400-405.

    [11]單海霞,劉曉宇,張穎,等.硅藻土/活性炭對降解菌群的固定化研究[J].油氣田環(huán)境保護(hù),2013,24(4):19-21.

    [12]東秀珠,蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京:科學(xué)出版社,2001.

    [13]LANE D J.16S/23S rRNA sequencing[M]//Stackebrandt E,Goodfellow M,eds.Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics.Chichester,UK:Wiley J,1991:115-175.

    [14]張秀霞,秦麗姣,吳偉林,等.固定化原油降解菌的制備及其性能研究[J].環(huán)境工程學(xué)報,2010,4(3):659-664.

    [15]包木太,田艷敏,陳慶國.海藻酸鈉包埋固定化微生物處理含油廢水研究[J].環(huán)境科學(xué)與技術(shù),2012,35(2):167-172.

    [16]張秀霞,耿春香,房苗苗,等.固定化微生物應(yīng)用于生物修復(fù)石油污染土壤[J].石油學(xué)報(石油加工),2008,24(4):409-414.

    [17]王傳遠(yuǎn),楊翠云,張志高,等.黃河三角洲生態(tài)區(qū)土壤石油污染及其與理化性質(zhì)的關(guān)系[J].水土保持學(xué)報,2010,24(2):214-217.

    Immobilization and Degradation Characteristics of A Petroleum-Degrading Strain

    LU Fang-bin,LI Rong-chao,ZHANG Lei,WANG Jun

    (DepartmentofLifeSciences,BinzhouUniversity,Binzhou256600,China)

    Abstract:A petroleum-degrading strain named as BZ-L was isolated from the petroleum contaminated saline soil,which could emulsify liquid paraffin well and degradation rate of petroleum was 56.8%.The strain was belonged to Serratia marcescens,according to physical and biochemical characteristics and 16S rRNA sequence analysis.Sodium alginate and activated carbon were employed as embedding agents to study the immobilization of the strain.Results showed that damage rate of the immobilized microspheres were the lowest and the permeability was the best when content of activated carbon was 0.8%.The degradation rate of petroleum by the immobilized microspheres was 61.7%,with the inoculation amount of 35.0 g·L-1 and the NaCl concentration of 6.0%.The degradation rate of petroleum by the immobilized microspheres was higher than that of the free strain,and they were more halotolerant.Strain BZ-L and the immobilized microspheres could be used in the bioremediation of the petroleum contaminated saline soil.

    Keywords:petroleum-degrading strain;immobilized microspheres;degradation characteristics;halotolerant

    猜你喜歡
    耐鹽
    檉柳再生和轉(zhuǎn)化體系的建立及瞬時轉(zhuǎn)化TcSYP121基因功能分析
    大豆種質(zhì)萌發(fā)期和苗期耐鹽性評價
    堿蓬來源耐鹽菌相關(guān)研究進(jìn)展
    黑龍江糧食(2021年9期)2021-12-12 18:52:16
    有了這種合成酶 水稻可以耐鹽了
    郫縣豆瓣中一株耐鹽酵母菌的分離鑒定及其發(fā)酵性能
    抗溫耐鹽聚合物凍膠的低溫合成及性能
    耐鹽保水劑的合成及其性能
    耐鹽紫甘薯花色苷組分分析和抗氧化性研究
    耐鹽高降解蛋白菌株的分離鑒定及其降解條件的研究
    我國建成首個以耐鹽植物為主的種質(zhì)資源庫

    最近最新中文字幕大全免费视频 | 九草在线视频观看| 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲成国产人片在线观看| 亚洲欧洲日产国产| 丰满少妇做爰视频| 九九爱精品视频在线观看| 91精品三级在线观看| 日韩av不卡免费在线播放| 中文字幕色久视频| www日本在线高清视频| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 宅男免费午夜| 男女啪啪激烈高潮av片| 久久久精品94久久精品| a 毛片基地| 亚洲少妇的诱惑av| 欧美日本中文国产一区发布| 婷婷色综合大香蕉| 看免费av毛片| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 伦精品一区二区三区| 满18在线观看网站| 欧美中文综合在线视频| 国产精品熟女久久久久浪| 国产日韩欧美亚洲二区| 熟女电影av网| 亚洲欧洲国产日韩| 亚洲国产欧美网| 欧美日韩亚洲高清精品| 亚洲,欧美,日韩| 婷婷色麻豆天堂久久| 国产激情久久老熟女| 色婷婷久久久亚洲欧美| 美女中出高潮动态图| 欧美最新免费一区二区三区| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 又大又黄又爽视频免费| 色吧在线观看| 中国国产av一级| 人人澡人人妻人| 免费观看性生交大片5| av在线播放精品| xxxhd国产人妻xxx| 亚洲av免费高清在线观看| videossex国产| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 最近2019中文字幕mv第一页| 在线观看免费高清a一片| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 大陆偷拍与自拍| 丝袜喷水一区| 久久精品夜色国产| av卡一久久| 一级片'在线观看视频| 91久久精品国产一区二区三区| 午夜老司机福利剧场| 亚洲国产色片| 日本91视频免费播放| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 亚洲第一av免费看| 亚洲久久久国产精品| 久久免费观看电影| 国产成人91sexporn| 国产综合精华液| 热re99久久国产66热| 三级国产精品片| 亚洲av在线观看美女高潮| h视频一区二区三区| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 一级黄片播放器| 中文字幕亚洲精品专区| 十八禁网站网址无遮挡| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 超碰成人久久| 少妇的逼水好多| av网站免费在线观看视频| 纯流量卡能插随身wifi吗| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 99香蕉大伊视频| 黄色毛片三级朝国网站| 一个人免费看片子| 交换朋友夫妻互换小说| 日韩成人av中文字幕在线观看| 老汉色∧v一级毛片| 岛国毛片在线播放| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 亚洲国产毛片av蜜桃av| 男女边摸边吃奶| 成人影院久久| 丝瓜视频免费看黄片| 大陆偷拍与自拍| av又黄又爽大尺度在线免费看| 五月天丁香电影| 国产淫语在线视频| 国产 一区精品| 久久青草综合色| 久久久久久人人人人人| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产精品免费大片| 欧美 日韩 精品 国产| 国产成人精品福利久久| 久久免费观看电影| 亚洲精品国产色婷婷电影| 青春草国产在线视频| 熟女av电影| 精品福利永久在线观看| av片东京热男人的天堂| 色婷婷久久久亚洲欧美| av在线app专区| 亚洲精品美女久久av网站| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 桃花免费在线播放| 欧美中文综合在线视频| 日韩成人av中文字幕在线观看| 又黄又粗又硬又大视频| 少妇 在线观看| 在现免费观看毛片| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 黄色配什么色好看| 电影成人av| 国产一区二区 视频在线| 美女视频免费永久观看网站| 香蕉丝袜av| 国产男人的电影天堂91| 久久久精品区二区三区| 在线天堂最新版资源| 大片电影免费在线观看免费| 亚洲精品在线美女| 熟女电影av网| 国产视频首页在线观看| 久热久热在线精品观看| 99国产综合亚洲精品| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 在线免费观看不下载黄p国产| 国产伦理片在线播放av一区| 七月丁香在线播放| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 岛国毛片在线播放| 亚洲欧洲日产国产| 韩国精品一区二区三区| 男女啪啪激烈高潮av片| 亚洲国产欧美网| 美女午夜性视频免费| freevideosex欧美| 亚洲国产最新在线播放| 宅男免费午夜| 日本wwww免费看| 不卡av一区二区三区| av视频免费观看在线观看| 亚洲熟女精品中文字幕| 亚洲国产最新在线播放| 国产又色又爽无遮挡免| 十分钟在线观看高清视频www| 丝袜脚勾引网站| 国产成人一区二区在线| 国产麻豆69| 色婷婷久久久亚洲欧美| www.av在线官网国产| av免费在线看不卡| 国产日韩欧美视频二区| 国产精品av久久久久免费| 一级片'在线观看视频| 丰满饥渴人妻一区二区三| videosex国产| 男女国产视频网站| 久热久热在线精品观看| 电影成人av| 久久青草综合色| 久久久国产欧美日韩av| 两性夫妻黄色片| 人妻人人澡人人爽人人| 人妻一区二区av| 精品久久久久久电影网| 男人爽女人下面视频在线观看| 国产毛片在线视频| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 午夜91福利影院| 久久婷婷青草| 亚洲美女视频黄频| 欧美成人午夜精品| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 男女边吃奶边做爰视频| 涩涩av久久男人的天堂| 日本色播在线视频| 九色亚洲精品在线播放| 国产av码专区亚洲av| 男女边吃奶边做爰视频| 国产亚洲精品第一综合不卡| 亚洲熟女精品中文字幕| 亚洲欧美一区二区三区国产| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 国产片内射在线| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 久久精品国产亚洲av高清一级| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 在线观看一区二区三区激情| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | av福利片在线| 一边摸一边做爽爽视频免费| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 国产成人精品婷婷| 伊人久久国产一区二区| 哪个播放器可以免费观看大片| 欧美人与性动交α欧美软件| 免费在线观看完整版高清| 女人精品久久久久毛片| 亚洲av综合色区一区| 天堂中文最新版在线下载| 久久综合国产亚洲精品| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 国产黄色免费在线视频| 99久国产av精品国产电影| 欧美人与善性xxx| 中文字幕色久视频| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 国产精品成人在线| 亚洲国产色片| 99精国产麻豆久久婷婷| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 日本av免费视频播放| 一本大道久久a久久精品| a级片在线免费高清观看视频| 国产成人91sexporn| 国产精品国产三级国产专区5o| 国产男女超爽视频在线观看| 日韩成人av中文字幕在线观看| 日本欧美视频一区| 一区在线观看完整版| a级毛片黄视频| 黄色配什么色好看| 亚洲情色 制服丝袜| 欧美精品高潮呻吟av久久| 亚洲美女黄色视频免费看| 我要看黄色一级片免费的| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 久久久久久伊人网av| 一区二区三区激情视频| 午夜福利网站1000一区二区三区| 国产免费视频播放在线视频| 蜜桃在线观看..| 国产成人免费观看mmmm| 蜜桃国产av成人99| 丝袜人妻中文字幕| 在线 av 中文字幕| 日本免费在线观看一区| 观看美女的网站| 日韩精品免费视频一区二区三区| 一级毛片 在线播放| 亚洲av综合色区一区| 久久99一区二区三区| 啦啦啦在线免费观看视频4| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 国产国语露脸激情在线看| 狂野欧美激情性bbbbbb| 大陆偷拍与自拍| 综合色丁香网| 国产av一区二区精品久久| 国产成人免费观看mmmm| 自线自在国产av| 亚洲第一区二区三区不卡| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 久久99热这里只频精品6学生| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 亚洲第一青青草原| 亚洲精品,欧美精品| 久久综合国产亚洲精品| 国产精品国产三级国产专区5o| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 欧美少妇被猛烈插入视频| 欧美成人午夜精品| 国产不卡av网站在线观看| 免费高清在线观看视频在线观看| 在线观看国产h片| 国产精品国产三级国产专区5o| 久久av网站| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 青青草视频在线视频观看| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 久久97久久精品| 1024香蕉在线观看| 国产片内射在线| 一级爰片在线观看| 各种免费的搞黄视频| 午夜精品国产一区二区电影| 日韩av在线免费看完整版不卡| 2021少妇久久久久久久久久久| 大香蕉久久网| 高清不卡的av网站| 精品少妇黑人巨大在线播放| 青春草亚洲视频在线观看| 日韩精品免费视频一区二区三区| 亚洲综合色网址| 十八禁高潮呻吟视频| 99香蕉大伊视频| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 色婷婷久久久亚洲欧美| 久久精品国产亚洲av高清一级| 好男人视频免费观看在线| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲精品久久午夜乱码| 在线精品无人区一区二区三| 国产亚洲最大av| 欧美97在线视频| av片东京热男人的天堂| av在线app专区| 又大又黄又爽视频免费| 久久久久久人妻| 午夜av观看不卡| 最近2019中文字幕mv第一页| 久久久亚洲精品成人影院| 老司机亚洲免费影院| 国产精品一区二区在线观看99| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 欧美精品亚洲一区二区| 免费观看无遮挡的男女| 亚洲三级黄色毛片| 黄片无遮挡物在线观看| 国产av国产精品国产| 国产色婷婷99| 日本午夜av视频| 丝袜脚勾引网站| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 男女边吃奶边做爰视频| 久久久久久久大尺度免费视频| 国产成人精品福利久久| 精品午夜福利在线看| 国产精品久久久久久精品古装| 亚洲成色77777| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 免费看不卡的av| 欧美日韩视频精品一区| 亚洲国产欧美网| 久久久国产欧美日韩av| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 精品一区在线观看国产| 欧美成人精品欧美一级黄| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 女人精品久久久久毛片| 一边摸一边做爽爽视频免费| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 在线观看三级黄色| 麻豆乱淫一区二区| 国产成人一区二区在线| 看非洲黑人一级黄片| 国产精品久久久久久av不卡| 18+在线观看网站| 久久久久精品久久久久真实原创| 18禁动态无遮挡网站| 日本午夜av视频| 国产精品久久久久久久久免| 欧美日韩精品成人综合77777| 成人二区视频| 最新中文字幕久久久久| 十八禁高潮呻吟视频| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 九九爱精品视频在线观看| 久久久久精品久久久久真实原创| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 爱豆传媒免费全集在线观看| 男女无遮挡免费网站观看| 99久久中文字幕三级久久日本| 国产乱人偷精品视频| 国产一区二区在线观看av| 亚洲伊人色综图| 精品国产一区二区久久| 97在线人人人人妻| av又黄又爽大尺度在线免费看| 在线观看一区二区三区激情| 国产激情久久老熟女| 日韩欧美一区视频在线观看| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 国产人伦9x9x在线观看 | 九色亚洲精品在线播放| 国产有黄有色有爽视频| 亚洲色图综合在线观看| 国产一区二区 视频在线| 男女午夜视频在线观看| av在线观看视频网站免费| 亚洲国产最新在线播放| 亚洲人成网站在线观看播放| 国产亚洲欧美精品永久| 新久久久久国产一级毛片| 亚洲美女视频黄频| 午夜精品国产一区二区电影| 一区二区三区精品91| 人妻系列 视频| 伊人亚洲综合成人网| 亚洲综合精品二区| 成人免费观看视频高清| 国产一区二区 视频在线| 国产又爽黄色视频| 免费在线观看黄色视频的| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| av有码第一页| 久久97久久精品| 亚洲男人天堂网一区| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 亚洲精品一区蜜桃| 最新中文字幕久久久久| 在现免费观看毛片| 尾随美女入室| 精品国产一区二区久久| 少妇熟女欧美另类| 日韩一本色道免费dvd| 美国免费a级毛片| 精品国产一区二区三区四区第35| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 精品久久久久久电影网| 黄色视频在线播放观看不卡| 亚洲第一区二区三区不卡| 精品卡一卡二卡四卡免费| 久久久久国产网址| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产av一区二区精品久久| 久久久国产一区二区| 丁香六月天网| 男人操女人黄网站| 韩国高清视频一区二区三区| 电影成人av| 下体分泌物呈黄色| 国产av精品麻豆| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 久久亚洲国产成人精品v| 亚洲欧洲日产国产| 美女中出高潮动态图| 亚洲国产欧美在线一区| 男人舔女人的私密视频| 欧美日韩一级在线毛片| 欧美日韩亚洲高清精品| 久久精品亚洲av国产电影网| 九色亚洲精品在线播放| 人体艺术视频欧美日本| 91精品伊人久久大香线蕉| 老汉色av国产亚洲站长工具| 国产一区二区 视频在线| 少妇的逼水好多| 欧美另类一区| 国产av一区二区精品久久| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 亚洲伊人色综图| 亚洲欧洲国产日韩| 成人二区视频| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 国产深夜福利视频在线观看| 亚洲熟女精品中文字幕| 秋霞在线观看毛片| 电影成人av| 97人妻天天添夜夜摸| 五月开心婷婷网| 国产高清国产精品国产三级| 亚洲第一av免费看| 国产97色在线日韩免费| 有码 亚洲区| 亚洲色图综合在线观看| 欧美黄色片欧美黄色片| 国产片内射在线| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 国产精品人妻久久久影院| 丝瓜视频免费看黄片| 哪个播放器可以免费观看大片| 三级国产精品片| 男女啪啪激烈高潮av片| 美女国产高潮福利片在线看| 久久人妻熟女aⅴ| 99久久综合免费| 看免费成人av毛片| 综合色丁香网| 国产一区二区三区综合在线观看| 黄片播放在线免费| 蜜桃在线观看..| 欧美另类一区| 考比视频在线观看| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 美女国产视频在线观看| 丝瓜视频免费看黄片| 视频区图区小说| 熟妇人妻不卡中文字幕| 日韩伦理黄色片| 中文字幕制服av| 看非洲黑人一级黄片| 黄色 视频免费看| 国产熟女午夜一区二区三区| 国产精品一二三区在线看| 亚洲精品视频女| 久久精品夜色国产| 男女下面插进去视频免费观看| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 女性生殖器流出的白浆| 男男h啪啪无遮挡| 欧美最新免费一区二区三区| 亚洲欧美清纯卡通| 午夜福利在线免费观看网站| 久久97久久精品| 亚洲久久久国产精品| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 日韩在线高清观看一区二区三区| 激情五月婷婷亚洲| 成人午夜精彩视频在线观看| 精品午夜福利在线看| 国产免费又黄又爽又色| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 天天影视国产精品| 777米奇影视久久| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 各种免费的搞黄视频| 欧美精品高潮呻吟av久久| 各种免费的搞黄视频| 欧美97在线视频| 久久久国产一区二区| 成年动漫av网址| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 久久久精品免费免费高清| 97在线视频观看| 九草在线视频观看| 美女国产高潮福利片在线看| av福利片在线| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 国产av国产精品国产| 国产成人精品无人区| 飞空精品影院首页| 精品午夜福利在线看| 亚洲在久久综合| 热99国产精品久久久久久7| 国产一区二区三区av在线| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 观看美女的网站| 国产成人精品久久久久久| 性色av一级| 少妇的丰满在线观看| 国产精品二区激情视频| 一本大道久久a久久精品| 国产精品成人在线| 国产成人精品一,二区| 日本av手机在线免费观看| 成年美女黄网站色视频大全免费| 婷婷成人精品国产| 777米奇影视久久| 看免费成人av毛片| 欧美日韩精品网址| 久久这里只有精品19| 热99久久久久精品小说推荐| 精品卡一卡二卡四卡免费| 国产黄色免费在线视频| 另类亚洲欧美激情| 校园人妻丝袜中文字幕| 午夜福利网站1000一区二区三区| 香蕉精品网在线| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 久久狼人影院| 制服人妻中文乱码| 人体艺术视频欧美日本| 免费看av在线观看网站| 久久久国产一区二区| 女人久久www免费人成看片| 国产成人aa在线观看| 精品一区二区三区四区五区乱码 | av不卡在线播放| 亚洲熟女精品中文字幕| 一区福利在线观看| 色播在线永久视频| 91国产中文字幕| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 国精品久久久久久国模美| 久久久亚洲精品成人影院| 十八禁高潮呻吟视频| 人人澡人人妻人| 满18在线观看网站| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 亚洲中文av在线| 午夜福利影视在线免费观看| 少妇被粗大的猛进出69影院| 美女主播在线视频| 极品少妇高潮喷水抽搐| 夫妻午夜视频| 亚洲精品美女久久av网站| 午夜日韩欧美国产| 在线天堂最新版资源| 国产精品嫩草影院av在线观看| 成人毛片60女人毛片免费| 一级a爱视频在线免费观看| 视频在线观看一区二区三区| 国产一级毛片在线| 少妇人妻久久综合中文| 国产淫语在线视频| 久久热在线av| 五月开心婷婷网| 日本欧美国产在线视频| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 各种免费的搞黄视频| 国产成人午夜福利电影在线观看| 黄色怎么调成土黄色| 夫妻性生交免费视频一级片| 色婷婷久久久亚洲欧美| 免费高清在线观看视频在线观看| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 亚洲国产av新网站| 亚洲三级黄色毛片| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 久久女婷五月综合色啪小说| 超碰成人久久| 欧美日韩成人在线一区二区| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 亚洲综合色网址|