酶工程方法在有機反應中的應用進展

夏亞穆，李晨晨，張懷征

（青島科技大學化工學院，山東 青島266042）

酶作為新興的生物催化劑，能夠催化特殊化學鍵的形成和斷裂，合成復雜化合物，還可以在溫和的條件下制備手性化合物，較其它催化劑表現(xiàn)出較大優(yōu)勢。

在工業(yè)合成中，水解酶和酮還原酶是最常用的生物催化劑。近幾年，由于酯酶、脂酶和?；D移酶等水解酶的可用和易用性，得到了很多藥物和農(nóng)藥合成的重要中間體，如光學純氨基酸、氨基醇、胺、醇、環(huán)氧化合物等[1］。同時，脂肪酶通過縮聚和環(huán)狀單體的開環(huán)聚合得到多種聚合物[2］。

酶催化劑可單一使用，也可協(xié)同使用。盡管已經(jīng)發(fā)現(xiàn)很多可催化有機合成的酶，但是仍然需要開發(fā)新酶來催化更多復雜的化學反應。目前，開發(fā)新型酶催化劑的技術主要有：（1）篩選新菌株，構建新工程酶；（2）設計開發(fā)具有特定活性功能的酶；（3）生物信息學和計算機建模聯(lián)合來設計實驗。酶工程為篩選新的酶催化劑提供了新方法[3］。

近些年，酶的研究主要集中在酶制劑的制備、酶的固定化、修飾與改造及酶反應器等方面。與傳統(tǒng)的化學過程相比，酶催化具有過程清潔、收率高、能耗低等優(yōu)點，工業(yè)化生產(chǎn)將具有重要意義。作者綜述了酶催化C＝C還原加氫、手性胺和氨基酸的合成、手性環(huán)氧化合物的合成的研究進展，總結了酶工程方法在酶串反應中的應用以及未來的發(fā)展趨勢。

1 酶催化的有機合成反應

1.1 C＝C還原加氫

烯烴的不對稱加氫是有機合成路線中的關鍵步驟，常用的催化劑是過渡金屬，研究發(fā)現(xiàn)Old Yellow Enzyme（OYE）族也能催化此類化學反應[4］。OYE族廣泛存在于微生物和植物中，可催化多種底物還原，如不飽和酮、醛、硝基烯、羧酸、酯和硝酸酯類等[5］。Gargiulo等[6］通過耦合 NAD（P）＋－脫氫酶（ADH）催化環(huán)己醇的氧化和NAD（P）H－烯還原酶催化的α，β－不飽和酮的還原，得到飽和環(huán)己酮，總收率達66%。Stückler等[7］以肉桂醛衍生物為原料，使用Saccharomyces sp.OYE2催化，S構型的芳香醛類 Helional產(chǎn)物ee值高于97%，轉化率達99%。烯丙基醇的氧化還原異構化反應如圖1。

圖1 烯丙基醇的氧化還原異構化Fig.1 The redox isomerization of allylic alcohols

“Roche esters”是一種手性化合物，是合成維生素、抗生素、香料和天然產(chǎn)物的重要中間體，用化學方法合成比較困難。Stückler等[8］用OYEs催化保護基保護的2－羥甲基丙烯酸甲酯得到羅氏酯。Saccharo－myces sp.的黃素蛋白 OYE1－OYE3和Bacillus subtilis的YqjM均可催化2－羥甲基丙烯酸甲酯得到相應R構型的羅氏酯（99%ee）。當NADH為輔因子時，底物為未保護的2－羥甲基丙烯酸甲酯時，OYE1催化轉化率最高，可達37%；當用烯丙基和二芐醚保護羥基時，Pseudomonas putida的OYE3和XenA催化轉化率可達90%以上，并且對映體過量率高（ee＞99%），如圖2。

圖2 不對稱酶催化還原制備Roche estersFig.2 Asymmetric enzyme catalytic reduction for the production of Roche esters

此外，一些烯還原酶還可以催化酮類的脫氫、歧化和異構化反應等，如2－環(huán)己烯酮類化合物在烯還原酶作用下發(fā)生歧化反應得到環(huán)己酮和苯酚。Durchschein等[9］研究發(fā)現(xiàn)烯還原酶可催化α，β－不飽和γ－丁內(nèi)酯的雙鍵異構化，如圖3。

圖3 生物催化α，β－不飽和γ－丁內(nèi)酯的雙鍵異構化Fig.3 Biocatalytic C＝C bond isomerization ofα，βunsaturatedγ－butyrolactone

1.2 手性胺和氨基酸的合成

手性胺和氨基酸是大多數(shù)醫(yī)藥、農(nóng)藥和其它特種化學品的核心組成部分，該類分子的合成引起工業(yè)生物催化研究人員極大興趣[10］。研究證明，轉氨酶、氨基酸裂解酶、變位酶均可實現(xiàn)手性胺和氨基酸的生物合成。

1.2.1 轉氨酶

轉氨酶（EC 2.6.1.x），是一種吡哆醛－5′－磷酸鹽依賴酶（PLP），可直接利用NH3分子作為供體催化酮的胺化[11］。至今，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)20多種w－轉氨酶具有相似的底物特異性。轉氨酶制備手性胺和氨基酸有3種方法：（1）外消旋體胺的動態(tài)動力學拆分，收率低于50%；（2）消旋體去消旋得到單一對映體，收率可達100%，但是過程比較復雜；（3）在相應的轉氨酶作用下，由前手性酮合成單一手性胺，收率可達100%。這三種方法相比，酮的不對稱合成由于操作簡單、收率高，受到研究人員的青睞[12］。Wang 等[13］使用 3－胺基－1，5－二烯環(huán)己羧酸作為胺供體，w－轉氨酶催化得到手性胺，收率為99%，對映體過量率ee＞99%，如圖4。

圖4 胺基供體存在下手性胺的不對稱合成Fig.4 Asymmetric synthesis of a chiral amine with an artificial amine donor

1.2.2 氨基酸裂解酶和變位酶

氨基酸裂解酶通過斷裂底物氨基酸的氨基，可以催化α，β－不飽和鍵的生成以及C＝N鍵的斷裂。與轉氨酶相比，該酶不需要金屬或常見的輔助因子輔助[14］。Lange等[15］聯(lián)合使用化學催化和酶催化方法得到合成心血管緊張素轉化酶（ACE）抑制劑的重要中間體S－2－二氫吲哚碳酸。該反應使用Rhodotorula glutinis DSMPAL01的苯丙氨酸裂解酶（PAL）催化劑，分子NH3作為胺基供體，如圖5。

圖5 化學－酶催化S－2－二氫吲哚碳酸的不對稱合成Fig.5 Chemoenzymatic asymmetric synthesis of（S）－2－2 H－indolinecarboxylic acid

在多種天然產(chǎn)物和藥用化合物中，都有β－氨基酸的結構，而變位酶可以催化生成這一結構[16］。Wu等[17］以β－苯丙氨酸消旋體為原料，經(jīng)過串聯(lián)Taxus chinensis的PAM 和Rhodosporidium toruloides的PAL這兩種酶，催化得到β－苯丙氨酸相應的異構體（反應條件：pH 值8.8，3%甘油，37℃，48h），如圖6。

1.3 手性環(huán)氧化合物的合成

環(huán)氧化物酶廣泛存在于自然界的生物體中，能夠催化化學合成法較難實現(xiàn)的反應，引起了廣泛關注[18］。環(huán)氧化物酶在催化有機合成反應中不需要輔因子輔助，因此操作較方便，對映選擇性高，反應時間短，收率高。Monfort等[19］運用環(huán)氧化物酶得到三唑類抗真菌藥關鍵中間體S－D0870。在H2O／DMSO兩相體系中，A.niger環(huán)氧化物酶動力學拆分消旋體二取代環(huán)氧化物。5h后，R構型環(huán)氧化物被分解成R－二醇，收率為43.5%（94.5%ee）。未反應的S－D0870被得到，收率為41.5%（99.9%ee）。然后第一步生成的R－二醇再在NaH和三苯基磷的作用下發(fā)生環(huán)化反應得到目標產(chǎn)物S－D0870，如圖7。

圖6 生物催化β－苯丙氨酸的不對稱合成Fig.6 Biocatalytic asymmetric synthesis ofβ－phenylalanine

圖7 環(huán)氧化物水解酶催化D0870的動力學拆分Fig.7 Kinetic resolution of D0870using an epoxide hydrolase

此外，研究發(fā)現(xiàn)微生物體中的單加氧酶和鹵醇脫鹵酶也可催化手性環(huán)氧化物的生成，并且操作較簡單，產(chǎn)物的收率和對映體過量率也較高。Hofstetter等[20］發(fā)現(xiàn)苯乙烯單加氧酶（StyAB）可以催化實現(xiàn)芳烴乙烯基的不對稱環(huán)氧化，得到環(huán)氧化合物相應的對映異構體，轉化收率可達87%，對映體過量率（ee）≥98%，如圖8。

圖8 芳烴乙烯基的不對稱環(huán)氧化Fig.8 Asymmetric epoxidation of aromatic vinyl

苯乙烯單加氧酶（SMO）也可以催化烯丙醇的動力學拆分得到環(huán)氧異丙醇衍生物的對映異構體。鹵醇脫鹵酶也可用于動力學拆分合成環(huán)氧化物。Haak等[21］首次運用化學－酶催化動態(tài)動力學拆分β－鹵代醇，得到相應的手性環(huán)氧化物。在特定的條件下，鹵醇脫鹵酶也可催化環(huán)氧化物的開環(huán)反應[22］。

2 酶工程在酶串反應中的應用

酶串反應可以通過休眠細胞或凍干細胞在體內(nèi)或體外進行反應，根據(jù)催化劑的不同可以分為生物－化學串級反應與生物－生物串級反應[23］，這些反應通常使用兩種或更多的酶來催化。Simon等[24］使用非對稱的1，5－二酮為原料，首先在ω－轉氨酶的催化下得到環(huán)狀亞胺，用來自于Chromobacterium violaceum 的天然酶生成得到 （2S）－亞胺，用ArRmut11工程酶得到（2S）－亞胺，再分別被LiAlH4和Pd／C還原，得到2，6－二哌啶的4個立體異構體，并且反應收率和立體選擇性都很高。生物－生物串級反應主要研究酶的選擇性和活性，應用也比較廣泛。Sehl等以苯甲醛和丙酮酸為原料，經(jīng)過兩種酶催化，成功得到去甲麻黃堿和去甲偽麻黃堿。反應的第一步，以苯甲醛和丙酮酸為原料，用對映互補E.coli的聚醛酶進行催化，生產(chǎn)苯基乙?；状嫉姆菍τ钞悩嬻w。反應的第二步，用兩種來自于C.violaceum 和Aspergillu sterreus的ω－轉氨酶合成4個非對映異構體[25］。

酶串反應在底物和產(chǎn)物方面的應用范圍廣，設計方法隨意。但是，至今所報道的大部分酶串反應仍局限于理論研究，工業(yè)應用還較少。酶串反應的研究為目標化合物提供了新的合成方法，如ω－羥基脂肪酸、二元酸等單體。今后酶串反應的研究重點主要是克服酶的抑制性以及與傳統(tǒng)化學更好地結合，加速實現(xiàn)工業(yè)化。

3 結語

在過去十年，越來越多的關注集中在酶催化有機合成反應上，推動了生物催化領域的發(fā)展。但是仍然面臨一些挑戰(zhàn)，首先需要篩選適合新工藝條件的新酶，另一方面要在已定的工藝條件下優(yōu)化現(xiàn)有酶，提高穩(wěn)定性和催化速率。雖然在酶及其變體用于特定合成步驟的研究方面取得了一些成果，但是在逆合成分析方面仍需要探索。未來，酶串聯(lián)級及一鍋煮實現(xiàn)化學催化的方法有望被開發(fā)，這樣既能實現(xiàn)多種鍵同時被催化又可減少不必要的下游處理步驟。

可以預見，未來幾年更多的酶將用于化學反應，如環(huán)化酶、亞胺還原酶等。酶工程的發(fā)展、酶催化機制的完善、蛋白質設計以及新酶的探索及開發(fā)在未來幾年將進一步擴大生物催化的使用范圍，并且將在實現(xiàn)新的化學反應、化學催化以及生物催化方面發(fā)揮重要作用。

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