乙二胺四乙酸驅(qū)鎘對慢性鎘中毒大鼠、小鼠的腎毒性

李光先， 鐘志勇， 陳嘉興， 余日安， 唐小江

（1. 廣東藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院， 廣州 510310； 2. 廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心， 南海 528248）

乙二胺四乙酸驅(qū)鎘對慢性鎘中毒大鼠、小鼠的腎毒性

李光先1，2， 鐘志勇2， 陳嘉興1，2， 余日安1， 唐小江2

（1. 廣東藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院， 廣州 510310； 2. 廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心， 南海 528248）

目的探討乙二胺四乙酸（EDTA）治療慢性鎘中毒動(dòng)物模型毒副作用。方法將雄性SD大鼠、雄性NIH小鼠分別隨機(jī)分為空白對照組和模型組。模型組腹腔注射CdCl2+ β-巰基乙醇（ME）的混合液，每日一次，連續(xù)5 d，末次染毒50 d及30 d后分別隨機(jī)分為模型對照組和EDTA治療組?？瞻讓φ战M和模型對照組腹腔注射生理鹽水； EDTA治療組按體質(zhì)量腹腔注射EDTA溶液，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后均采集動(dòng)物的尿液、血液腎臟及睪丸組織，檢測體內(nèi)Cd和組織病理檢查。結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，EDTA組大鼠、小鼠的腎臟Cd、尿Cd和血Cd含量明顯高于模型對照組（P＜0.05），并見腎小管蛋白質(zhì)沉淀。結(jié)論EDTA會(huì)引起體內(nèi)的鎘向腎臟富集，不宜用于慢性鎘中毒驅(qū)鎘。

慢性鎘中毒； 二胺四乙酸（EDTA）； 腎毒性

鎘是人類確定致癌物和腎毒物。根據(jù)環(huán)保部和國土資源部公報(bào)， 我國約有7%的土壤存在不同程度的鎘污染［1］。鎘超標(biāo)和鎘中毒事件頻發(fā)， 成為社會(huì)關(guān)注的熱點(diǎn)［2，3］。鎘進(jìn)入機(jī)體后逐漸在腎小管細(xì)胞內(nèi)富集， 影響鈣重吸收， 導(dǎo)致骨質(zhì)疏松、腎衰竭和癌癥等慢性危害［4］。有學(xué)者認(rèn)為， 二硫代氨基甲酸類、氨羧類以及巰基類絡(luò)合劑有驅(qū)鎘作用并已用于臨床研究， 但大量研究結(jié)果表明其對慢性鎘中毒無效或存在毒副作用， 因此目前沒有特效驅(qū)鎘解毒藥［5，6］。有人主張使用二胺四乙酸（EDTA）進(jìn)行體內(nèi)驅(qū)鎘， 但其安全性與有效性一直有爭議［7-9］。為此， 本文旨在通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探討EDTA對大、小鼠慢性鎘中毒的驅(qū)鎘效果及其副作用， 為驅(qū)鎘藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級雄性SD大鼠20只， 體質(zhì)量180±14 g；SPF級雄性NIH小鼠30只，體質(zhì)量17±5 g，均購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［SYXK（粵）2013-0002］，飼養(yǎng)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心比較醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室［SYXK（粵）2013-0002］。飼養(yǎng)條件：溫度20～26 ℃，相對濕度40%～70%，10～14 h晝夜間斷照明。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利和倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2主要試劑和儀器

氯化鎘（CdCl2·2.5H2O）購于天津市福晨化學(xué)試劑廠，批號：20081012； β-巰基乙醇（ME），Sigma公司，批號：M6250；EDTA由天津市福晨化學(xué)試劑廠提供，批號：130224。 BS224S電子天平（德國Sartorius 公司）； SET6040恒溫電熱板（深圳帆與航電子科技有限公司）； 全自動(dòng)生化分析儀（ECHO，意大利Logotec公司）； 石墨爐原子吸收光譜儀（型號: ZEENIT700，德國Analytikjena公司）； 輪轉(zhuǎn)切片機(jī)（德國LEICA公司 RM2135）； 生物組織全自動(dòng)脫水機(jī)、生物組織包埋機(jī)及冷凍機(jī)和生物組織全自動(dòng)染色機(jī)（湖北孝感醫(yī)用儀器有限公司 TS-12C、BM-VII、RS-18）； 正置顯微鏡（Olympus BX41），病理圖像分析系統(tǒng)（Image-Pro Express 5.1.1.14）。

1.3動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1EDTA對大鼠慢性鎘中毒模型的驅(qū)鎘試驗(yàn)將20只雄性SD大鼠隨機(jī)分為空白對照組（8只）和模型組（12只）。模型組大鼠腹腔注射3 μmol/kg CdCl2+60 μmol/kg β-巰基乙醇（ME）的混合液［10］，每日1次， 連續(xù)5 d， 末次染毒50 d后隨機(jī)分為模型對照組（6只）和EDTA治療組（6只）?？瞻讓φ战M和模型對照組腹腔注射生理鹽水； EDTA治療組按體質(zhì)量腹腔注射187.1 mg/kg的EDTA溶液， 每周5次， 連續(xù)3周； 試驗(yàn)期間每周稱量體質(zhì)量1次。按1.4采集尿液、血液及腎臟，檢測體內(nèi)Cd和組織病理檢查。

1.3.2EDTA對小鼠慢性鎘中毒模型的驅(qū)鎘試驗(yàn)將30只雄性NIH小鼠隨機(jī)分成空白組（10只）和模型組（20只）。模型組小鼠腹腔注射6 μmol/kg CdCl2+ 120 μmol/kg ME混合液［11］，每日1次，連續(xù)5 d，末次染毒30 d后隨機(jī)分為模型對照組（10只）和EDTA治療組（10只）。空白對照組和模型對照組腹腔注射生理鹽水； EDTA治療組腹腔注射93.6 mg/kg 的EDTA溶液，每周5次，連續(xù)4周； 試驗(yàn)期間每周稱量體質(zhì)量1次。按1.4采集尿液、血液及腎臟，檢測體內(nèi)Cd和組織病理檢查。

1.4樣品采集與鎘含量檢測

1.4.1樣品采集與處理試驗(yàn)結(jié)束前1 d，用代謝籠收集動(dòng)物24 h尿液，分別取1 mL采用生化分析法測定尿肌酐含量和1 mL用于檢測尿鎘。隨后經(jīng)動(dòng)物眼眶靜脈叢采血1 mL于加有1%肝素鈉30 μL的抗凝管中。用二氧化碳窒息法處死動(dòng)物， 采集動(dòng)物的腎臟和睪丸組織取其中一部分稱重后， 用5 mL濃硝酸+2 mL過氧化氫+0.5 mL高氯酸進(jìn)行熱消化，定溶于10 mL比色管； 取另一部分腎臟和睪丸組織以質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%甲醛溶液固定做病理學(xué)檢查。

1.4.2鎘含量檢測血鎘、尿鎘和腎、睪丸鎘采用石墨爐原子吸收光譜法測定［12，13］，

1.5統(tǒng)計(jì)分析

圖1　EDTA治療慢性鎘中毒大鼠的體質(zhì)量變化

圖2　EDTA治療慢性鎘中毒小鼠的體質(zhì)量變化

2　結(jié)果

2.1動(dòng)物體質(zhì)量變化

動(dòng)物按體質(zhì)量隨機(jī)分組后，各組間無差異（P＞0.05）。試驗(yàn)期間空白對照組和模型對照組體質(zhì)量穩(wěn)定增長。SD大鼠經(jīng)EDTA治療1周后，EDTA組各周體質(zhì)量較空白對照組和模型對照組均顯著下降（P＜0.05）（圖1）。但小鼠經(jīng)EDTA處理后， 各組間體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)意義（P＞0.05）（圖2）。

2.2大鼠血鎘濃度、腎鎘和睪丸含量

造模結(jié)束后，模型組大鼠的腎臟和睪丸Cd含量及血Cd濃度均顯著高于空白對照組（P＜0.05）。EDTA治療3周后，EDTA治療組大鼠的血Cd濃度、腎Cd含量較模型對照組升高（P＜0.05）（表1）。

2.3小鼠血鎘濃度、腎鎘和睪丸含量

造模結(jié)束后，模型組小鼠的腎臟和睪丸Cd含量及血Cd濃度較空白對照組上升（P＜0.05）。EDTA治療4周后，治療組小鼠的血Cd濃度和腎Cd含量顯著高于模型對照組（P＜0.05）（表2）。

2.4大、小鼠24 h尿鎘含量

EDTA治療慢性鎘中毒大鼠3周后，模型對照和EDTA治療組大鼠24 h尿Cd總量均高于空白對照組（P＜0.05）； EDTA組24 h尿Cd總量較模型對照組升高（P＜0.05）。EDTA治療慢性鎘中毒小鼠4周后，模型對照和EDTA治療組小鼠24 h尿鎘總量均高于空白對照組（P＜0.05）； EDTA組24 h尿鎘總量較模型對照組升高（P＜0.05）（表3）。

表1　EDTA治療慢性鎘中毒大鼠的血鎘腎鎘和睪丸鎘變化

表2　EDTA治療慢性鎘中毒小鼠的血鎘腎鎘和睪丸鎘變化

表3　EDTA治療慢性鎘中毒大、小鼠的尿鎘變化

2.5大、小鼠腎臟和睪丸組織病理學(xué)觀察

EDTA治療SD大鼠3周后，模型對照組33% （2/6）的動(dòng)物腎臟組出現(xiàn)腎小管內(nèi)蛋白沉積； 模型對照組和EDTA組個(gè)別動(dòng)物出現(xiàn)睪丸彌漫性曲細(xì)精管萎縮（圖3）。EDTA治療NIH小鼠4周后， EDTA組30% （3/10）的動(dòng)物出現(xiàn)腎臟病理改變， 包括腎小管擴(kuò)張、腎小管擴(kuò)張伴管型和腎小管上皮細(xì)胞肥大（圖4）。

3　討論

現(xiàn)有研究表明，鎘進(jìn)入體內(nèi)后，首先蓄積于肝臟，并誘導(dǎo)肝細(xì)胞合成金屬硫蛋白，并與之結(jié)合生成Cd金屬硫蛋白復(fù)合物（Cd-MT），再經(jīng)血液循環(huán)運(yùn)送到腎臟，經(jīng)腎小球?yàn)V過后被腎小管細(xì)胞重吸收。進(jìn)入腎小管細(xì)胞內(nèi)的鎘不能被排出，隨著時(shí)間的延長腎鎘含量不斷升高，導(dǎo)致細(xì)胞功能和器質(zhì)性改變［4，14］。因此，腎臟為慢性鎘中毒的靶器官，治療慢性鎘中毒的關(guān)鍵是驅(qū)除腎臟細(xì)胞內(nèi)的鎘。

本研究采用EDTA腹腔注射治療慢性鎘中毒大鼠模型3周和慢性鎘中毒小鼠模型4周后，結(jié)果顯示； EDTA組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腎臟Cd含量顯著高于模型對照； 隨著治療時(shí)間的延長腎臟鎘蓄積增加，從而導(dǎo)致大量的腎臟實(shí)質(zhì)性病理改變。說明EDTA不能用于驅(qū)鎘治療，這與以往文獻(xiàn)報(bào)道相一致［7，15］。另外， EDTA組的動(dòng)物尿Cd含量高于模型對照，也高于治療前水平，說明EDTA增加鎘從尿中排出，這正是目前認(rèn)為可以用EDTA來驅(qū)鎘的原因。但從用藥后的動(dòng)物體質(zhì)量看，EDTA有較強(qiáng)的毒副作用，高劑量治療一周后體質(zhì)量即顯著下降，因此在慢性鎘中毒時(shí)，不應(yīng)采用EDTA治療。

國內(nèi)外關(guān)于EDTA治療鎘中毒的研究均有報(bào)道，小劑量的EDTA對慢性鎘中毒患者驅(qū)鎘療效確切，但對腎臟重吸收功能有一定的影響； EDTA用于臨床鎘中毒治療時(shí)亦能促使患者尿鎘升高，但隨后患者腎功能下降，但其機(jī)制尚不清楚［7，16］。本課題組認(rèn)為EDTA驅(qū)鎘及其毒副作用的機(jī)制可能為，因其為大分子絡(luò)合物，不能進(jìn)入腎臟及肝臟細(xì)胞與胞內(nèi)Cd2+結(jié)合將其帶出，但可以螯合血液中的部分Cd并從尿液排出，同時(shí)會(huì)不斷促使血液中部分Cd向肝臟和腎臟轉(zhuǎn)移，從而致使肝臟和腎臟內(nèi)鎘含量上升加重機(jī)體損害。另外，睪丸組織是鎘暴露的特異敏感性靶器官。鎘能引起睪丸變性，生精小管的損害，從而影響大鼠生殖能力［17］。本研究結(jié)果表明模型組和EDTA組有的動(dòng)物睪丸曲精小管萎縮，說明EDTA對鎘的睪丸毒性也無保護(hù)作用。綜上所述，EDTA用于驅(qū)鎘時(shí)，會(huì)促使血液中的Cd2+向肝臟、腎臟等臟器轉(zhuǎn)移對機(jī)體無保護(hù)作用，加之本身具有一定的毒副作用，在慢性鎘中毒時(shí)，不應(yīng)采用EDTA治療。

圖3　EDTA對慢性鎘中毒大鼠腎臟和睪丸病理改變（HE ×200）

圖4　EDTA對慢性鎘中毒小鼠腎臟病理改變（HE ×200）

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Nephrotoxicity of EDTA Utilized to Treat Chronic Cadmium Poisoning in Rats and Mice

LI Guang-xian1，2， ZHONG Zhi-yong2， CHEN Jia-xing1，2， YU Ri-an1，TANG Xiao-jiang2
（1. School of Public Health， Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510310， China；2. Guangdong Medical Laboratory Animal Center， Nanhai 528248， China）

ObjectiveTo investigate the side effects of （EDTA） utilized to treat chronic Cadmium poisoning in animals. MethodsMale SD rats and NIH mice were randomly divided to the control group and model group respectively. The model group animals were daily given CdCl2+ 2-Mercaptoethanol （ME， ip） for 5 days. 50 days or 30 days later， the rats or mice were randomly divided into model control group and EDTA treatment group respectively. The control group and model control group were injected with saline， and the EDTA group animals were treated with EDTA solution .At the end of the experiment，theurine， blood， kidneys and testis were collected for detecting the Cd concentration and pathologic changes. ResultsCompared with the model control group， in the EDTA treated groups （both in rats and mice）， the Cd levels of kidney， urine and blood all increased significantly （P＜0.05）； protein precipitation could be detected in kidney tubules. ConclusionThe EDTA could promote the accumulation of cadmium in the kidney. EDTAis not recommended to treatchronic cadmium poisoning patients.

Chronic cadmium poisoning； EDTA； Nephrotoxicity

Q95-33

A

1674-5817（2015）01-0056-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.01.012

2014-07-17

廣東省重大科技專項(xiàng)（2012A080201011），佛山市院市合作項(xiàng)目（2012A04）

李光先（1987-）， 女， 碩士研究生， 主要研究方向: 環(huán)境與職業(yè)毒理學(xué)， E-mail: lig_xian@163.com

唐小江， 博士、主任醫(yī)師，E-mail: river-t@126.com