牛布魯氏菌病不同血清學(xué)檢測方法的比較分析

趙鳳菊，劉坤洋，于學(xué)武，閆明媚，李井春，張雅為，顧貴波

（遼寧省動物疫病預(yù)防控制中心，遼寧沈陽110164）

牛布魯氏菌病不同血清學(xué)檢測方法的比較分析

趙鳳菊，劉坤洋，于學(xué)武，閆明媚，李井春，張雅為，顧貴波

（遼寧省動物疫病預(yù)防控制中心，遼寧沈陽110164）

布魯氏菌病的診斷主要采用細(xì)菌學(xué)和血清學(xué)方法，但因細(xì)菌學(xué)方法費時、費力、危險性高，血清學(xué)方法便成為布魯氏菌病診斷的主要方法。本研究利用RBPT、SAT、CFT、i-ELISA和c-ELISA檢測試劑盒對270份牛血清樣品進行檢測，評價不同檢測方法對我國布魯氏菌病的診斷價值。試驗結(jié)果表明：RBPT檢測為陽性的樣品數(shù)量最多；SAT與CFT兩種試驗方法差異顯著，漏檢率可達23.17%～24.39%；i-ELISA、c-ELISA方法與RBPT的符合率、陽性檢出率均高于SAT和CFT；i-ELISA、c-ELISA方法與SAT和CFT兩種方法綜合判定結(jié)果無顯著差異；i-ELISA與c-ELISA兩種檢測方法無顯著差異。

虎紅平板凝集試驗；試管凝集試驗；補體結(jié)合試驗；ELISA方法

布魯氏菌病（Brucellosis）簡稱布病，是由布魯氏菌侵入機體后引起的傳染-變態(tài)反應(yīng)性人畜共患病[1]，是國際貿(mào)易檢疫中必檢的一種傳染病。本病在世界范圍內(nèi)廣泛流行，近年來在全球范圍內(nèi)，呈現(xiàn)較高的發(fā)病率[2-3]。該病不僅給畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，而且給消費者帶來嚴(yán)重的公共威脅[4]。目前，我國動物布病監(jiān)測中主要采用國標(biāo)中規(guī)定的虎紅平板凝集試驗（RBPT）、全乳環(huán)狀試驗（MRT）、試管凝集試驗（SAT）和補體結(jié)合試驗（CFT）。20世紀(jì)80年代我國就有關(guān)于ELISA方法在布病診斷方面的研究，但只有用于牛布魯氏菌病診斷的ELISA檢測方法是世界動物衛(wèi)生組織（OIE）規(guī)定的國際貿(mào)易指定試驗之一[5]。

本研究對保存的牛血清樣品同時使用RBPT、SAT、CFT、間接ELISA（i-ELISA）和競爭ELISA（c-ELISA）5種血清學(xué)檢驗法進行檢測，通過試驗比較不同檢測方法的差異，探討不同檢測方法在牛布病診斷中的意義。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及試劑盒布魯氏菌虎紅平板凝集抗原、布魯氏菌試管凝集抗原、布魯氏菌補體結(jié)合試驗抗原、溶血素、補體、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清及標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，均購自中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所。i-ELISA和c-ELISA試劑盒購自瑞典SVANOVA公司，批號分別為：P01448、P01418。0.5%石炭酸生理鹽水、綿羊紅細(xì)胞等其他試劑均由遼寧省動物疫病預(yù)防控制中心配制。

1.2 血清樣本臨床樣品為未經(jīng)免疫的牛血清樣品，共270份，其中RBPT陽性樣品205份，RBPT陰性樣品65份。

1.3 試驗器材微量移液器、三分玻璃試管、酶標(biāo)儀（TECAN）、酶標(biāo)板自動清洗劑（DEM-Ⅲ）、試管架、振蕩器、37℃恒溫培養(yǎng)箱等。

1.4 試驗方法及判定標(biāo)準(zhǔn)

1.4.1 RBPT、SAT、CFT RBPT、SAT、CFT試驗方法及判定標(biāo)準(zhǔn)參照我國《動物布魯氏菌病診斷技術(shù)》（GB/T 18646-2002）。

1.4.2 i-ELISA和c-ELISA試驗步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.5 統(tǒng)計分析方法試驗結(jié)果使用Excel進行錄入，對RBPT、SAT、CFT、i-ELISA和c-ELISA試驗結(jié)果應(yīng)用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SAT與CFT的比較用SAT與CFT方法對RBPT篩選出的205份陽性血清樣本和65份陰性血清樣本進行檢測，檢測結(jié)果見表1。結(jié)果表明：205份RBPT陽性血清樣本SAT檢測出108份陽性樣本、42份可疑和55份陰性樣本，65份RBPT陰性血清樣本用SAT檢測均為陰性，與RBPT的符合率為63.70%；205份RBPT陽性血清樣本CFT檢測出121份陽性樣本、3份可疑和81份陰性樣本，65份RBPT陰性血清樣本用CFT檢測均為陰性，與RBPT的符合率為68.89%，SAT與CFT的符合率為60.98%；205份RBPT陽性血清樣本采用SAT與CFT相結(jié)合的方法，最終判定為146份陽性、18份可疑和41份陰性，SAT的陽性符合率為73.97%，CFT的陽性符合率為82.88%，Kappa值為0.663。利用SPSS 17.0軟件對SAT與CFT兩種試驗方法試驗結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析，χ2(1,0.95)值為11.57，Kappa值為0.327，SAT與CFT檢測結(jié)果統(tǒng)計學(xué)差異極其顯著（P＜0.01）。

表1 SAT與CFT的檢測結(jié)果比較Table1 Comparison of detection results about SAT and CFT

2.2 RBPT與ELISA方法的比較用ELISA方法對RBPT篩選出的205份陽性血清樣本和65份陰性血清樣本進行檢測，檢測結(jié)果見表2。利用SPSS 17.0軟件對不同試驗方法的試驗結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果表明：205份RBPT陽性血清樣本i-ELISA檢測出157份陽性、48份陰性，65份RBPT陰性血清樣本均為陰性，與RBPT的符合率為82.22%，χ2（1,0.95）值為46.02，Kappa值為0.617，RBPT與i-ELISA檢測結(jié)果統(tǒng)計學(xué)差異極其顯著（P＜0.01）；205份RBPT陽性血清樣本c-ELISA檢測出156份陽性、49份陰性，65份RBPT陰性血清樣本均為陰性，與RBPT的符合率為81.85%，χ2(1,0.95)值為47.02，Kappa值為0.611，RB-PT與c-ELISA檢測結(jié)果統(tǒng)計學(xué)差異極其顯著（P＜0.01）；i-ELISA與c-ELISA兩種試驗方法的符合率為93.33%，χ2(1,0.95)值為0.056，Kappa值為0.865，i-ELISA與c-ELISA檢測結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異。

表2 RBPT與ELISA方法的檢測結(jié)果比較Table2 Comparison of detection results about RBPT and ELISA

2.3 ELISA方法與SAT和CFT方法綜合判斷結(jié)果的比較對RBPT篩選出的205份陽性血清樣本，通過SAT檢測為陽性的樣本判為陽性。對SAT檢測為陰性的樣本再通過CFT進行檢測，CFT檢測為陽性的判為陽性，檢測為陰性的最終判為陰性。通過對ELISA方法檢測結(jié)果與SAT和CFT方法綜合判斷結(jié)果進行比較，i-ELISA、c-ELISA方法與SAT和CFT綜合判定結(jié)果的符合率分別為80.37%、83.33%。利用SPSS 17.0軟件對SAT與CFT綜合判定結(jié)果和i-ELISA、c-ELISA的檢測結(jié)果進行分析，結(jié)果表明：SAT和CFT綜合判定結(jié)果與i-ELISA、c-ELISA的χ2（1,0.95）值分別為1.53、0.97，Kappa值分別為0.589、0.476，約登指數(shù)分別為0.728和0.846，均無統(tǒng)計學(xué)差異。

表3 SAT和CFT方法綜合判定結(jié)果與ELISA方法檢測結(jié)果的比較Table3 Comparison of detection results about comprehensive comparison judgment detection results of SAT and CFT with the ELISA

3 討論與小結(jié)

目前，血清學(xué)方法仍為動物布病檢測的主要方法，在我國動物布病的診斷中主要使用RBPT進行初篩，SAT、CFT相結(jié)合的方法進行確診的診斷程序。通過本試驗發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用RBPT對布病牛的檢出率明顯高于SAT、CFT與ELISA方法，同時因RBPT具有特異、敏感、廉價、操作簡便的特點被廣泛應(yīng)用于本病的初篩診斷。但因嚴(yán)重溶血、試驗溫度、交叉反應(yīng)或抗原抗體反應(yīng)超過4 min后出現(xiàn)纖維素的凝集塊，有時會產(chǎn)生假陽性結(jié)果[6]。因此，還需要通過已建立的確證體系進行最終的判定。

SAT、CFT為我國布病診斷的法定試驗，其中CFT還是世界動物衛(wèi)生組織（OIE）規(guī)定的國際貿(mào)易指定的布病的確診試驗之一。SAT檢測IgM敏感性較高，不僅可以用于布病的早期診斷，也可以用于人畜布魯氏菌菌苗免疫后機體出現(xiàn)最早血清抗體的檢測[7]，但不適用于犬種和綿羊附睪種布魯氏菌感染動物的檢測，且操作繁雜、費時、結(jié)果判定受主觀因素影響大，單獨使用時特異性較差，不能區(qū)分人工免疫和自然感染[8]。CFT主要適用于動物機體感染中、后期的實驗室診斷，但CFT不適合作為豬的布病檢測，同時由于CFT條件要求較高，操作復(fù)雜，參與的成份多，對操作者要求也比較高，且不能鑒別人工免疫和自然感染，也難以在基層應(yīng)用以及進行現(xiàn)場檢測。于桂芳等[9]通過對奶牛布魯氏菌病試管凝集試驗與補體結(jié)合試驗結(jié)果的差異分析發(fā)現(xiàn)，如果只把補體結(jié)合試驗作為奶牛布病監(jiān)測的最終判定結(jié)果，將有35.9%試管凝集陽性奶牛被漏判為陰性。通過本試驗也發(fā)現(xiàn)SAT與CFT這兩種試驗方法統(tǒng)計學(xué)差異極其顯著，一致性較低，如果只用其中一種方法進行診斷會出現(xiàn)誤診、漏診現(xiàn)象，漏檢率可達到23.17%～24.39%。因此，對于布病的確診不能單純依靠SAT或CFT一種方法，還需要采用SAT和CFT相結(jié)合的方法進行綜合判定。

ELISA方法在布病診斷方面作為一種相對較新的血清學(xué)診斷技術(shù)，在診斷操作特性上與CFT效果相當(dāng)，甚至敏感性和特異性更好，操作簡單且比較穩(wěn)定，判定時用酶標(biāo)儀，避免了人為因素的干擾[10]，適于畜群篩選和動物個體檢查。通過本試驗發(fā)現(xiàn)，i-ELISA、c-ELISA方法與RBPT的符合率、檢測為陽性的樣品數(shù)量均高于SAT和CFT；i-ELISA、c-ELISA方法與SAT和CFT兩種方法綜合判定結(jié)果無顯著差異，且具有較好的一致性。i-ELISA與c-ELISA兩種方法的一致性也相當(dāng)好，兩種檢測方法的檢測結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異。雖然i-ELISA高度敏感，但不能鑒別牛種布魯氏菌19號苗免疫接種產(chǎn)生的抗體或其它假陽性問題和自然病原菌株誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體。因此，在檢測時i-ELISA可以作為一種篩選方法而不是確診方法。c-ELISA較i-ELISA特異性更高，可以消除部分由細(xì)菌交叉反應(yīng)引起的非特異性反應(yīng)，并可以排除絕大多數(shù)牛種布魯氏菌19號苗免疫接種產(chǎn)生的殘留抗體的反應(yīng)。因此，c-ELISA可以作為本病的確診方法之一。

由此可見，雖然布病的血清學(xué)診斷方法種類很多，但目前還沒有任何一種方法無論在敏感性、特異性還是在操作簡便、易行、快速等方面是完美無缺的。在實際檢驗工作中還需要用兩種或兩種以上的方法相結(jié)合。尤其在進行大規(guī)模檢驗時，需要選擇操作簡便、快速、敏感性高的檢測方法進行初步篩選，再選用敏感性、特異性好的診斷方法進行確診。

[1]董文杰，解英波.布魯氏菌病3種血清學(xué)檢測方法比較分析[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2014，24（23）：3405-3406.

[2]司瑞，徐志凱.布魯氏菌國內(nèi)研究進展[J].地方病通報，2006，5（21）：80-82.

[3]趙娜，趙赤鴻，榮蓉.布魯氏菌病血清學(xué)Brucellacapt和i-ELISA檢測方法的比較[J].中國人獸共患病學(xué)報，2014，30（10）：1045-1047，1051.

[4]孫巖，肖培，王娜，等.倍比稀釋虎紅平板凝集試驗對布魯氏菌病診斷的探討[J].中國媒介生物學(xué)及控制雜志，2014，25（4）：294-296.

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[9]于桂芳，溫富勇，王國良，等.奶牛布魯氏菌病試管凝集試驗與補體結(jié)合試驗結(jié)果的差異分析[J].北京農(nóng)業(yè)，2007，24：27-28.

[10]楊正玉，王波，李桂杰.牛布魯氏菌病診斷方法的比較試驗[J].中國畜牧獸醫(yī)文摘，2014，30（6）：53.

Comparative analysis detection methods of bovine brucellosis in different serological

Zhao Fengju,Liu Kunyang,Yu Xuewu,Yan Mingmei, Li Jingchun,Zhang Yawei,Gu Guibo

(Prevention and Control Center of Liaoning Province Animal Epidemic Disease,LiaoningShenyang110164)

Bacteriological and serological methods were commonly applied to diagnose brucellosis.But the bacteriological method was time consuming,laborious,and high-risks.Therefore,the erological methods had become the main method to diagnose brucellosis.In this study,RBPT,SAT, CFT,i-ELISA and c-ELISA were applied to dectect 270 bovine serum samples,to evaluate the diagnostic value of different methods for the brucellosis detection.The results showed that∶most tests was positive of RBPT;SAT and CFT methods were significantly different,which undetected rate could reach 23.17%～24.39%;the coincidence of i-ELISA,c-ELISA with RBPT was higher than that of the SAT and CFT;meanwhile,the positive detection rate was higher than that of the SAT and CFT. However,there was no significant difference between the comprehensive determination results of SAT,CFT and that of i-ELISA,c-ELISA;and there was no significant difference between i-ELISA and c-ELISA.

RBPT;SAT;CFT;ELISA

S858.23

B

1672-9692(2015)03-0012-04

2015-01-26

趙鳳菊（1978-），女，高級獸醫(yī)師，主要從事人畜共患病檢測方面的工作。

遼寧省農(nóng)業(yè)攻關(guān)支撐計劃，編號：201404210