微乳液相色譜法對藍(lán)莓葉黃酮類化合物的分離和測定

趙　丹，蘇　寧，鄭洪艷，楊　麗，霍　彤，王昌濤，*

（1.北京工商大學(xué)理學(xué)院，北京 100048；2.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100123）

微乳液相色譜法對藍(lán)莓葉黃酮類化合物的分離和測定

趙丹1，蘇寧2，鄭洪艷2，楊麗2，霍彤1，王昌濤1，*

（1.北京工商大學(xué)理學(xué)院，北京 100048；2.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100123）

目的：利用微乳液相色譜分離并測定藍(lán)莓葉中兒茶素、蘆丁、山柰酚、槲皮素和楊梅酮5 種黃酮成分。方法：從表面活性劑、助表面活性劑、pH值、有機(jī)相4 個方面對微乳液相色譜分離藍(lán)莓葉黃酮的條件進(jìn) 行優(yōu)化。結(jié)果：分離藍(lán)莓葉黃酮的最優(yōu)條件為：使用2.5%聚氧乙烯（23）月桂醚作為表面活性劑，8%正丁醇為助表面活性劑，0.8%乙酸乙酯為有機(jī)相，0.5%乙酸調(diào)節(jié)體系pH值為3.2，在以上條件下藍(lán)莓葉黃酮在20 min內(nèi)能夠得到有效分離。結(jié)論：藍(lán)莓葉中提取的黃酮類化合物含有兒茶素9.76 mg/g、蘆丁13.12 mg/g、山柰酚31.04 mg/g、槲皮素26.42 mg/g、楊梅酮20.30 mg/g。

藍(lán)莓葉；黃酮類化合物；微乳液相色譜；分離；測定

藍(lán)莓原產(chǎn)于美洲，不僅果實(shí)營養(yǎng)豐富，藍(lán)莓葉有利尿、解毒的功效，可入藥。藍(lán)莓葉汁中的花青素類黃酮能夠降血糖，有助于提高毛細(xì)血管的完整性，穩(wěn)定毛細(xì)血管的通透性，從而抑制糖尿病人血管和神經(jīng)后遺癥的產(chǎn)生［1-3］。如何對藍(lán)莓葉黃酮進(jìn)行提取分離，得到高純度的黃酮類物質(zhì)已成為當(dāng)今的研究熱點(diǎn)。傳統(tǒng)的分離純化黃酮類化合物的方法有液-液萃取法、柱色譜法等，還有氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography with mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用法、高效液相色譜（high-performance liquid chromatography， HPLC）法和HPLC-質(zhì)譜（HPLC combined with mass spectrometry，HPLC-MS）聯(lián)用法等［4-6］。在上述的方法中，多數(shù)以大量的有機(jī)溶劑作為流動相，對環(huán)境造成了不利的影響［7-8］。微乳液相色譜（microemulsion liquid chromatography，MELC）是一種將表面活性劑、助表面活性劑、油和水等物質(zhì)以一定的比例混合后形成的油水混合分散體系為流動相的液相色譜，溶質(zhì)的保留由其在固定相、微乳分散相和水相之間的分配平衡決定。通過調(diào)節(jié)優(yōu)化參數(shù)，可改善溶質(zhì)的保留行為，提高分離度［9-10］。微乳流動相含有水約90%，利用MELC對物質(zhì)進(jìn)行分離具有低污染、分離效果好、分離速度快的優(yōu)點(diǎn)［11］。

目前與藍(lán)莓葉黃酮相關(guān)的研究多集中在藍(lán)莓葉總黃酮的提取以及抗氧化活性的檢測，而在其成分的分離測定方面研究甚少。本實(shí)驗(yàn)利用MELC對藍(lán)莓葉黃酮進(jìn)行分離與測定，從表面活性劑、助表面活性劑、有機(jī)相和pH值4 個方面對色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，使藍(lán)莓葉黃酮的主要成分在短時間內(nèi)得到有效分離。以此建立準(zhǔn)確可靠、穩(wěn)定快速檢測藍(lán)莓葉黃酮成分的方法，為藍(lán)莓葉黃酮的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulphate，SDS）、聚氧乙烯（23）月桂醚（polyethylene glycol monoisotridecyl ether，Brij-35）均為分析純；兒茶素、蘆丁、槲皮素、山柰酚和楊梅酮標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞97%）上海阿拉丁試劑公司。乙酸乙酯、乙酸、乙醇、鹽酸、正丁醇（均為分析純） 北京化工廠；甲醇（色譜純）美國Fisher Chemical公司。

超純水通過Mili-Q水微乳凈化系統(tǒng)（Milford，USA）制得，所配制溶液需通過0.45 μm的濾膜（美國Millipore公司）進(jìn)行過濾，以此來保證流動相中無雜質(zhì)。

1.2儀器與設(shè)備

T6型新世紀(jì)紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；RE-301旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上?；ゼ褍x器有限公司；SHZ-CD型循環(huán)水真空泵 上海貝倫儀器設(shè)備有限公司；MELC系統(tǒng)：1525二進(jìn)制HPLC泵、2707自動進(jìn)樣系統(tǒng)、2489 UV/VIS檢測器、反相C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm） 美國Waters公司。

1.3方法

1.3.1藍(lán)莓葉黃酮樣品的制備

取500 mL質(zhì)量濃度為300 mg/mL的粗提藍(lán)莓葉黃酮溶液，準(zhǔn)確稱取經(jīng)50 g預(yù)處理過的DM130樹脂，在25 ℃條件下恒溫振蕩吸附4 h。以60%乙醇為洗脫劑，進(jìn)行靜態(tài)洗脫4 h，得到純化的藍(lán)莓葉黃酮提取物，將其冷凍干燥至恒質(zhì)量。準(zhǔn)確稱3 份10.0 g冷凍干燥后，分別加20 mL 70%乙醇（0.2%乙酸）溶液，超聲15 min，室溫條件下靜置，過濾，用70%乙醇溶液定容至100 mL。精密取1 mL，用甲醇定容至10 mL，在檢測前通過0.45 μm濾膜，待用［12］。

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密稱取真空干燥至恒質(zhì)量的5 種標(biāo)準(zhǔn)品各0.020 0 g，分別加甲醇超聲溶解后，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，定容，搖勻，配制成2.00 mg/mL儲備液。分別取5 種標(biāo)準(zhǔn)儲備液2 mL，混合后超聲混勻制成混合標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度為0.40 mg/mL。對混合標(biāo)準(zhǔn)溶液梯度稀釋至0.04、0.08、0.10、0.20、0.40 mg/mL。標(biāo)準(zhǔn)溶液在檢測前經(jīng)0.45 μm濾膜進(jìn)行過濾。

1.3.3色譜條件

檢測波長368 nm和279 nm；流速1.0 mL/min ；進(jìn)樣量10 μL。流動相1.0%乙酸乙酯，2.5%Brij-35，8.0%正丁醇，0.5%乙酸，pH 4.5。流動相配制好后超聲30 min，待微乳液呈透明溶液后用0.45 μm膜過濾。

2　結(jié)果與分析

2.1表面活性劑及質(zhì)量分?jǐn)?shù)的選擇

表面活性劑的類型和質(zhì)量分?jǐn)?shù)對微乳的形成和性質(zhì)有重要影響［13］。色譜分離的選擇性會受到表面活性劑類型的影響，表面活性劑改變了黃酮類物質(zhì)在微乳液滴間的分配性質(zhì)，并使黃酮類物質(zhì)與固定相間的作用發(fā)生改變［14-16］。微乳液體系中常用作為檢測黃酮類化合物的表面活性劑有SDS、Brij-35和吐溫20等。本實(shí)驗(yàn)采用SDS-乙酸乙酯-正丁醇和Brij-35-乙酸乙酯-正丁醇微乳體系為流動相，在微乳穩(wěn)定質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)，選擇2.5% SDS和1.0% Brij-35進(jìn)行考察［17］。2 種表面活性劑對5 種黃酮類物質(zhì)的保留因子（k）的影響不同，如表1所示。結(jié)果表明，由于SDS對微乳流動相的洗脫能力 較強(qiáng)，混合樣品與溶劑幾乎同時出峰，而Brij-35的洗脫能力相對較弱，能夠使5 種標(biāo)準(zhǔn)樣品混合液達(dá)到基線分離。因此，選擇Brij-35作為表面活性劑進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1　不同類型表面活性劑對黃酮類物質(zhì)保留因子的影響Table1　Effect of surfactants on the retention factors of five flavonoids

表面活性劑可以被固定相吸附，并能填充柱填料間存在的空隙［18］，待測樣品的保留時間會隨著表面活性劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而縮短［19-20］。

由圖1可以看出，隨著表面活性劑Brij-35 質(zhì)量分?jǐn)?shù)從0.5%增加到2.5%，混合標(biāo)品（兒茶素、蘆丁、槲皮素、山柰酚和楊梅酮）的出峰時間不斷縮短。當(dāng)Brij-35質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于2.0%時，5 種黃酮標(biāo)品達(dá)不到基線分離；增加Brij-35至2.5%，5 種物質(zhì)分離效果較好。如果Brij-35質(zhì)量分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加，則混標(biāo)的保留時間過短。因此，2.5% Brij-35作為最適表面活性劑添加量，保證了適當(dāng)?shù)南疵摃r間的同時，也保證了5 種黃酮標(biāo)準(zhǔn)品可以達(dá)到基線分離。

圖1　Brij-35添加量對5 種黃酮標(biāo)準(zhǔn)品色譜保留力的影響Fig.1　Effect of Brij-35 concentration on the retention times of five flavonoids

2.2助表面活性劑的影響

微乳液是通過表面活性劑將油相和水相進(jìn)行結(jié)合的，但是僅僅依靠表面活性劑、水相和油相3者組成的體系是極不穩(wěn)定的［21］。在助表面活性劑的作用下可以使體系更加的穩(wěn)定［22］。

圖2　正丁醇添加量對5 種黃酮標(biāo)準(zhǔn)品色譜保留力的影響Fig.2　Effect of n-butyl alcohol concentration on the retention times of five flavonoids

通過考察異丙醇、四氫呋喃和正丁醇3 種不同類型助表面活性劑對分離選擇性的影響發(fā)現(xiàn)，以異丙醇和四氫呋喃作為助表面活性劑，標(biāo)準(zhǔn)品出峰位置重疊，而正丁醇作為助表面活性劑可以使混合標(biāo)準(zhǔn)品中的5 個峰得到基線分離?？疾煺〈继砑恿康玫降慕Y(jié)果表明（圖2），添加5.0%正丁醇溶液使兒茶素和蘆丁出峰時間非常接近，保留時間過長。當(dāng)添加量增加至8.0%時，由于正丁醇提高了微乳液的增溶作用，標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間明顯縮短，且兒茶素和蘆丁可以達(dá)到最佳的基線分離效果。但正丁醇的添加量繼續(xù)增加對其分離影響不大。綜合考慮，選取8.0%作為正丁醇的添加量。

2.3pH值的影響

考察流動相在pH 3.2～5.2條件下藍(lán)莓葉黃酮的分離效果。如圖3所示，乙酸添加量為0.1%時，兒茶素和蘆丁出峰時間重疊。隨著乙酸添加量的增加，兒茶素和蘆丁的分離效果越來越好，在添加量0.5%、流動相pH 3.2的條件下，5 種黃酮類物質(zhì)基本可以達(dá)到基線分離。當(dāng)流動相中乙酸的添加量大于0.5%時，標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間過長，且流動相pH值過低易發(fā)生鍵合相水解，對色譜柱會有損害，縮短使用壽命。因此選擇在流動相中添加0.5%乙酸。

圖3　乙酸添加量（pH值）對5 種黃酮標(biāo)準(zhǔn)品色譜保留力的影響Fig.3　Effect of acetic acid concentration on the retention times of five flavonoids

2.4有機(jī)相的影響

有機(jī)相的類型和濃度都會因?yàn)槠錁O性的差異而對黃酮類物質(zhì)的出峰時間有著顯著的影響［23］。常作為有機(jī)相的溶劑有乙酸乙酯、正庚烷、正辛烷。這幾種有機(jī)溶劑對5 種黃酮類化合物的洗脫能力各不相同，正辛烷最大，乙酸乙酯最小，并且只有乙酸乙酯可以使被測5 種黃酮成分達(dá)到基線分離［24-25］。故選擇乙酸乙酯作為有機(jī)相進(jìn)行后續(xù)的工藝優(yōu)化。圖4顯示了0.1%～0.8%添加量的乙酸乙酯對標(biāo)準(zhǔn)品保留時間的影響。

圖4　乙酸乙酯添加量對5 種黃酮標(biāo)準(zhǔn)品色譜保留力的影響Fig.4　Effect of ethyl acetate concentration on the retention times of five flavonoids

由圖4可知，乙酸乙酯添加量對黃酮標(biāo)準(zhǔn)品的影響不如其他條件明顯。乙酸乙酯的添加量從0.1%提高到0.2%時，槲皮素、山柰酚和楊梅酮的保留時間有所延長，但乙酸乙酯的添加量繼續(xù)增加，對5 種黃酮標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間沒有太大影響。當(dāng)乙酸乙酯的添加量達(dá)到0.8%時，兒茶素和蘆丁的分離較好，因此選擇0.8%為乙酸乙酯的添加量。

2.5檢測波長的選擇

在以上實(shí)驗(yàn)中獲得的最優(yōu)條件下，測量混合標(biāo)準(zhǔn)品在279 nm和368 nm的出峰情況。如圖5所示，在279 nm條件下，5 種黃酮標(biāo)準(zhǔn)品峰形良好，出峰時間適當(dāng)，并無拖尾現(xiàn)象。在368 nm條件下楊梅酮沒有出峰，不能達(dá)到分離的目的。因此選擇279 nm作為分離藍(lán)莓葉黃酮的最佳檢測波長。綜合以上最優(yōu)條件，繪制5 種混合標(biāo)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表2。

圖5　279nm（A）和368 nm（B）檢測波長下混標(biāo)MELC色譜圖Fig.5　Microemulsion liquid chromatogram （MELC） of mixed standard solution of five flavonoids at different wavelengths

表2　MELC法測定5 種黃酮標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線Table2　Standard curve equations for the MELC determination of five flavonoids

2.6藍(lán)莓葉提取物中的黃酮成分含量

圖6　MELC法對藍(lán)莓葉提取物黃酮成分的含量測定Fig.6　Microemulsion liquid chromatogram （MELC） of flavonoids extracted from blueberry leaves

按照優(yōu)化得到的色譜條件，對3 個不同批次的藍(lán)莓葉提取物中的黃酮成分進(jìn)行測定，結(jié)果如圖6所示。由于藍(lán)莓葉黃酮中除了本研究的5 種物質(zhì)外，還含有多種其他成分，在進(jìn)行MELC分離時會出現(xiàn)多個物質(zhì)出峰接近的情況。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索的條件，在5 種物質(zhì)的相應(yīng)出峰時間計(jì)算出峰面積，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出藍(lán)莓葉黃酮中5 種組分含量。見表3。

表3　MELC法對藍(lán)莓葉提取物中5 種黃酮成分的含量測定（n=3）Table3　Contents of three flavonoids in the extract of blueberry leaves （n=3）

3　結(jié) 論

在綜合考慮保留時間和分離效果的前提下，本實(shí)驗(yàn)從表面活性劑等4 個方面對MELC分離檢測藍(lán)莓葉黃酮的條件進(jìn)行了摸索和優(yōu)化。得到最優(yōu)檢測參數(shù)：279 nm檢測波長下，使用2.5% Brij-35作為表面活性劑，8%正丁醇為助表面活性劑，0.8%乙酸乙酯為有機(jī)相，利用0.5%乙酸調(diào)節(jié)體系pH值為3.2，在以上條件下藍(lán)莓葉黃酮在20 min內(nèi)能夠得到有效分離。最終測得藍(lán)莓葉黃酮中含有兒茶素9.76 mg/g、蘆丁13.12 mg/g、山柰酚31.04 mg/g、槲皮素26.42 mg/g、楊梅酮20.30 mg/g。

本方法可在短時間內(nèi)同時檢測藍(lán)莓葉黃酮中5 種物質(zhì)的含量，并得到有效的分離，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，靈敏度高。為今后在生產(chǎn)實(shí)踐中開發(fā)利用藍(lán)莓葉提供了一定的理論基礎(chǔ)和方法指導(dǎo)。

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Isolation and Quantification of Flavonoids in Blueberry Leaves by Microemulsion Liquid Chromatography

ZHAO Dan1， SU Ning2， ZHENG Hongyan2， YANG Li2， HUO Tong1， WANG Changtao1，*
（1. School of Science， Beijing Technology and Business University， Beijing 100048， China；2. Chinese Academy of Inspection and Quarantine， Beijing 100123， China）

Purpose： To optimize the procedure for isolating flavonoids from blueberry leaves by microemulsion liquid chromatography （MELC） and to quantify the flavonoids obtained under the optimum conditions. Methods： Four MELC conditions including surfactant， cosurfactant， pH of the mobile phase and organic phase were optimized. Results： The optimum chromatographic conditions were determined as follows： 2.5% Brij-35 act as the surfactant， 8% 1-butanol as the cosurfactant， the mobile phase adjusted to pH 3.2 with 0.5% acetic acid， and 0.8% ethyl acetate as the organic solvent. The flavonoids in blueberry leaves could be separated efficiently and quantified precisely in 20 minutes under the above conditions. Conclusions： The flavonoids in blueberry leaves included catechinic acid （9.76 mg/g）， rutin （13.12 mg/g），kaempferol （31.04 mg/g）， quercetin （26.42 mg/g）， and myricetin （20.30 mg/g）.

blueberry leaves； flavonoids； microemulsion liquid chromatography； isolation； quantification

R151.3

A

1002-6630（2015）14-0091-05

10.7506/spkx1002-6630-201514018

2014-11-03

質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201310132；201410019）

趙丹（1988—），女，助理實(shí)驗(yàn)師，碩士，研究方向?yàn)樯锛夹g(shù)。E-mail：zhaodanustb@126.com

王昌濤（1975—），男，教授，博士，研究方向?yàn)橹参锕πС煞珠_發(fā)應(yīng)用。E-mail：wangct@th.btbu.edu.cn