應(yīng)用活體生物發(fā)光成像技術(shù)研究納米雄黃的抗小鼠惡性黑色素瘤肝肺轉(zhuǎn)移作用

席曉霞, 席棟賓, 范臨蘭, 魏虎來

（1. 蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗中心, 甘肅省新藥臨床前研究重點實驗室,蘭州　730000； 2. 酒泉市人民醫(yī)院, 酒泉　735000）

·論著·

應(yīng)用活體生物發(fā)光成像技術(shù)研究納米雄黃的抗小鼠惡性黑色素瘤肝肺轉(zhuǎn)移作用

席曉霞1, 席棟賓2, 范臨蘭1, 魏虎來1

（1. 蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗中心, 甘肅省新藥臨床前研究重點實驗室,蘭州730000； 2. 酒泉市人民醫(yī)院, 酒泉735000）

目的采用小動物活體成像技術(shù)研究納米雄黃對小鼠B16-luc惡性黑色素瘤的抗轉(zhuǎn)移作用和機制。方法以螢火蟲熒光素酶（luciferase, luc）基因標(biāo)志小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞（B16-luc）, BALB/c小鼠的尾靜脈注射B16-luc細(xì)胞制作小鼠黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移瘤模型, 每日4 mg/kg和8 mg/kg納米雄黃灌胃24 d, 陽性對照組隔日腹腔注射順鉑（DDP） 2 mg/kg，陰性對照組灌胃生理鹽水0.02 L/kg。小動物活體成像系統(tǒng)動態(tài)觀察腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移情況。治療末期處死動物，取出肺和肝，置活體成像系統(tǒng)下直接成像，并肉眼觀察肺和肝表面轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)形成； 另對肺、肝腫瘤組織作HE染色，光鏡下觀察組織形態(tài)變化。 結(jié)果活體成像顯示納米雄黃可顯著抑制小鼠黑色素瘤細(xì)胞在肺和肝中的轉(zhuǎn)移（P＜0.05），解剖肉眼可見肝、肺表面轉(zhuǎn)移灶顯著減少或消失，病理學(xué)檢查顯示納米雄黃治療組小鼠的肺臟內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)小、數(shù)量較少，大多數(shù)瘤結(jié)節(jié)中央呈壞死液化改變，肝臟內(nèi)未見到轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)。結(jié)論納米雄黃可有效抑制小鼠惡性黑色素瘤B16-luc細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移和肝轉(zhuǎn)移能力。

納米雄黃； 小鼠惡性黑色素瘤； 活體成像技術(shù)

雄黃的主要抗腫瘤成分為As2S2或As4S4（arsenic disulfide or arsenic tetrasulfide），自身難溶于水，臨床上常采用口服給藥易增加胃腸道刺激。雄黃被制備成納米級顆粒，可降低其粒徑, 增加溶解度、減少用藥量和提高生物利用度。近年來，納米雄黃在白血病和部分實體腫瘤的臨床治療中取得了良好的療效［1-3］。已有研究也證實納米級雄黃微粒具有明顯的抗肝癌和抗肺癌作用［4］, 并可通過調(diào)控細(xì)胞凋亡過程的關(guān)鍵基因而誘導(dǎo)耐藥性白血病細(xì)胞凋亡, 特別是對腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells, CSC）和白血病干細(xì)胞（leukemia stem cells, LSC）也具有良好的增殖抑制作用［5］。鑒于小鼠B16惡性黑色素瘤的增殖、生長、轉(zhuǎn)移特性等與人惡性黑色素瘤類似, 故成為研究惡性黑色素瘤的理想動物模型, 并已在藥物篩選、惡性黑色素瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移的研究中得到了廣泛應(yīng)用［6,7］。目前惡性黑色素瘤有效藥物及治療方案的選擇仍然是面臨的棘手問題。本研究通過BALB/c雄性小鼠的尾靜脈注射接種熒光素酶標(biāo)記的B16黑色素瘤細(xì)胞（B16-luc）, 以制備小鼠肺轉(zhuǎn)移瘤模型，利用小動物活體光學(xué)成像技術(shù)比較雄黃納米微粒的抗惡性黑色素瘤轉(zhuǎn)移效應(yīng)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物SPF級雄性BALB/c小鼠24只，8周齡，體質(zhì)量20～22 g，由蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗中心提供 ［SCXK（甘）2013-0002］。實驗操作及動物飼養(yǎng)在蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗中心SPF級動物實驗設(shè)施進行［SYXK（甘）2013-0003］。動物實驗倫理和福利嚴(yán)格遵循科技部《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》的原則。

1.1.2儀器、試劑小動物活體成像系統(tǒng)（IVIS LuminaⅡ型，美國PerkinElmer公司）； 動物氣體麻醉機（美國Matrx公司）； 異氟烷（中國河北九派有限公司）； D-luc（美國冷泉港生物科技股份有限公司）； 順鉑（DDP, 齊魯制藥有限公司）； 新生小牛血清（中國蘭州榮曄生物科技有限公司）； RPMI 1640（BRL美國Gibco公司產(chǎn)品）。

雄黃原藥粉由西安中藥集團公司提供，采用高能球磨法制備成納米級微粒［5］。用KCl飽和的硝酸溶液滴加至完全溶解，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.2左右，PBS定溶，配制成2 mg/mL的儲存液，過濾除菌，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3小鼠惡性黑色素瘤細(xì)胞生物素酶標(biāo)記B16小鼠惡性黑色素瘤細(xì)胞（B16-luc），為B16細(xì)胞經(jīng)慢病毒載體轉(zhuǎn)染螢火蟲熒光素酶基因（firefly luciferase gene，luc）而成，可穩(wěn)定表達(dá)生物素酶。由美國冷泉港生物科技股份有限公司提供。

1.2方法

1.2.1B16-luc細(xì)胞培養(yǎng)B16-luc細(xì)胞接種于含體積分?jǐn)?shù)12%的新生牛血清、2 mmol/L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中, 置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱飽和濕度條件（MCO-15AC型CO2培養(yǎng)箱，日本三洋公司）下培養(yǎng)。體積分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶消化、傳代、取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實驗。

1.2.2小鼠惡性黑色素瘤肝肺轉(zhuǎn)移模型制備及活體生物發(fā)光觀察將對數(shù)生長期的 B16-luc 細(xì)胞消化制備成單細(xì)胞懸液，無菌生理鹽水調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106/mL。將24只BALB/c小鼠隨機分為4組, 每組6只, 每只BALB/c小鼠尾靜脈接種 0.1 mL單細(xì)胞懸液（2×105個細(xì)胞），以制作小鼠黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移瘤模型。次日（1 d）起實驗組每日分別按4 mg/kg（低劑量組）和8 mg/kg（高劑量組）灌胃納米雄黃進行治療, 陽性對照組隔日腹腔注射DDP 2 mg/kg，陰性對照組灌胃生理鹽水0.02 L/kg。并于0 d、6 d、12 d、18 d、24 d分別用小動物活體成像系統(tǒng)動態(tài)觀測小鼠體內(nèi)腫瘤生長及轉(zhuǎn)移情況。觀測前每只小鼠腹腔注射0.15 g/L的D-luc，10 min之后將小鼠置入動物氣體麻醉機的麻醉盒，用異氟烷進行誘導(dǎo)麻醉，然后置活體成像系統(tǒng)曝光成像，用Lumina ⅡLiving Image 4.0 軟件采集并分析光子數(shù)值。分別按下式計算抑制轉(zhuǎn)移率（IR）： IR（%）=（1-實驗組腫瘤光子數(shù)/陰性對照組腫瘤光子數(shù)）×100%。

1.2.3小鼠黑色素瘤肝、肺轉(zhuǎn)移瘤的形態(tài)學(xué)和病理觀察納米雄黃末次治療后，腹腔注射D-luc，脫臼處死小鼠，快速取出肺臟和肝臟，并肉眼觀察肺臟和肝臟表面轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)形成。用PBS清洗臟器表面血跡，放入預(yù)先清洗消毒的平皿，分別置于活體成像系統(tǒng)下曝光成像，并采集照片。然后將新鮮肺臟、肝臟腫瘤組織用福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察肺臟和肝臟組織形態(tài)的變化。

1.2.4統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用 SPSS13.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（± s）表示，組間分析比較采用t檢驗，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1納米雄黃抑制小鼠B16-luc黑色素瘤的肺轉(zhuǎn)移和肝轉(zhuǎn)移

在小鼠肺部成功形成B16-luc黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移瘤，隨著時間的延長肺部生物發(fā)光強度逐漸增強（P＜0.05）, 并在肝臟部位亦出現(xiàn)轉(zhuǎn)移細(xì)胞發(fā)光（圖1）。高劑量和低劑量納米雄黃及DDP治療后均明顯抑制小鼠B16-luc細(xì)胞在肺部的轉(zhuǎn)移生長，且抑制作用隨著用藥時間的延長而增大，發(fā)光強度較陰性對照組小鼠減低； 在各時間點，納米雄黃高劑量組的轉(zhuǎn)移抑制率均比低劑量組和陽性對照高（P＜0.05, 圖1, 圖2）。與肺轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)計數(shù)法所獲轉(zhuǎn)移抑制率相一致（圖3B）。納米雄黃治療后肝部均未現(xiàn)生物發(fā)光。

2.2小鼠B16-luc黑色素瘤肝肺轉(zhuǎn)移瘤的病理改變

對照組肺臟體積較大、其表面有大量的黑色腫瘤轉(zhuǎn)移灶； 肝臟體積也較大、表面亦有少量轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)。經(jīng)納米雄黃治療后, 小鼠的肺臟體積縮小、表面轉(zhuǎn)移灶顯著減少, 以高劑量治療者最為顯著； 肝臟表面肉眼不可見明顯的轉(zhuǎn)移腫瘤結(jié)節(jié)。肺臟和肝臟轉(zhuǎn)移瘤的肉眼觀察結(jié)果與活體生物發(fā)光成像和器官生物發(fā)光成像結(jié)果相吻合（圖1, 圖3）。肺臟和肝臟病理切片觀察可見, 對照小鼠肺臟內(nèi)有多量的轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)灶, 肝臟內(nèi)有少量的轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)灶, 結(jié)節(jié)灶細(xì)胞內(nèi)可見大量黑色素沉著。部分腫瘤轉(zhuǎn)移灶中央?yún)^(qū)可見少量壞死改變； 納米級雄黃治療小鼠的肺臟內(nèi)轉(zhuǎn)移腫瘤結(jié)節(jié)灶數(shù)量明顯減少, 體積較小, 大多數(shù)瘤結(jié)節(jié)中央?yún)^(qū)域呈液化壞死樣改變。肝臟內(nèi)未見到轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)灶（圖4）。上述結(jié)果證實納米雄黃可有效抑制黑色素瘤細(xì)胞經(jīng)血道導(dǎo)致的肺臟、肝臟轉(zhuǎn)移。

圖2　納米雄黃治療對小鼠B16-luc細(xì)胞肝肺轉(zhuǎn)移的抑制作用Figure 2　The anti-metastasis effects of realgar nanoparticle treatment on the hepatic and pulmonary metastasis of B16-luc cells in mice

3　討論

B16-luc小鼠黑色素瘤由美國Jackson 實驗室建立，可在體外傳代培養(yǎng)和制備實驗動物移植性腫瘤，并已篩選出了多種轉(zhuǎn)移性強的B16-luc細(xì)胞亞系，廣泛地用于腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移過程和影響腫瘤發(fā)展、轉(zhuǎn)移等研究領(lǐng)域, 具有較大的應(yīng)用價值［7,8］。

惡性黑色素瘤是常見的皮膚腫瘤，惡性程度極高，占皮膚腫瘤死亡病例的大部分。惡性腫瘤最顯著的生物學(xué)特征是侵襲和轉(zhuǎn)移，而腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移主要依賴新生血管的形成。因此，能否阻止侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤治療成敗的關(guān)鍵因素。本研究采用尾靜脈接種B16-luc細(xì)胞建立BALB/c小鼠惡性黑色素瘤肝肺轉(zhuǎn)移瘤模型，納米雄黃治療可顯著抑制小鼠肺和肝中黑色素瘤轉(zhuǎn)移灶的形成，且多數(shù)轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)中心區(qū)域出現(xiàn)壞死液化現(xiàn)象，證實納米雄黃可有效抑制小鼠黑色素瘤的肺和肝轉(zhuǎn)移。李秀榮等［9］研究表明納米雄黃可通過上調(diào)色素上皮細(xì)胞衍生因子（PEDF）基因和下調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）基因的表達(dá)抑制人皮膚鱗癌A431新生血管生成。本文作者［10,17］前期研究也證實納米雄黃顯著抑制小鼠乳腺癌和惡性黑色素瘤腫瘤新生血管的形成。據(jù)此，作者推測納米雄黃可能通過抑制腫瘤新生血管生成進而阻斷腫瘤細(xì)胞的遷移和營養(yǎng)通道而發(fā)揮抗轉(zhuǎn)移的作用。有關(guān)納米雄黃抗腫瘤轉(zhuǎn)移的確切細(xì)胞分子機制有待進一步深入研究。

圖3　納米雄黃抗小鼠B16-luc黑色素瘤肝肺轉(zhuǎn)移瘤原位肉眼觀察和生物發(fā)光成像的比較Figure 3　The in situ comparision of anti-metastasis effects of realgar nanoparticle in liver and lung of B16-luc bearing mice by visual observation and bioluminescence imaging

圖4　納米雄黃治療后小鼠B16-luc黑色素瘤肝肺轉(zhuǎn)移瘤組織的病理變化（HE ×20）Figure 4　Pathological observation on hepatic and pulmonary metstsis tumors in B16-luc melanoma-bearing mice treated with realgar nanoparticles （HE×20）

光學(xué)活體成像技術(shù)（optical in vivo imaging）是利用熒光（fluorescence）或生物發(fā)光（bioluminescence）成像原理直接監(jiān)測動物活體內(nèi)細(xì)胞的生物學(xué)行為或特定分子事件，能夠在肉眼尚不能觀察到腫瘤的時候即可觀察、量化活體內(nèi)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移情況，具有動態(tài)、簡便、直觀、精確、定量、特異性和靈敏度高等特點。該技術(shù)既能避免常規(guī)動物實驗中大量處死實驗動物，又可動態(tài)跟蹤同一目標(biāo)隨時間的變化趨勢，避免因傳統(tǒng)實驗方法和個體差異對實驗結(jié)果的干擾。與傳統(tǒng)的腫瘤轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)計數(shù)法相比，生物發(fā)光法更靈敏，更準(zhǔn)確；避免了因腫瘤轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)融合，腫瘤組織內(nèi)壞死組織和細(xì)胞的干擾而導(dǎo)致的主觀因素的影響，能更客觀的反應(yīng)藥物對腫瘤的抑制作用。因此，活體成像技術(shù)已成為廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、動物醫(yī)學(xué)及藥物開發(fā)研究領(lǐng)域的前沿技術(shù)［11-19］。與傳統(tǒng)動物實驗技術(shù)相比，本文采用的小動物光學(xué)活體成像技術(shù)研究雄黃納米微粒的抗小鼠黑色素瘤肺肝轉(zhuǎn)移作用具有顯著技術(shù)優(yōu)勢，能夠在活體動物水平方便、經(jīng)濟和動態(tài)評價藥物的抗轉(zhuǎn)移效應(yīng)。

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Anti-metastatic Actions of Realgar Nanoparticles on Hepatic and Pulmonary Metastasis of Murine Malignant Melanoma with in vivo Bioluminescence Imaging System

XI Xiao-xia1, XI Dong-bin2, FAN Lin-lan1, WEI Hu-lai1
（1. Laboratory Center for Medical Sciences， Key Laboratory of Preclinical Study for New Drugs of Gansu Province， School of Basic Medical Sciences， Lanzhou University， Gansu Lanzhou 730000， China；2. The People's Hospital of Jiuquan City， Jiuquan 735000， China）

ObjectiveTo study the anti-metastasis action and mechanisms of realgar nanoparticles （nano-realgar） on malignant melanoma B16-luc cells in mice by application of in vivo bioluminescence imaging assay. MethodsThe firefly luciferase （luc） gene was transferred into murine B16 melanoma cells with a lentiviral vector（B16-luc cells）. B16-luc cells were injected into tail vein of BALB/c mice to establish the pulmonary and hepatic melanoma metastasis model. The model mice were treated with 4 mg/kg and 8 mg/kg nano-realgar once a day by ig for 24 days, and the optical in vivo imaging system was used continuously and dynamically to observe the tumor metastatic situation in mice. At the end of the treating period the mice were sacrificed, and the lungs and liver were removed, and the fluorescence images of the organs were acquired directly with the optical in vivo imaging system, and the metastasis nodules on the lung and liver surface were also observed for perusal. Finally the lung, liver and tumor stained with HE staining, and the morphological changes were observed under microscope. ResultsObservation with optical in vivo imaging system showed that nano-realgar administration could markedly suppressed the pulmonary and hepatic metastasis of B16-luc cells （P＜0.05）. After nanorealgar treatment, the numbers of pulmonary and hepatic metastasis nodules significantly reduced even disappeared, and pathological examinations revealed that, in the nano-realgar treated mice, the metastasis nodules in lungs seems small and little, the liquefactive necrosis appeared in the central area of most nodules, and no metastasis nodules was found in liver. ConclusionRealgar nanoparticles are able to inhibit significantly the abilities of pulmonary and hepatic metastasis of B16-luc malignant melanoma cells in mice.

Realgar nanoparticle； Murine malignant melanoma； Optical in vivo imaging

R73-3 Q95-33

A

1674-5817（2015）05-0345-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.05.001

2014-12-02

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金自由探索面上項目 （LZUjbky-2015-157）, 甘肅省自然科學(xué)研究基金計劃項目（1208RJZA183）和甘肅省中醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)研究課題（GZK-2010-17）

席曉霞（1979-）, 女, 博士, 實驗師, 研究方向： 醫(yī)學(xué)實驗動物學(xué)/獸醫(yī)學(xué)。E-mail： xixx@lzu.edu.cn

魏虎來, 男, 教授, 博士生導(dǎo)師, 研究方向： 細(xì)胞分子生物學(xué)/醫(yī)學(xué)實驗動物學(xué)。E-mail： weihulai@lzu.edu.cn