三種大鼠骨質(zhì)疏松模型的比較研究

馮　佳，向　陽(yáng)，夏　燕，陳安平，楊年安，龔書識(shí)，袁　林

（1. 風(fēng)濕性疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，恩施 445000；

2.湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院，恩施 445000）

三種大鼠骨質(zhì)疏松模型的比較研究

馮佳1，向陽(yáng)1，夏燕1，陳安平1，楊年安1，龔書識(shí)2，袁林1

（1. 風(fēng)濕性疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，恩施 445000；

2.湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院，恩施 445000）

目的觀察和比較不同造模方法對(duì)大鼠骨質(zhì)疏松模型特點(diǎn)的影響。方法選用6月齡的雌性SD大鼠40只，分為正常組、去勢(shì)組、糖皮質(zhì)激素組和維甲酸組。造模6周后，比較各組大鼠血清鈣（Ca）、磷（P）、堿性磷酸酶（ALP）、骨密度和骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)的變化。結(jié)果與正常組相比，去勢(shì)組及維甲酸組大鼠血清Ca降低，P、ALP增高，股骨骨密度、骨小梁厚度、數(shù)量均明顯減少，骨小梁間距增大；糖皮質(zhì)激素組與正常組相比，各參數(shù)無(wú)顯著差異。結(jié)論去勢(shì)骨質(zhì)疏松模型造模成功。短期間斷使用糖皮質(zhì)激素對(duì)大鼠松質(zhì)骨的影響不明顯；大劑量維甲酸能使大鼠出現(xiàn)骨量減少，骨微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，但其毒副作用較大。

骨質(zhì)疏松（OP）； 去勢(shì)（OVX）； 糖皮質(zhì)激素（GC）； 維甲酸（RA）； 大鼠模型

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是由內(nèi)分泌失調(diào)、某些藥物的長(zhǎng)期應(yīng)用、營(yíng)養(yǎng)、遺傳等多因素所致，以骨量減少，骨組織微細(xì)結(jié)構(gòu)破壞導(dǎo)致骨骼脆性增加和骨折危險(xiǎn)性增加為特征的系統(tǒng)性全身性骨骼疾?。?］。我國(guó)骨質(zhì)疏松患病率為16.1%，女性為19.9%，男性為11.2%，女性骨質(zhì)疏松的發(fā)病率明顯高于男性，而且隨著年齡增長(zhǎng)呈現(xiàn)升高趨勢(shì)［2］。多年來， 為深入研究成骨與破骨平衡原理、骨丟失的病理生理機(jī)制，篩選防治骨丟失的藥物， 已復(fù)制了許多動(dòng)物模型。目前研究OP的常用動(dòng)物模型制作方法有去勢(shì)（Ovariectomy，OVX），糖皮質(zhì)激素（glucocorticoid，GC）、維甲酸（retinoic acid，RA）誘導(dǎo)等。國(guó)家新藥審批條例明確指出，欲申報(bào)抗OP新藥，必須對(duì)不同OP動(dòng)物模型均療效明顯。本實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠分別進(jìn)行去勢(shì)，糖皮質(zhì)激素、維甲酸誘導(dǎo)，觀察短期造模后大鼠血生化指標(biāo)、股骨骨密度、骨組織形態(tài)學(xué)的改變及不同造模方法間的差異，以選擇最佳的短期造模方法為目的，以服務(wù)于今后骨質(zhì)疏松癥的實(shí)驗(yàn)及臨床研究。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)6月齡雌性SD大鼠40只，體質(zhì)量200 ±20 g，由武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［SCXK（鄂）2008-0004］。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物

維A酸（維甲酸）片，國(guó)藥準(zhǔn)字H20083494，山東良福制藥有限公司生產(chǎn)。醋酸潑尼松片，國(guó)藥準(zhǔn)字H33021207， 浙江仙居制藥股份有限公司生產(chǎn)。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器

切片機(jī)（RM2235， 德國(guó)）， 自動(dòng)脫水機(jī)（TC-120S），電熱恒溫干燥箱（GZX-DH-40X45），恒溫?cái)偲酒瑱C(jī)（TK-21 8IV），雙能X掃描骨密度儀DX A （Prodigy，美國(guó)），彩色數(shù)碼照像系統(tǒng)（DP70，日本），熒光顯微鏡（BX50，日本），BECMAN-AU680全自動(dòng)生化分析儀。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與給藥大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為4組，即正常組、去勢(shì)組、糖皮質(zhì)激素組和維甲酸組各10只。正常組不作特殊處理（為對(duì)照組）； 去勢(shì)組大鼠去除雙側(cè)卵巢； 糖皮質(zhì)激素組， 灌胃給予醋酸潑尼松4.5 mg/kg， 每周2次（每周一及周四）； 維甲酸組， 灌胃給予維甲酸70 mg/kg，每日1次。實(shí)驗(yàn)時(shí)間6周。

1.4.2大鼠去勢(shì)方法以體積分?jǐn)?shù)10%水合氯醛， 按體質(zhì)量0.35 mL/100 g腹腔麻醉，剪毛備皮，常規(guī)消毒，于肋弓下脊柱兩側(cè)1 cm處，切開皮膚，逐層分離脂肪、肌肉，進(jìn)入腹腔，用眼科鑷找到輸卵管后，順著輸卵管找到梅花狀的卵巢，結(jié)扎輸卵管后，剪去卵巢，分層縫合肌肉、皮膚。按同樣的方法去除大鼠對(duì)側(cè)卵巢。術(shù)后3 d，青霉素（80×105U）肌肉注射0.1 mL/只。

1.4.3實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的檢測(cè)

1.4.3.1血生化指標(biāo)檢測(cè)采用眼球取血，血清鈣（Ca）、磷（P）、堿性磷酸酶（ALP）均采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。

1.4.3.2骨密度測(cè)定取左側(cè)股骨，清除周圍軟組織，生理鹽水洗凈，雙能X線骨密度測(cè)量?jī)x小動(dòng)物軟件測(cè)定各組大鼠股骨骨密度。

1.4.3.3骨組織形態(tài)學(xué)測(cè)定取大鼠右側(cè)股骨下三分之一，置于體積分?jǐn)?shù)10%甲醛溶液中固定24 h。使用EDTA脫鈣液脫鈣48 h，直至能用大頭針無(wú)阻力插入股骨為止。將股骨放入自動(dòng)脫水機(jī)中自動(dòng)脫水、透明、浸蠟12 h。石蠟包埋，用切片機(jī)沿股骨矢狀面切成5 μm薄片， 行HE染色。骨組織切片置于顯微鏡下， 彩色數(shù)碼照像系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集。1.4.3.4骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)測(cè)定使用Image-Pro Plus6.0圖像分析系統(tǒng)分析所采集的圖像，選擇小梁排列整齊， 連續(xù)性好， 成網(wǎng)狀連接， 相鄰骨小梁間距較小， 寬度均勻。去勢(shì)組骨小梁連續(xù)性破壞， 排列紊亂， 數(shù)量減少， 厚度變細(xì)， 游離斷端增多， 骨小梁間距增大。糖皮質(zhì)激素組骨小梁網(wǎng)狀連接存在， 游離斷端少， 厚度較均勻。維甲酸組骨小梁寬度較細(xì)，有少許游離斷端， 相鄰骨小梁間距大（圖1A～D）。干骺板下5 mm作為測(cè)量指標(biāo)范圍，測(cè)量骨組織形態(tài)學(xué)靜態(tài)參數(shù)：骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁間距（Tb.Sp）及骨小梁數(shù)量（Tb.N）。

表1　各組大鼠血生化指標(biāo)Table 1　The blood biochemical items in each groups of rat

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1一般情況

去勢(shì)造模組大鼠體質(zhì)量逐漸增加，反應(yīng)遲鈍，活動(dòng)少懶動(dòng)。糖皮質(zhì)激素組大鼠灌胃過程中，體質(zhì)量增加不明顯，未出現(xiàn)明顯異常舉動(dòng)及反應(yīng)。維甲酸組大鼠灌胃過程中，進(jìn)食減少，體質(zhì)量減輕，精神萎靡，毛發(fā)稀疏無(wú)光澤，一周后眼、鼻出現(xiàn)血性分泌物。

2.2血清中Ca、P、ALP含量

與正常組相比，去勢(shì)組大鼠血清中Ca降低、P增高（P＜0.05），血ALP含量明顯增高（P＜0.01）。糖皮質(zhì)激素組血Ca、P、ALP與正常組相比無(wú)顯著差異（P＞0.05）。與正常組比較，維甲酸組大鼠血Ca降低，血P、ALP含量增高（P＜0.05）（表1）。

2.3骨密度

與正常組相比，去勢(shì)組大鼠股骨骨密度明顯減少（P＜0.01）； 糖皮質(zhì)激素組較正常組股骨骨密度有所降低（P＞0.05）； 維甲酸組與正常組比較，骨密度減少（P＜0.05）（表2）。

骨組織HE染色光學(xué)顯微鏡下觀察示: 正常組骨

表2　各組大鼠股骨雙能X線骨密度測(cè)定Table 2　The bone mineral density in each groups of rat

圖1　大鼠股骨骨小梁病理學(xué)觀察Figure 1　Pathological observation on bone trabecula of rats

2.5骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)結(jié)果

去勢(shì)組大鼠股骨骨小梁厚度、數(shù)量均比正常組明顯減少（P＜0.01）， 骨小梁間距明顯增大（P＜0.01）。糖皮質(zhì)激素組與正常組相比， 各參數(shù)無(wú)顯著差異（P＞0.05）。維甲酸組較正常組， 股骨骨小梁厚度、數(shù)量均減少， 骨小梁間距增大（P＜0.05）（表3）。

表3　各組大鼠股骨骨小梁厚度、骨小梁間距及骨小梁數(shù)量比較Table 3　The comparison among femoral trabecular bonethickness，spacing and number in each groups of rat

3　討論

骨質(zhì)疏松癥是多因素相關(guān)的代謝性骨病，只有深入研究其發(fā)病機(jī)制才有可能找到確實(shí)有效的防治方法和手段。骨密度是診斷骨質(zhì)疏松的金標(biāo)準(zhǔn)，最常用的檢測(cè)方法是雙能X線吸收法（DXA）［3］。骨小梁厚度、骨小梁間距和骨小梁數(shù)量是反映單位面積骨小梁結(jié)構(gòu)特征的參數(shù)。通過松質(zhì)骨靜態(tài)學(xué)參數(shù)可以了解骨質(zhì)疏松模型是否建立成功。骨代謝生化指標(biāo)較病理變化早，一般在術(shù)后1～2.5個(gè)月就有明顯變化，可作為反映早期骨量丟失的靈敏指標(biāo)，有助于造模的預(yù)測(cè)性診斷［4］。將骨量、骨生化指標(biāo)與骨組織形態(tài)學(xué)結(jié)合在一起，可全面反映骨病理生理及功能變化， 為合理評(píng)價(jià)骨質(zhì)疏松提供理論依據(jù)。

自1969年Saville首次建立去卵巢骨質(zhì)疏松模型，已成為研究絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的經(jīng)典動(dòng)物模型。雌激素水平下降，使破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)，成骨細(xì)胞功能代償性提高，骨吸收大于骨形成，造成松質(zhì)骨骨量明顯減少、微結(jié)構(gòu)退化，以致強(qiáng)度下降、脆性增加。有研究［5］認(rèn)為絕經(jīng)后婦女血鈣水平隨年齡增加而減少，血磷隨增齡而增加，可能與絕經(jīng)之后雌激素降低有關(guān)。ALP是反映成骨細(xì)胞功能的重要標(biāo)志，骨形成與其活性相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)選用6月齡雌性大鼠，其骨代謝處于相對(duì)穩(wěn)定階段，去勢(shì)后1月發(fā)現(xiàn)骨密度減少，骨組織形態(tài)學(xué)遭到破壞以及骨代謝生化指標(biāo)的變化均可說明造模成功。

糖皮質(zhì)激素長(zhǎng)期、大量或持續(xù)使用可抑制成骨細(xì)胞活力， 使骨質(zhì)形成發(fā)生障礙， 導(dǎo)致骨質(zhì)疏松，是最常見的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥［6］。但對(duì)短期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素的研究相對(duì)較少。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素組大鼠骨量、骨微結(jié)構(gòu)以及血生化指標(biāo)較正常組沒有顯著變化。骨密度、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)量雖有降低的趨勢(shì)，但還不足以發(fā)現(xiàn)其骨丟失情況。說明短期間斷使用糖皮質(zhì)激素，對(duì)大鼠松質(zhì)骨的影響可能不明顯，其具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

維甲酸是維生素A的衍生物，是治療白血病的一種重要藥物，伴有骨質(zhì)疏松等副作用。維甲酸可激活破骨細(xì)胞，促進(jìn)骨吸收。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)維甲酸組大鼠的骨量較正常大鼠減少，骨形態(tài)學(xué)參數(shù)（骨小梁厚度、骨小梁數(shù)量、骨小梁間距）反映出骨小梁微觀結(jié)構(gòu)的變化，表現(xiàn)為骨小梁稀疏變細(xì)、相鄰小梁間距增大。血Ca、P含量及ALP活性改變，說明大量應(yīng)用維甲酸后，影響了成骨、破骨過程以及鈣磷代謝。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大劑量使用維甲酸，10只實(shí)驗(yàn)大鼠死亡5只，致死率達(dá)50%，并且還出現(xiàn)眼、鼻血性分泌物等明顯副作用。

絕經(jīng)后與各種藥物引起的骨質(zhì)疏松是目前臨床中最常見的骨質(zhì)疏松癥，但在體內(nèi)的作用機(jī)制卻不盡相同。去勢(shì)大鼠是研究絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的經(jīng)典模型，造模過程較無(wú)創(chuàng)操作復(fù)雜，術(shù)后要特別注意防止感染。隨著糖皮質(zhì)激素的應(yīng)用越來越廣泛，并發(fā)的骨折嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量，這反映了建立合適的動(dòng)物模型進(jìn)行相關(guān)基礎(chǔ)研究的必要性。而短期間斷使用糖皮質(zhì)激素造模，對(duì)大鼠松質(zhì)骨的影響可能不明顯。大劑量維甲酸能使大鼠短期內(nèi)出現(xiàn)骨量減少，骨微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，但其毒副作用較大。三種大鼠骨質(zhì)疏松模型各有其特點(diǎn)。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)去勢(shì)骨質(zhì)疏松造模方法較糖皮質(zhì)激素及維甲酸造模方法，具有效率高、安全性好的優(yōu)勢(shì)。據(jù)此，作者建議：在骨質(zhì)疏松的研究中，應(yīng)深入了解各種模型的優(yōu)缺點(diǎn)，根據(jù)研究目的和條件選擇最佳的模型及檢測(cè)指標(biāo)。

［1］張波， 楊述華， 許偉華， 等. 骨質(zhì)疏松癥與骨關(guān)節(jié)炎關(guān)系及其最新治療進(jìn)展［J］. 中華關(guān)節(jié)外科雜志， 2012， 6（2）:324-328.

［2］沈彥明， 孫陳靜， 尹彥亮.老年骨質(zhì)疏松癥防治研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)， 2013， 40（9）:1757-1762.

［3］王鍵， 龔顏， 曾榮， 等. 去勢(shì)雌性大鼠骨質(zhì)疏松模型的研究［J］. 海南醫(yī)學(xué)， 2013， 24（3）:424-426.

［4］虞驚濤， 馬信龍， 馬劍雄. 骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型評(píng)價(jià)方法［J］.中華骨質(zhì)疏松和骨礦鹽疾病雜志， 2014， 7（1）: 66-70.

［5］趙璽， 趙文， 孫璟， 等. 骨代謝指標(biāo)與骨關(guān)節(jié)炎及絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的關(guān)系［J］.中國(guó)組織工程研究， 2014， 18（2）:245-250.

［6］張雅蓉， 唐舸， 劉杉， 等. 5種常用大鼠骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型的特點(diǎn)［J］. 國(guó)際口腔醫(yī)學(xué)雜志， 2013， 40（5）:629-633.

Comparative Study on Three Kinds of Osteoporosis Model in Rats

FENG Jia1， XIANG Yang1， XIA Yan1， CHEN An-ping1， YANG Nian-an1， GONG Shu-shi2， YUAN Lin1
（1. Hubei Provincial Key Laboratory of Occurrence and Intervention of Rhumatic Diseases，Enshi 445000， China；2. University Hospital of Hubei University for Nationalities， Enshi 445000， China）

ObjectiveTo observe and compare the effects of different modeling methodsof osteoporosis on rats. MethodsFemale SD rats at age of six months were divided into normal group，ovariectomized group， glucocorticoid group， and retinoic acid group. After 6 weeks， the changes of serum calcium， phosphorus， alkaline phosphatase and bone density， bone histomorphometry parameters were compared. ResultsCompared with normal group， the serum Ca in ovariectomized rats was decreased， serum P and ALP were increased， bone mineral density， trabecular thickness and trabecular number were decreased， and trabecular spacing was increased.The Glucocorticoid group compared with normal group， there was no significant difference in each parameters. Compared with the normal group， retinoic acid rat’s serum Ca was decreased， serum P and ALP were increased，bone mineral density， trabecular thickness and trabecularnumber were decreased， and trabecular spacing was increased. ConclusionThe osteoporotic model was successful.With the short-term intermittent use of glucocorticoid，effects on the cancellous bone in rats may not be obvious， large dose of retinoic acid can reduce bone mass of rats in short-term and change the bone micro structural， but it had obvious side effects.

Osteoporosis； Ovariectomy； Glucocorticoid； Retinoic Acid； Rat Model

Q95-33

A

1674-5817（2015）01-0052-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.01.011

2014-07-08

湖北民族學(xué)院校園項(xiàng)目（MY2011B008）； 湖北民族學(xué)院民大醫(yī)院院內(nèi)課題（2013-6）， 湖北醫(yī)學(xué)領(lǐng)軍人才培養(yǎng)工程專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助

馮佳（1985-）， 女， 碩士， 主要從事風(fēng)濕病方面的研究

袁林（1974-）， 男， 博士， 主要從事風(fēng)濕病方面的研究， E-mail: linyuanchina@126.com