dl -扁桃酸陰道熱敏凝膠劑對(duì)小型豬陰道黏膜刺激性的研究

夏敏杰, 黃　超, 田　芳, 王玉柱, 職瑞娜,2, 丁訓(xùn)城, 嚴(yán)錢勤, 李衛(wèi)華

（1. 上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所, 國(guó)家計(jì)劃生育藥具重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上?！?00032；

2. 復(fù)旦大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院, 上?！?00032；　3. 上海市第六人民醫(yī)院, 上海　200233）

dl -扁桃酸陰道熱敏凝膠劑對(duì)小型豬陰道黏膜刺激性的研究

夏敏杰1, 黃超1, 田芳1, 王玉柱1, 職瑞娜1,2, 丁訓(xùn)城1, 嚴(yán)錢勤3, 李衛(wèi)華1

（1. 上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所, 國(guó)家計(jì)劃生育藥具重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海200032；

2. 復(fù)旦大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院, 上海200032；3. 上海市第六人民醫(yī)院, 上海200233）

目的研究dl-扁桃酸陰道熱敏凝膠劑對(duì)小型豬陰道黏膜的刺激性。方法將9只雌性小型豬按體質(zhì)量隨機(jī)分為空白膠組、dl-扁桃酸陰道熱敏凝膠劑組和市售壬苯醇醚凝膠（N-9凝膠）組, 肌肉注射苯甲酸雌二醇400 μg/kg（促發(fā)情）, 12 d后建立小型豬陰道刺激性試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，陰道給予5 mL凝膠, 每日一次, 連續(xù)給藥7 d, 在給藥前和末次給藥后的24 h與72 h，收集陰道灌流（CVL）液, 流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)炎性細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)目； 末次給藥72 h后處死小型豬, 取陰道組織, 觀察陰道黏膜組織病理學(xué)改變。結(jié)果dl-扁桃酸陰道熱敏凝膠劑組CVL液中炎性細(xì)胞、中性粒細(xì)胞數(shù)目明顯低于N-9 凝膠組（P＜0.05）。小型豬陰道黏膜組織HE染色顯示, dl-扁桃酸陰道熱敏凝膠劑處理組陰道黏膜無(wú)明顯上皮破損、血管充血以及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn), 其刺激性評(píng)分（5.10±0.47）, 與空白膠組（3.30±1.60）比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05），明顯低于N-9 凝膠組（20.50±3.50）（P＜0.05）。結(jié)論dl-扁桃酸陰道熱敏凝膠劑對(duì)小型豬陰道黏膜刺激性較小。

dl-扁桃酸陰道熱敏凝膠劑； 小型豬； 炎性細(xì)胞； 中性粒細(xì)胞

長(zhǎng)期以來(lái)，國(guó)內(nèi)外通常選用家兔陰道刺激性模型（rabbit vaginal irritation，RVI）來(lái)評(píng)價(jià)外用避孕藥的陰道黏膜刺激性，并以此作為臨床前安全性評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)模型［1］。但RVI模型具有明顯局限性，首先，家兔陰道解剖學(xué)結(jié)構(gòu)與人差異明顯，其次，RVI模型對(duì)大部分人源生殖道病原體不敏感，并且它并不能準(zhǔn)確反映出黏膜上皮炎癥因子的變化和免疫細(xì)胞的活化情況［2］。

小型豬與人類陰道無(wú)論是在組織學(xué)、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)甚至滲透性方面都有著較多相似之處，因此可將小型豬作為一種新的評(píng)估陰道黏膜刺激的合適模型［3］。此外，小型豬模型可以提供對(duì)陰道灌流液中免疫細(xì)胞活化狀態(tài)和細(xì)胞因子釋放進(jìn)行動(dòng)態(tài)細(xì)致的檢測(cè)與分析，使其成為一個(gè)良好的人類陰道組織替代品［3］。

本課題組前期探索研究表明，dl-扁桃酸可能具有較強(qiáng)的體外抑制精子的活性，它通過(guò)影響精子頂體和降低線粒體膜電位，引發(fā)精子運(yùn)動(dòng)障礙，從而對(duì)精子起到制動(dòng)作用。dl-扁桃酸陰道熱敏凝膠劑（dl-Mandelic acid thermosensitive in situ gel，dl-Mandelic acid-TISG, 以下簡(jiǎn)稱dl-扁桃酸凝膠）是以dl-扁桃酸為主藥的一種新型熱敏型酸性水溶性凝膠（pH 3.5～3.9）, 一方面依靠dl-扁桃酸自身良好的抑精作用，另一方面依靠凝膠系統(tǒng)自身具有的酸緩沖作用，維持陰道正常酸性微環(huán)境和微生態(tài)平衡，從而達(dá)到制動(dòng)精子和抑制病原微生物的殺精避孕目的。本文將以小型豬為動(dòng)物模型, 市售N-9 凝膠為陽(yáng)性對(duì)照, 評(píng)價(jià)dl-扁桃酸凝膠的陰道刺激性作用。

1　材料與方法

1.1試劑與儀器

dl-扁桃酸（mandelic acid, 純度≥95%, 購(gòu)自上海貝合化工有限公司）； 泊洛沙姆407（Poloxamer 407, P4 0 7, 德國(guó)BAS F公司）； 羥丙甲基纖維素（HPMCK4M, 美國(guó)DOVV公司）； 苯甲酸雌二醇注射液（上海通用藥業(yè)股份有限公司）； 市售壬苯醇醚膠劑（N-9 凝膠）商品名“樂(lè)樂(lè)迷”，凝膠中含N-9 40 mg/mL（中國(guó)藥科大學(xué)制藥有限公司）。熒光分選細(xì)胞儀（FACS Calibur型，美國(guó)Becton Dicknson公司），病理顯微鏡（C31，日本Olympus公司）。

1.2dl -扁桃酸凝膠的制備

稱取一定量的dl-扁桃酸和熱敏凝膠基質(zhì)泊洛沙姆407, 加入0.1 mol/L醋酸緩沖液（pH=3.5）, 于磁力攪拌器下使其分散均勻，然后置4 ℃冰箱中冷藏12 h, 使dl-扁桃酸凝膠充分溶解、均勻分散至無(wú)色透明狀態(tài), 最后配置成dl-扁桃酸濃度為5 mg/mL的熱敏凝膠劑，其pH為3.5～3.9, 且能隨外界溫度由液狀（溫度≤ 28 ℃）轉(zhuǎn)變?yōu)槟z狀（溫度≥ 32 ℃）。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)條件

成年雌性廣西巴馬小型豬9只, 體質(zhì)量35～40 kg,購(gòu)自上海浦東新區(qū)華新特種養(yǎng)殖場(chǎng)［SCXK（滬）2012-0013］。飼養(yǎng)于上海市第六人民醫(yī)院普通級(jí)動(dòng)物房［SYXK（滬）2011-0128］, 溫度為（25±3） ℃, 12 h/12 h明暗周期，動(dòng)物食用標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，自由飲水。

1.4陰道黏膜刺激性試驗(yàn)（pig vaginal irritation，PVI）［4］

9只雌性小型豬, 適應(yīng)環(huán)境2周后，按體質(zhì)量隨機(jī)分成3組： ①空白膠組（無(wú)藥熱敏凝膠 5 mL/d）；②N-9 凝膠組（N-9 凝膠25 mg/d）； ③dl-扁桃酸凝膠組（dl-扁桃酸凝膠25 mg/d）。每組3只，給藥前小型豬肌肉注射苯甲酸雌二醇400 μg/kg促發(fā)情，同步各組小型豬發(fā)情周期。苯甲酸雌二醇注射后的12 d開始陰道給藥, 每次給藥5 mL, 連續(xù)給藥7 d。

1.5陰道灌流液收集

在首次給藥前, 以及末次給藥后24 h和72 h分別采集陰道灌流（CVL）液。用20 mL無(wú)菌PBS（pH 7.2）對(duì)各處理組小型豬進(jìn)行陰道灌洗，收集CVL液。

1.6流式細(xì)胞儀檢測(cè)CVL液中的炎性細(xì)胞［5］

CVL液經(jīng)200目的細(xì)胞篩過(guò)濾去除雜質(zhì)后，置離心管中，常溫1 000×g，5 min離心收集細(xì)胞，用含1%慶大霉素的PBS重懸， 體積分?jǐn)?shù)1%多聚甲醛1∶1固定，熒光分選細(xì)胞儀檢測(cè)，應(yīng)用CellQuest多功能分析軟件收集，并計(jì)數(shù)10 000個(gè)細(xì)胞。根據(jù)向前散射光（FSC）為橫坐標(biāo)，側(cè)向散射光（SSC）為縱坐標(biāo)，設(shè)門分選出淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和陰道上皮細(xì)胞四個(gè)獨(dú)立細(xì)胞群的二維散點(diǎn)圖。用FlowJo軟件分別標(biāo)出每個(gè)細(xì)胞群占檢測(cè)細(xì)胞總數(shù)的百分比。

1.7小型豬陰道取材及病理檢查和評(píng)分

末次給藥72 h后處死小型豬，解剖摘取完整陰道組織，縱向切開，肉眼觀察是否充血、水腫等異常表現(xiàn)，然后用體積分?jǐn)?shù)10%中性緩沖甲醛固定制成石蠟切片，HE染色，組織病理學(xué)檢查。按照D'Cruz提出陰道刺激性試驗(yàn)方法和標(biāo)準(zhǔn)［6］，選擇若干更易判斷的病理終點(diǎn)（包括： 潰瘍/壞死、白細(xì)胞浸潤(rùn)、充血、出血、水腫、空泡化等）反映陰道黏膜上皮、固有層及其血管和周圍組織的病理變化，采用5個(gè)等級(jí)表示刺激的嚴(yán)重程度，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)變化=0；輕微=1；溫和=2；中等=3；嚴(yán)重=4，從而記錄藥物對(duì)小型豬陰道黏膜的刺激性。各項(xiàng)病變以0～4分記錄，總分為32分。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1CVL炎性細(xì)胞分析

FACS caliber型流式細(xì)胞儀檢測(cè)3次CVL液包括中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和陰道上皮細(xì)胞的變化。由圖1可知, 給藥前各組小型豬CVL液炎性細(xì)胞極少（圖1A、D、G）, 組間差異不明顯。在末次給藥后24 h和72 h, 空白膠組炎性細(xì)胞和中性粒細(xì)胞無(wú)明顯變化（圖1B、C）, 而dl-扁桃酸凝膠組和N-9 凝膠組中性粒細(xì)胞均有升高，但dl-扁桃酸凝膠組的增幅顯著低于N-9 凝膠組，末次給藥后24 h, dl-扁桃酸凝膠組約為18%, N-9 凝膠超過(guò)40%（圖1E、H）, 末次給藥后72 h, dl-扁桃酸凝膠組約為19%, 無(wú)明顯上升, 而N-9 凝膠接近50%, 有顯著上升（圖1F、I）。結(jié)果表明連續(xù)給藥7 d后已有中性粒細(xì)胞由陰道進(jìn)入CVL液中, 但N-9 凝膠組中的中性粒細(xì)胞顯著高于dl-扁桃酸凝膠組。不同時(shí)間各處理組小型豬CVL液的炎性細(xì)胞數(shù), dl-扁桃酸凝膠組與空白膠組相比, 有增加趨勢(shì), 但仍顯著低于N-9 凝膠組。上述結(jié)果說(shuō)明, dl-扁桃酸凝膠雖能引起小型豬CVL液的炎性細(xì)胞、特別是中性粒細(xì)胞的輕微的升高，但仍明顯低于市售的N-9凝膠。

2.2豬陰道組織病理學(xué)分析

表 1　各組小型豬不同時(shí)間CVL的中性粒細(xì)胞百分率　%

根據(jù)向前散射光（FSC）為橫坐標(biāo)，側(cè)向散射光（SSC）為縱坐標(biāo)，設(shè)門分選出淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和陰道上皮細(xì)胞四個(gè)獨(dú)立細(xì)胞群的二維散點(diǎn)圖。這是來(lái)自處理組其中之一的典型圖譜，每個(gè)樣本分析10 000個(gè)細(xì)胞，用FlowJo軟件分別標(biāo)出每個(gè)細(xì)胞群占檢測(cè)細(xì)胞總數(shù)的百分比（%）。A： 空白膠給藥前； B： 空白膠末次給藥后24 h； C： 空白膠末次給藥后72 h； D： dl-扁桃酸凝膠給藥前； E： dl-扁桃酸凝膠末次給藥后24 h； F： dl-扁桃酸凝膠末次給藥后72 h； G： N-9 凝膠給藥前； H： N-9 凝膠末次給藥后24 h； I： N-9 凝膠末次給藥后72 h

表 2　各組小型豬不同時(shí)間CVL的炎性細(xì)胞百分率　%

空白膠組黏膜上皮結(jié)構(gòu)完整，固有層無(wú)明顯空泡和水腫，損傷不明顯（圖2A、B、C）。dl-扁桃酸凝膠組黏膜上皮基本結(jié)構(gòu)完整，黏膜固有層毛細(xì)血管充血明顯，但炎癥細(xì)胞無(wú)明顯增多（圖2D、E、F）。4%N-9凝膠組黏膜上皮結(jié)構(gòu)損傷明顯，出現(xiàn)空泡、水腫，并出現(xiàn)局部脫落，伴炎癥浸潤(rùn)，黏膜固有層充血明顯，血管周圍炎癥細(xì)胞明顯增多，局部炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯（圖2G、H、I）。而在表3小型豬陰道刺激評(píng)分中，空白膠組各項(xiàng)評(píng)分處于最低，其總分也最低, 為3.3±1.6, 而N-9 凝膠組各項(xiàng)評(píng)分最高，總分20.5±3.5，dl-扁桃酸凝膠組總分5.1±0.5，稍高于空白膠組，但低于N-9 凝膠組，說(shuō)明在給藥后，空白膠組陰道受刺激最輕，對(duì)陰道黏膜基本無(wú)損傷，而N-9 凝膠組刺激最為嚴(yán)重，對(duì)陰道黏膜損傷較為嚴(yán)重，dl-扁桃酸凝膠雖對(duì)陰道黏膜有一定的刺激，但其刺激作用顯著低于N-9 凝膠。

3　討論

近年來(lái)外用避孕藥物研發(fā)迅速，其中主要一類藥物為以N-9為代表的表面活性劑，雖具有較強(qiáng)的殺精子作用，但是作為一種表面活性劑，在殺精子的同時(shí)，也對(duì)陰道黏膜細(xì)胞有較強(qiáng)的刺激作用，長(zhǎng)期使用將會(huì)破壞陰道黏膜上皮屏障的完整性，而且能誘發(fā)黏膜的炎癥反應(yīng)，影響陰道黏膜的免疫功能［7-9］。為了尋找安全有效、對(duì)陰道黏膜刺激性小、能維護(hù)陰道正常微生態(tài)的外用避孕新藥，dl-扁桃酸的前期研究已證明其具有很好的抑精作用，但其作為外用避孕藥的安全性尚不明確。

圖2　小型豬陰道組織病理學(xué)分析（HE×200）

表 3　小型豬陰道黏膜刺激性評(píng)分

生殖道炎癥和免疫防御功能在性傳播疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演者關(guān)鍵角色。炎性細(xì)胞中的中性粒細(xì)胞數(shù)量及其活化狀態(tài)是驗(yàn)證陰道黏膜炎癥反應(yīng)的重要參考指標(biāo)，炎性細(xì)胞數(shù)的升高往往與陰道黏膜損傷、免疫炎癥反應(yīng)以及性傳播疾病的感染相關(guān)［10］。研究表明N-9能引起陰道黏膜上皮的損傷和嚴(yán)重的組織炎癥反應(yīng)，引起大量炎癥細(xì)胞特別是中性粒細(xì)胞等進(jìn)入陰道灌流液中［11］。本研究采用流式細(xì)胞技術(shù)分析小型豬陰道灌流液中的炎性細(xì)胞數(shù)量及其活化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)相dl-扁桃酸凝膠組中陰道灌流液中的炎中性粒細(xì)胞的輕微的升高，但仍顯著低于市售的N-9凝膠。由此證明，dl-扁桃酸雖然在一定程度上能引起陰道黏膜的炎癥反應(yīng)，但其嚴(yán)重程度顯著低于N-9 凝膠。

通過(guò)陰道灌流液的監(jiān)測(cè)，可以了解陰道黏膜的炎癥反應(yīng)，而通過(guò)組織病理技術(shù)可以直觀分析藥物對(duì)陰道黏膜刺激損傷作用［12］。本課題組按照D'Cruz等提出的陰道刺激性實(shí)驗(yàn)方法來(lái)評(píng)估陰道黏膜受損狀況。在末次給藥72h后處死動(dòng)物，收集陰道組織制成石蠟切片，HE染色，進(jìn)行常規(guī)病理分析。在陰道黏膜上皮，黏膜固有層，血管與血管周圍，N-9凝膠組均出現(xiàn)較為嚴(yán)重的損傷，表現(xiàn)為黏膜潰瘍、細(xì)胞壞死，白細(xì)胞浸潤(rùn)、出血、水腫等，而dl-扁桃酸凝膠組與空白膠組多數(shù)指標(biāo)無(wú)顯著差異，但血管周圍組織充血較明顯，其程度與N-9凝膠相似。

在本研究中為了探明dl-扁桃酸作為外用避孕藥的安全性，作者采用了雌性廣西巴馬小型豬作為陰道黏膜刺激模型。dl-扁桃酸凝膠和市售N-9凝膠比較結(jié)果表明，前者對(duì)陰道黏膜的刺激作用顯著低于后者，扁桃酸具有更高的安全性。而小型豬作為陰道黏膜刺激模型，能夠客觀的反應(yīng)陰道損傷情況，以及免疫細(xì)胞與細(xì)胞因子的活化狀態(tài)，因此是一種很好的動(dòng)物模型。此外，dl-扁桃酸作為外用避孕新藥，其長(zhǎng)期應(yīng)用的有效性和安全性，有待更進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

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［Abctract］ObjectiveTo study the vaginal irritation of dl-Mandelic acid thermosensitive in situ Gel （dl-Mandelic acid-TISG） in miniature pigs. MethodsNine miniature pigs injected with estradiol benzoate （400 μg/kg） were randomly divided into three groups： control group, dl-Mandelic acid -TISG group and nonoxynol-9 gel （N-9 gel） group. Each miniature pig was administrated with 5 mL gel through vagina once daily for 7 days. Cervicovaginal lavage （CVL） fluids were collectedbefore administration and at the 24 h and 72 h after the last administration. The number of inflammatory cells and neutrophilic granulocytes in the CVL were detected by the flow cytometry. The miniature pigs were sacrificed at 72 h after the last administration. Histopathological changes of the vaginal mucosa were observed under light microscope. ResultsThe number of inflammatory cells and neutrophilic granulocytes in the dl-Mandelic acid-TISG group were significantly lower than that in the N-9 group （P＜0.05）. Histological scoring of vaginal mucosa showed that there were no obvious mucosal epithelium damage, vascular congestion and inflammatory cell infiltration （5.10±0.47） in the dl-Mandelic acid-TISG group.There was no significant difference （3.30±1.60, P＞0.05） compared with the control group （P＞0.05） but significant difference compared with the N-9 group （20.50±3.50, P＜0.05）. ConclusionThe vaginal irritation of dl-Mandelic acid-TISG in miniature pigs is mild.

Study on Vaginal Irritation of dl-Mandelic Acid Thermosensitive in situ Gel in Miniature Pig

XIA Min- jie1, HUANG Chao1, TIAN Fang1, WANG Yu- zhu1, ZHI Rui- na1,2, DING Xun-cheng1, Yan Qian-Qin3, LI Wei- hua1
（1. State Key Labs of Family Planning Devices， Shanghai Institute of Planned Parenthood Research，Shanghai， 200032， China； 2. School of public health， Fudan University， Shanghai 200032， China；3.The Sixth People's Hospital， Shanghai 200233， China）

dl-Mandelic acid-TISG； Miniature pig； Inflammatory cells； Neutrophilic granulocytes

Q95-33

A

1674-5817（2015）05-0356-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.05.003

2015-01-27

國(guó)家科技重大專項(xiàng)（2012ZX10001007-009-003, 2013ZX10001006-003-002）； 十二五國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2012BAI31B04）； 國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目 （81100459）； 上海市科委項(xiàng)目（13431900800）；上海市人口和計(jì)劃生育委員會(huì)（2012JG03）。

夏敏杰（1983-）, 男, 碩士, 研究實(shí)習(xí)員, 遺傳學(xué)。E-mail： mito1983@163.com。

李衛(wèi)華, 女, 博士, 研究員。E-mail： iamliwehua@yahoo.com。嚴(yán)錢勤, 女, 本科, 主管技師。E-mail： yanqianqin3@sina.com