間歇升溫誘導(dǎo)南果梨冷藏轉(zhuǎn)常溫酯類香氣的變化和相關(guān)基因表達(dá)

周　鑫，董　玲，紀(jì)淑娟

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866）

間歇升溫誘導(dǎo)南果梨冷藏轉(zhuǎn)常溫酯類香氣的變化和相關(guān)基因表達(dá)

周鑫，董玲，紀(jì)淑娟*

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866）

以南果梨為試材，研究間歇升溫（intermittent warming，IW）對南果梨冷藏后常溫貨架期間酯類香氣的影響，以及對酯類香氣代謝途徑關(guān)鍵酶脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）、醇脫氫酶（alcoholdehydrogenase，ADH）、醇?；D(zhuǎn)移酶（alcohol acyltransferase，AAT）活性及其相應(yīng)基因表達(dá)的影響，探討IW對南果梨香氣代謝的作用機(jī)理。結(jié)果表明，IW處理顯著提高了南果梨果實(shí)冷藏后出庫當(dāng)天和最佳食用期時的酯類香氣含量，提高了常溫貨架前期果實(shí)LOX活性、常溫貨架第6天時果實(shí)ADH活性和冷藏期間及常溫貨架期間果實(shí)AAT活性，顯著誘導(dǎo)了冷藏期間及常溫貨架期間PuLOX1、PuADH3和PuAAT1的表達(dá)。IW處理可能通過對酯類香氣代謝途徑關(guān)鍵酶活性及其相應(yīng)基因表達(dá)的調(diào)控，促進(jìn)果實(shí)酯類香氣的生成，從而一定程度提高南果梨冷藏后的香氣品質(zhì)。

南果梨；間歇升溫；冷藏；酯類香氣；基因表達(dá)

間歇升溫（intermittent warming，IW）處理，即果蔬在低溫貯藏期間采取多次短期升溫處理，是以高于冷害臨界溫度的溫度中斷低溫以減輕冷害的一種方法。Cohen［1］研究表明IW處理能夠增強(qiáng)檸檬對低溫的耐受能力，維持檸檬良好的硬度并減少腐爛。Anderson［2］對油桃的貯藏研究表明，IW處理可顯著抑制果實(shí)內(nèi)腐病的發(fā)生，并保持較高的食用品質(zhì)。此外，IW處理還可有效消除或減輕李子、芒果、石榴、桃、番茄等多種果蔬的冷害癥狀［3-8］。酯類香氣代謝途徑中，脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）作用于脂肪酸生成的醛類在醇脫氫酶（alcoholdehydrogenase，ADH）參與下還原為醇［9-13］。醇酰基轉(zhuǎn)移酶（alcohol acyltransferase，AAT）可催化醇類與?；鵆oA的酯化反應(yīng)，是酯類合成途徑中最末端的關(guān)鍵酶［14-15］。研究表明，LOX、ADH和AAT活性及基因表達(dá)的變化會影響酯類香氣的生成［16］。

南果梨（Pyrus ussriensis Maxim.）為遼寧省鞍山地區(qū)的特產(chǎn)，其濃郁的香氣是重要的果實(shí)品質(zhì)之一。南果梨采后常溫條件下放置不耐貯，采用冷藏的方式可有效地延緩果實(shí)后熟衰老，但是冷藏后常溫貨架期間南果梨的香氣品質(zhì)會下降［17-18］。Xi Wanpeng等［19］研究發(fā)現(xiàn)IW處理可通過調(diào)控AAT減輕桃果實(shí)低溫貯藏期間酯類香氣的喪失，然而該調(diào)控方式對梨果實(shí)香氣品質(zhì)的影響及作用機(jī)理尚不清楚。本研究對冷藏南果梨進(jìn)行IW處理，通過分析酯類香氣的變化和LOX、ADH和AAT活性及基因表達(dá)變化，探討IW處理對冷藏南果梨酯類香氣的調(diào)控作用，為提高冷藏南果梨的商品品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

供試南果梨果實(shí)于2013年9月17日采自遼寧省鞍山市摩云山鎮(zhèn)。

氯化鈉（分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；2-（N-嗎啡啉）乙磺酸、亞油酸鈉、還原型輔酶、二硝基苯甲酸 上海源葉生物有限公司；乙酰輔酶A 美國Sigma公司；總RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒、實(shí)時熒光定量PCR試劑盒 北京天根生化科技有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

7890-5975氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司；100 μm PDMS萃取頭和固相微萃取手柄 美國Supleo公司；iQ5實(shí)時熒光定量PCR儀 美國Bio-Rad公司；TA.XT.Plus物性測定儀 英國Stable Micro System公司。

1.3方法

1.3.1間歇升溫處理

挑選大小均勻、無病蟲害、無機(jī)械損傷的果實(shí)500 個，平均分成2 組，每組果實(shí)分別裝于5 個0.04 mm聚乙烯袋內(nèi)（每袋50 個）。在常溫20 ℃條件下預(yù)熟5 d后，兩組果實(shí)均移入冷庫（0±0.5）℃冷藏，其中一組果實(shí)在冷藏期間每20 d轉(zhuǎn)至常溫20 ℃條件下放置1 d，作為間歇處理組。2 組果實(shí)冷藏90 d后出庫，于常溫20 ℃條件下放置。分別取入庫當(dāng)天（冷藏0 d）、常溫貨架期0、6、9、12、15 d的果實(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并于入庫當(dāng)天、出庫當(dāng)天（常溫貨架期0 d）和最佳食用期（常溫貨架期9 d）時測定酯類香氣。每個實(shí)驗(yàn)時間點(diǎn)時果實(shí)組織均經(jīng)液氮冷凍采樣，于－80 ℃保存并用于RNA抽提。

1.3.2硬度的測定

每次隨機(jī)選取6 個果實(shí)，在每個果實(shí)去皮的胴部測4 個點(diǎn)，取平均值。測定參數(shù)為：探頭型號P/2 ，直徑2 mm，測試速率3 mm/s，測定深度5 mm，最小感知力5 g。

1.3.3酯類香氣的測定

選取6 個（約900 g）大小一致、無機(jī)械傷的果實(shí)，組織粉碎后，經(jīng)200 目紗布過濾，收集濾液。準(zhǔn)確量取8 mL濾液于15 mL頂空瓶中，加入2.5 g NaCl，加入10 μL 3-辛酮（1.644 mg/mL），置于50 ℃加熱臺上平衡5 min，插入100 μm PDMS萃取頭，50 ℃萃取40 min，轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速為1 000 r/min。萃取結(jié)束后將萃取頭插入進(jìn)樣口，于250 ℃解吸3 min，進(jìn)行檢測，并重復(fù)3 次。

氣相色譜條件：HP-INNOWAX色譜柱（30 m×250 ?m，0.25 ?m）；程序升溫：40 ℃保留2 min，然后以4 ℃/min升至60 ℃，保留1 min，再以2 ℃/min升至150 ℃，最后以10 ℃/min升至210 ℃，保留5 min。傳輸線溫度為250 ℃。載氣為He，流速1 mL/min，不分流。

質(zhì)譜條件：連接桿溫度280 ℃；電子電離源；電離電壓70 eV；離子源溫度200 ℃；四極桿溫度150 ℃；倍增電壓1 200 eV；掃描范圍m/z 45～600。

定性定量方法：通過檢索NIST/Wiley標(biāo)準(zhǔn)譜庫，并結(jié)合文獻(xiàn)的譜圖［20-21］進(jìn)行定性分析。利用3-辛酮作為內(nèi)標(biāo)定量。計(jì)算公式參照陳美霞等［22］的方法，并略作改動。

酯類香氣各組分的含量/（μg/kg）=［各組分的峰面積/內(nèi)標(biāo)的峰面積×內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度/（mg/mL）×體積/mL× 1 000］/樣品量/kg

1.3.4酶活性的測定

LOX、ADH和AAT活性的測定，分別參照陳昆松［23］、田長平［24］、Echever?ia［25］等的方法，測定項(xiàng)目均為3 次重復(fù)。

1.3.5基因表達(dá)量的測定

南果梨果實(shí)總RNA提取參照RNAprep pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行。用OD值測定法結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳法進(jìn)行RNA質(zhì)量的檢測。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參照TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒說明書進(jìn)行。

采用實(shí)時熒光定量PCR的方法，按照相關(guān)基因已知序列利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)實(shí)時熒光定量PCR特異性引物（表1）。熒光定量PCR反應(yīng)體系（20 μL）和反應(yīng)程序參照RealMasterMix（SYBR Green）試劑盒說明書進(jìn)行。以梨Actin作為內(nèi)參，采用相對定量的2－ΔΔCt方法，基因表達(dá)水平以某實(shí)驗(yàn)時間點(diǎn)同果實(shí)入庫當(dāng)天的比值表示，果實(shí)入庫當(dāng)天的表達(dá)水平設(shè)為1。

表1　實(shí)時熒光定量PCR特異性引物Table1　Primers for real-time q-PCR analysis

1.4 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用SPSS16.0“one-way ANOVA”進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的差異顯著性分析，應(yīng)用Excel軟件計(jì)算平均值、標(biāo)準(zhǔn)差，圖形生成采用Origin 8.1軟件。

2　結(jié)果與分析

2.1IW對南果梨冷藏后常溫貨架期間果實(shí)硬度變化的影響

圖1　IW對理南果梨冷藏后常溫貨架期間果實(shí)硬度的影響Fig.1　Effects of IW treatment on flesh firmness of Nanguo pears during ripening period after refrigeration

由圖1可知，冷藏90 d后出庫當(dāng)天，2 組果實(shí)硬度均顯著低于入庫當(dāng)天（P＜0.05），但2 組間果實(shí)硬度無顯著差異。南果梨是軟肉梨品種，只有當(dāng)果實(shí)適度變軟時特有的香氣才能散發(fā)出來。隨著常溫貨架期的延長，2 組果實(shí)的硬度均呈下降趨勢，常溫貨架期9 d時，2 組果實(shí)的硬度均降至6～7 kg/cm2，且無顯著差異，在此硬度時南果梨的食用品質(zhì)最佳。因此，后續(xù)酯類香氣分析時，2 組果實(shí)均以常溫貨架期9 d時為最佳食用期進(jìn)行香氣測定。

2.2IW對南果梨冷藏后常溫貨架期間果實(shí)酯類香氣的影響

酯類是成熟果實(shí)的主要香氣成分［26-27］。如表2所示，入庫當(dāng)天南果梨果實(shí)中只檢測到6 種酯類香氣成分。冷藏90 d的南果梨在出庫當(dāng)天，IW處理果實(shí)中酯類香氣成分種類增至19 種，比對照果實(shí)中多2 種。在常溫貨架期第9天，即果實(shí)硬度達(dá)到最佳食用狀態(tài)時，IW處理果實(shí)中檢測到20 種酯類香氣成分，比此時對照果實(shí)中多1種。

果實(shí)香氣取決于香氣成分的組成、含量及香氣閾值。具有高含量和低香氣閾值的香氣成分對香氣的貢獻(xiàn)較大。從表2可以看出，己酸乙酯是南果梨果實(shí)中相對含量最大的酯類香氣成分，又具有較低的香氣閾值，因此對香氣的貢獻(xiàn)比較大，是南果梨果實(shí)主要的酯類香氣成分。同樣的，乙酸乙酯、丁酸乙酯和乙酸己酯也被認(rèn)為是南果梨果實(shí)的主要酯類香氣成分。在出庫當(dāng)天和最佳食用期時，IW處理果實(shí)中己酸乙酯的含量均顯著高于同期對照果實(shí)，而乙酸己酯的含量卻均顯著低于同期對照果實(shí)（P＜0.05）。出庫當(dāng)天，IW處理果實(shí)中乙酸乙酯和丁酸乙酯的含量均顯著高于對照果實(shí)（P＜0.05），但最佳食用期時，IW處理果實(shí)中乙酸乙酯含量與對照果實(shí)無顯著差異，丁酸乙酯的含量卻顯著低于對照果實(shí)（P＜0.05）。出庫當(dāng)天，2 組果實(shí)總酯類香氣含量均顯著高于入庫當(dāng)天，且IW處理果實(shí)顯著高于對照果實(shí)（P＜0.05）。

表2　南果梨冷藏后常溫貨架期間酯類香氣的變化Table2　Changes in esters during ripening at room temperature of refrigerated Nanguo pears

2.3 IW對南果梨冷藏后常溫貨架期間酯類香氣代謝途徑中關(guān)鍵酶活性及其基因表達(dá)的影響

圖2　IW對南果梨冷藏后貨架期間LOX活性（a）及其PuuLLOOXX11相對表達(dá)量（b）的影響Fig.2　Effects of IW treatment on LOX activity （a） and relative expression of PuLOX1 （b） of Nanguo pears during ripening period after refrigeration

由圖2a可以看出，冷藏90 d的南果梨在出庫當(dāng)天，2 組果實(shí)LOX活性均與入庫當(dāng)天無顯著差異，且2 組間果實(shí)LOX活性也無顯著差異。在常溫貨架期間，IW處理果實(shí)LOX活性呈先升后降趨勢，且在第9天達(dá)到峰值，而對照果實(shí)LOX活性呈先降后升再降趨勢，于第12天達(dá)到峰值，2 組果實(shí)LOX活性峰值無顯著差異。在常溫貨架期間第6～9天時，IW處理果實(shí)LOX活性顯著高于同期對照果實(shí)（P＜0.05），說明IW處理促進(jìn)了常溫貨架前期果實(shí)LOX活性。

由圖2b可知，冷藏90 d的南果梨在出庫當(dāng)天，對照果實(shí)PuLOX1相對表達(dá)量與入庫當(dāng)天無顯著差異，而IW處理果實(shí)PuLOX1相對表達(dá)量顯著高于入庫當(dāng)天（P＜0.05），說明IW處理促進(jìn)了冷藏期間果實(shí)PuLOX1的表達(dá)。在常溫貨架期間，2 組果實(shí)PuLOX1相對表達(dá)量均呈先升后降趨勢，且均在第9天達(dá)到峰值。從常溫貨架期的0～15 d，IW處理果實(shí)PuLOX1相對表達(dá)量均顯著高于同期對照果實(shí)PuLOX1相對表達(dá)量（P＜0.05），說明IW處理也促進(jìn)了常溫貨架期間果實(shí)PuLOX1的表達(dá)。

圖3　IW對南果梨冷藏后貨架期間ADH活性（a）及其PuuAADDHH33相對表達(dá)量（b）的影響Fig.3　Effects of IW treatment on ADH activity （a） and relative expression of PuADH3 （b） of Nanguo pears during ripening period after refrigeration

如圖3a所示，冷藏90 d的南果梨在出庫當(dāng)天，2 組果實(shí)ADH活性均顯著高于入庫當(dāng)天（P＜0.05），且2 組間果實(shí)ADH活性無顯著差異。在常溫貨架期間，IW處理果實(shí)ADH活性呈先升后降再升趨勢，分別于第6天和第15天達(dá)到峰值。對照果實(shí)ADH活性呈先降后升趨勢，于第15天達(dá)到峰值。IW處理果實(shí)ADH活性僅在第6天時顯著高于對照果實(shí)，且在第12天時顯著低于對照果實(shí)（P＜0.05），在常溫貨架期的其他測試時間時均與同期對照果實(shí)ADH活性無顯著差異。

由圖3b可以看出，冷藏90 d的南果梨在出庫當(dāng)天，對照果實(shí)PuADH3相對表達(dá)量與入庫當(dāng)天無顯著差異，而IW處理果實(shí)PuADH3相對表達(dá)量顯著高于入庫當(dāng)天（P＜0.05），說明IW處理促進(jìn)了冷藏期間果實(shí)PuADH3的表達(dá)。在常溫貨架期間第6天，2 組果實(shí)PuADH3相對表達(dá)量均達(dá)到最大值。從常溫貨架期的0～15 d，IW處理果實(shí)PuADH3相對表達(dá)量顯著高于同期對照果實(shí)，說明IW處理也促進(jìn)了常溫貨架期間果實(shí)PuADH3的表達(dá)。

圖4　IW對南果梨冷藏后貨架期間AAT活性（a）及其PuuAAAATT11相對表達(dá)量（b）的影響Fig.4　Effects of IW treatment on AAT activity （a） and relative expression of PuAAT1 （b） of Nanguo pears during ripening period after refrigeration

由圖4a可知，冷藏90 d后出庫當(dāng)天，2 組果實(shí)AAT活性均顯著高于入庫當(dāng)天，且IW處理果實(shí)AAT活性顯著高于對照果實(shí)（P＜0.05），說明IW處理促進(jìn)了冷藏期間果實(shí)AAT活性。在常溫貨架期間，IW處理果實(shí)AAT活性呈先降后升再降趨勢，對照果實(shí)AAT活性呈先升后降趨勢，2 組均于第12天時達(dá)到最大峰值。從常溫貨架期的0～15 d，IW處理果實(shí)AAT活性均顯著高于對照果實(shí)（P＜0.05），說明IW處理也促進(jìn)了常溫貨架期間的果實(shí)AAT活性。

由圖4b可以看出，冷藏90 d后出庫當(dāng)天，對照果實(shí)PuAAT1相對表達(dá)量與入庫當(dāng)天無顯著差異，而IW處理果實(shí)PuAAT1相對表達(dá)量顯著高于入庫當(dāng)天（P＜0.05），說明IW處理促進(jìn)了冷藏期間果實(shí)PuAAT1的表達(dá)。在常溫貨架期間，2 組果實(shí)PuAAT1相對表達(dá)量均呈先升后降趨勢，且與AAT活性相似，2 組果實(shí)PuAAT1相對表達(dá)量也均于第12天時達(dá)到峰值。從常溫貨架期的0～15 d，IW處理果實(shí)PuAAT1相對表達(dá)量顯著高于同期對照果實(shí)（P＜0.05），說明IW處理也促進(jìn)了常溫貨架期間果實(shí)PuAAT1的表達(dá)。

3　討 論

香氣是南果梨重要的品質(zhì)指標(biāo)之一，酯類是成熟果實(shí)的主要香氣成分［26-27］。本研究結(jié)果表明，IW處理顯著提高了冷藏期間及常溫貨架期間南果梨酯類香氣的生成。本研究以果實(shí)硬度判斷果實(shí)的成熟度，出庫當(dāng)天及常溫貨架最佳食用期時IW處理果實(shí)與同期對照果實(shí)硬度無顯著差異，說明2 組果實(shí)在香氣測定時果實(shí)成熟度無顯著差異，因此IW處理可能并非通過改變果實(shí)成熟度而提高果實(shí)的香氣品質(zhì)，需進(jìn)一步對果實(shí)香氣代謝途徑進(jìn)行分析。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IW處理誘導(dǎo)了冷藏期間及常溫貨架期間PuLOX1、PuADH3和PuAAT1的表達(dá)，Li Guopeng等［28］研究證明LOX1、ADH3和AAT基因在梨果實(shí)酯類香氣生成中起到重要的作用，因此3 種基因的上調(diào)表達(dá)可能是IW處理促進(jìn)果實(shí)酯類香氣合成的關(guān)鍵因素。此外，關(guān)鍵酶活性的提高也會對果實(shí)酯類香氣的大量生成起著重要的作用。IW處理顯著提高了常溫貨架前期果實(shí)LOX活性，Zhang Bo等［12］研究發(fā)現(xiàn)LOX活性及表達(dá)的提高會促進(jìn)果實(shí)形成大量己醛，這可能是IW處理果實(shí)中含有C6特征單元的主要香氣成分己酸乙酯含量顯著提高的原因。IW處理提高了常溫貨架期第6天時果實(shí)ADH活性，說明最佳食用期前IW處理果實(shí)生成醇類的能力較強(qiáng)，可為酯類合成提供大量醇類前體物質(zhì)。PuAAT1表達(dá)量和AAT活性的提高使IW處理果實(shí)產(chǎn)生了大量的酯類香氣，這與Xi Wanpeng等［19］研究發(fā)現(xiàn)IW處理可通過促進(jìn)AAT活性及表達(dá)使桃果實(shí)酯類香氣恢復(fù)的結(jié)果一致。通過分析發(fā)現(xiàn)，3 種酶活性變化趨勢與其對應(yīng)基因的表達(dá)模式并非一致，這表明3 種酶蛋白可能存在翻譯后修飾作用，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

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Intermittent Warming Induces Changes in Volatile Ester Production and Related Genes Expression during Shelf Life at Room Temperature of Refrigerated Nanguo Pears

ZHOU Xin， DONG Ling， JI Shujuan*
（College of Food Science， Shenyang Agricultural University， Shenyang 110866， China）

Refrigeration delays ripening and reduces decay of pear fruit， but this benefit is offset by a loss of aroma when the fruit is then ripened at room temperature. Intermittent warming （IW） has been used to alleviate chilling injury （CI） of fruit； however， its effect on aroma remains unknown. In this study， Nanguo pears were subjected to IW and changes in aroma-related esters， the activities and gene expression of lipoxygenase （LOX）， alcohol dehydrogenase （ADH） and alcohol acyltransferase （AAT） were investigated. Significantly higher ester contents were found in IW-treated fruit on day 0 of the shelf life at room temperature and in the optimal taste period. The activity of LOX was promoted by IW treatment during the early period of the shelf life at room temperature and the activity of ADH was promoted on day 6 of the shelf life， while the activity of AAT was accelerated during cold storage and the shelf life at room temperature. The transcription levels of PuLOX1， PuADH3 and PuAAT1 genes were significantly promoted by IW treatment. IW treatment may regulate the activities and gene expression of LOX， ADH and AAT to stimulate the generation of aroma-related esters. Treatment with IW effectively prevented the loss of aroma-related esters from refrigerated Nanguo pears.

Nanguo pears； intermittent warming； refrigeration； volatile esters； gene expression

TS255.3

A

1002-6630（2015）14-0206-06

10.7506/spkx1002-6630-201512040

2014-11-18

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31370685）

周鑫（1987—），女，博士研究生，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量控制。E-mail：zhou_xin870828@yeah.net

紀(jì)淑娟（1960—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量控制。E-mail：jsjsyau@sina.com