布魯氏菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)蛋白BMEI1069基因的原核表達(dá)與分析

劉來(lái)珍，孫志華，劉娟，史靜雪，陳創(chuàng)夫，張輝

（石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院/動(dòng)物疾病防控兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子832003）

布魯氏菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)蛋白BMEI1069基因的原核表達(dá)與分析

劉來(lái)珍，孫志華，劉娟，史靜雪，陳創(chuàng)夫，張輝?

（石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院/動(dòng)物疾病防控兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子832003）

為構(gòu)建布魯氏菌分泌蛋白BMEI1069基因的原核表達(dá)載體，進(jìn)行分析，分析該蛋白對(duì)胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞（HPT-8）細(xì)胞因子表達(dá)量的影響，本研究從羊種布魯氏菌（B.melitensis）標(biāo)準(zhǔn)株16M的基因組中克隆BMEI1069基因片段，亞克隆到pMD19-T載體中并測(cè)序，構(gòu)建表達(dá)重組質(zhì)粒pET-28a-BMEI1069。轉(zhuǎn)染大腸桿菌BL21（DE3）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，采用Western-Blot方法檢測(cè)其免疫學(xué)特性，用純化的重組蛋白感染細(xì)胞，并檢測(cè)細(xì)胞因子含量。結(jié)果表明，獲得了pET-28a-BMEI1069原核表達(dá)載體，在大腸桿菌中表達(dá)了BMEI1069蛋白，經(jīng)過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)，重組蛋白的分子量大約是58 kDa，western blotting檢測(cè)顯示具有免疫特性，細(xì)胞加入BMEI1069重組蛋白后細(xì)胞因子IL-1、IL-10和TNF-α的表達(dá)均高于PBS對(duì)照組，差異顯著（P＜0.05）。本試驗(yàn)成功表達(dá)了布魯氏菌分泌蛋白BMEI1069，證實(shí)其有一定的免疫特性，并且重組蛋白可以影響細(xì)胞因子的表達(dá)。這將為研究分泌蛋白在免疫逃逸和維持持續(xù)性感染的機(jī)制方面奠定基礎(chǔ)。

布魯氏菌；BMEI1069；原核表達(dá)；細(xì)胞因子；胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞

布魯氏菌?。˙rucellosis）簡(jiǎn)稱布病，又稱地中海弛張熱、馬耳他熱、波浪熱或波狀熱，是由布魯氏菌（Brucella）引起的一種動(dòng)物源性的人畜共患的傳染病[1-2]，患病的牛、羊等牲畜是主要的傳染源。該病主要引起人的波狀熱和持續(xù)性感染，以及懷孕母畜流產(chǎn)和公畜睪丸不對(duì)稱性腫大等臨床癥狀[3]，嚴(yán)重影響畜牧業(yè)的發(fā)展和人類的身體健康[4]。目前還沒(méi)有能夠治愈該病的有效方法。布魯氏菌是一種革蘭氏陰性兼性胞內(nèi)寄生菌，胞內(nèi)寄生和復(fù)制是布魯氏菌的主要毒力特征[5]。布魯氏菌可以通過(guò)皮膚、消化道黏膜和呼吸道黏膜等途徑侵入機(jī)體，隨著淋巴液的循環(huán)到達(dá)淋巴結(jié)后被巨噬細(xì)胞吞噬[6]，巨噬細(xì)胞和胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞是布魯氏菌主要的宿主細(xì)胞[7]。大量研究顯示，布魯氏菌分泌蛋白能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生較好的免疫反應(yīng)，可作為布魯氏菌病診斷性抗原和布魯氏菌亞單位疫苗的候選靶標(biāo)[8-9]，細(xì)菌的分泌蛋白是連接細(xì)菌和機(jī)體的橋梁，被認(rèn)為是最有潛力的保護(hù)性抗原[10]，而且大多數(shù)的分泌蛋白在布魯氏菌侵入宿主細(xì)胞的過(guò)程中都起著一定的作用，但是其具體的分子作用機(jī)制目前還不清楚。本研究選取羊布魯氏菌分泌蛋白BMEI1069基因?yàn)檠芯繉?duì)象，構(gòu)建原核表達(dá)載體，通過(guò)檢測(cè)其反應(yīng)原性，以期為尋找布魯氏菌的保護(hù)性抗原分子、免疫與診斷靶點(diǎn)等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和細(xì)胞羊種布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)株16M、E.coli DH5α菌株、BL21（DE3）菌株、原核表達(dá)載體pET-28a菌株由石河子大學(xué)動(dòng)物疾病防控兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；pMD19-T載體購(gòu)自Promega公司；人胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞（HPT-8）由第四軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)系流行病學(xué)教研室提供。

1.2 主要試劑羊布魯氏菌陽(yáng)性血清由石河子大學(xué)動(dòng)物疾病防控兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；IPTG購(gòu)自Merck公司；限制性內(nèi)切酶（BamHⅠ/XhoⅠ）、DNA marker、T4連接酶購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；細(xì)菌質(zhì)粒小提取試劑盒以及瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限責(zé)任公司；HRP標(biāo)記的兔抗羊IgG、蛋白Marker、BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；DMEM和血清購(gòu)自美國(guó)Gbico公司；人的IL-1、IL-10和TNF-α檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司；其他試劑均為本實(shí)驗(yàn)室常用分析純度的產(chǎn)品。

1.3 目的基因擴(kuò)增根據(jù)GeneBank中羊種布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)株16M的序列設(shè)計(jì)引物，由北京六合華大基因有限公司合成，序列見(jiàn)表1。

表1 PCR引物序列Table1 PCR primer sequences

以羊種布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)株16M的滅活菌液（100℃金屬浴滅活1 h）為模板，進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增，PCR的反應(yīng)體系（20 μL）：2×Es Taq Master mix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，模板2 μL，去離子水7.2 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性：94℃5 min，變性：94℃30 s，退火：61.6℃30 s，延伸：72℃30 s，后延伸：72℃7 min，共32個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后4℃保存。通過(guò)瓊脂糖凝膠檢測(cè)PCR產(chǎn)物，并用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段。將回收后的目的片段與pMD19-T載體在16℃條件下過(guò)夜連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD19-TBMEI1069，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行陽(yáng)性篩選，通過(guò)菌液PCR和雙酶切鑒定陽(yáng)性克隆，并將提取的質(zhì)粒送上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.4 原核表達(dá)載體的構(gòu)建測(cè)序正確的菌株的質(zhì)粒pMD19-T-BMEI1069以及pET-28a載體用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段和酶切后的線性pET-28a載體。將目的片段和線性pET-28a載體在T4連接酶的作用下16℃水浴過(guò)夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)卡那抗性的LB固體培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性克隆，進(jìn)行菌液PCR和雙酶切鑒定。

1.5 重組蛋白表達(dá)及表達(dá)條件的優(yōu)化將篩選出的陽(yáng)性克隆菌在LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200 r/ min搖床中培養(yǎng)過(guò)夜。將過(guò)夜搖好的菌按1∶100的比例接種至新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min培養(yǎng)1 h左右使其OD值為0.4～0.6，在其他條件不變的情況下，按照不同的誘導(dǎo)劑濃度（終濃度為0.1、0.2、0.6、1 mmol/L）、誘導(dǎo)不同時(shí)間段（0、4、6 h）進(jìn)行誘導(dǎo)并收集菌體。將1 mL菌液離心棄上清，沉淀加入80 μL滅菌水和20 μL 5×SDS蛋白上樣緩沖液，震蕩混勻后沸水煮10 min，取20 μL樣品進(jìn)行15%SDS蛋白電泳。觀察電泳結(jié)果，篩選目的基因的最佳表達(dá)條件。

1.6 重組蛋白純化及濃度測(cè)定以最佳的誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)。菌體裂解液經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后采用AKTA蛋白純化系統(tǒng)純化，A液（20 mmol/L磷酸二氫鈉，500 mmol/L氯化鈉，pH 7.4），B液（10 mmol/L磷酸二氫鈉，250 mmol/L氯化鈉，200 mmol/L咪唑，pH 7.4），將純化后的蛋白液體裝進(jìn)透析袋放入PBS液體中進(jìn)行透析，然后用蔗糖進(jìn)行濃縮，用BCA法測(cè)定其濃度，-80℃保存，備用。

1.7 western-blotting檢測(cè)重組蛋白對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)并純化后的重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)移到NC膜上，以200 mA的電流轉(zhuǎn)膜1 h。將膜放入預(yù)先用TBST洗滌后的雜交瓶中，37℃封閉1 h，用TBST洗滌3次，每次10 min。加入1∶200稀釋的布魯氏菌陽(yáng)性血清，4℃過(guò)夜孵育，用TBST洗滌3次，每次10 min，加入1∶5000稀釋的辣根過(guò)氧化氫酶標(biāo)記的兔抗羊IgG，37℃孵育1 h，TBST洗滌3次，每次10 min。ECL顯色后拍照。

1.8 蛋白感染細(xì)胞及細(xì)胞因子的檢測(cè)將儲(chǔ)存在液氮中的HPT-8細(xì)胞取出，使其在37℃溫水中迅速融化，并轉(zhuǎn)移至預(yù)先加有3 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液的離心管中，800 r/min離心5 min，棄上清，并用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在37℃含5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日更換細(xì)胞培養(yǎng)液。待細(xì)胞長(zhǎng)至約90%時(shí)，將細(xì)胞傳至六孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，更換細(xì)胞培養(yǎng)液，并加入經(jīng)AKTA蛋白純化系統(tǒng)純化后的蛋白至終濃度60 μg/mL，作用24 h后取上清[10]，按照IL-1、IL-10和TNF-α試劑盒的說(shuō)明書操作，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD450nm值，計(jì)算IL-1、IL-10和TNF-α細(xì)胞因子含量。用SPSS軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素水平方差分析處理，并以不同處理方式為橫坐標(biāo)，以細(xì)胞因子含量為縱坐標(biāo)，繪制每組試驗(yàn)3個(gè)重復(fù)樣品的直方圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的擴(kuò)增及酶切鑒定PCR擴(kuò)增的BMEI1069片段大小為1 458 bp，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，與預(yù)期的大小一致，如圖1所示。用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，得到大小相符的基因序列，表明BMEI1069基因已成功插入表達(dá)載體中，如圖2所示。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 The electrophoregram of PCR products

圖2 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig.2 The double enzyme identification of recombinant plasmid

2.2 重組蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化在其他條件不變的情況下分別以不同誘導(dǎo)劑濃度、不同誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行誘導(dǎo)，尋找最佳的誘導(dǎo)條件，結(jié)果顯示IPTG的終濃度為0.1 mmol/L誘導(dǎo)6 h時(shí)重組蛋白表達(dá)量最高，如圖3所示。大量誘導(dǎo)表達(dá)后經(jīng)AKTA蛋白純化系統(tǒng)純化，SDS-PAGE分析表明純化后的蛋白條帶清晰，雜帶較少，表明純化效果較好，結(jié)果如圖4所示。

圖3 重組蛋白在IPTG誘導(dǎo)不同時(shí)間的SDS-PAGE結(jié)果Fig.3 SDS-PAGE analysis of the expression protein induced at different time of IPTG

圖4 SDS-PAGE電泳檢測(cè)純化后重組蛋白Fig.4 SDS-PAGE analysis of purified recombinant protein

2.3 western-blotting檢測(cè)對(duì)誘導(dǎo)6 h的重組蛋白純化后進(jìn)行Western-blotting檢測(cè)，200 mA恒流電流下轉(zhuǎn)膜1 h，觀察結(jié)果，可見(jiàn)明顯的陽(yáng)性條帶，結(jié)果如圖5所示。結(jié)果表明，誘導(dǎo)得到的重組蛋白能被HRP標(biāo)記的兔抗羊IgG抗體識(shí)別，且大小與pET-28分子質(zhì)量加上目標(biāo)分子蛋白質(zhì)量的重組蛋白總分子質(zhì)量相符。

圖5 表達(dá)產(chǎn)物的Western blot分析Fig.5 Western-blot analysis for the expressed protein

圖6 細(xì)胞因子分泌量Fig.6 concentrations of cytokine

2.4 細(xì)胞因子檢測(cè)按照IL-1、IL-10和TNF-α試劑盒的說(shuō)明書操作，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD450nm值，計(jì)算IL-1、IL-10和TNF-α細(xì)胞因子含量。結(jié)果如圖6所示，加入BMEI1069重組蛋白后IL-1、IL-10和TNF-α的表達(dá)均高于PBS對(duì)照組，差異顯著（P＜0.05）。

3 討論

布魯氏菌病是一種古老的人獸共患病，嚴(yán)重危害人和多種動(dòng)物的安全[12]，其致病菌還被一些國(guó)家列為恐怖戰(zhàn)爭(zhēng)武器之一[13]。布魯氏菌是一種革蘭氏陰性兼性胞內(nèi)寄生菌，能夠在宿主細(xì)胞中生存繁殖，這可能是由于布魯氏菌自身產(chǎn)生的多種因子，阻止了溶酶體與吞噬小體的融合，并調(diào)控自噬、凋亡等一系列應(yīng)激和防御機(jī)制，從而使布魯氏菌逃脫宿主免疫系統(tǒng)的殺傷和清除；也可能是由于宿主細(xì)胞自身特異性宿主因子的產(chǎn)生有利于布魯氏菌侵入宿主細(xì)胞，一旦宿主因子遭到破壞，將對(duì)布魯氏菌的入侵及其胞內(nèi)生存和繁殖產(chǎn)生影響。自2002年羊種布魯氏菌16M參考基因組測(cè)序完成以來(lái)，已經(jīng)有300多株布魯氏菌基因組完成了測(cè)序，其中有16株基因組已經(jīng)完成了精細(xì)物理圖譜的繪制[14]。雖然對(duì)其基因和蛋白質(zhì)的功能有了一定的了解，但是大部分蛋白質(zhì)功能還不為人知，本文以布魯氏菌的分泌蛋白BMEI1069為研究對(duì)象，為進(jìn)一步全面解釋布魯氏菌蛋白質(zhì)功能提供數(shù)據(jù)。

IV型分泌系統(tǒng)（type IV secretion system，T4SS）是與細(xì)菌接合機(jī)制有關(guān)的一類分泌系統(tǒng)。T4SS是一種跨膜的多亞單位復(fù)合物，通常包括一個(gè)由菌毛或其他表面纖維或蛋白質(zhì)組成的分泌通道[15]。T4SS不但可以轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)，還可以轉(zhuǎn)運(yùn)一些核糖核蛋白復(fù)合物，這點(diǎn)區(qū)別于其他幾種分泌系統(tǒng)[16-17]。細(xì)菌的分泌系統(tǒng)能將部分蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到胞質(zhì)外環(huán)境，從而有利于細(xì)菌的胞內(nèi)生存。對(duì)于致病性細(xì)菌而言，這些分泌性的蛋白幫助細(xì)菌發(fā)揮定殖、吸附等作用，還可以調(diào)理宿主細(xì)胞，逃逸宿主的免疫機(jī)制等[18]。楊羽等[19]通過(guò)運(yùn)用生物學(xué)的方法預(yù)測(cè)布魯氏菌16M菌株的分泌蛋白，得到了191個(gè)具有信號(hào)肽的蛋白；張沾等[7]通過(guò)對(duì)IV型分系統(tǒng)效應(yīng)子VceC的研究表明VceC在侵染胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞過(guò)程中具有毒性作用。本研究中布魯氏菌的BMEI1069重組蛋白感染細(xì)胞后可以引發(fā)細(xì)胞因子IL-1、IL-10和TNF-α的升高，這可能與布魯氏菌侵染過(guò)程中引發(fā)的炎癥有關(guān)，但需要進(jìn)一步的證實(shí)。目前雖有關(guān)于T4SS、自噬和凋亡的研究，但是還沒(méi)有關(guān)于T4SS與自噬和凋亡之間相互關(guān)系的研究。本文表達(dá)了布魯氏菌的分泌蛋白BMEI1069并初步研究了其免疫特性，測(cè)定了該蛋白對(duì)細(xì)胞因子表達(dá)量的影響，為進(jìn)行細(xì)菌侵染細(xì)胞和注射小鼠免疫試驗(yàn)打下了基礎(chǔ)，同時(shí)也為進(jìn)一步研究布魯氏菌的免疫抑制機(jī)制、探索布魯氏菌引發(fā)炎癥提供一定的理論依據(jù)。

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Prokaryotic Expression and Analysis of BrucellaⅣSecretion System Protein BMEI1069 Gene

Liu Laizheng,Sun Zhihua,Liu Juan,Shi Jingxue,Chen Chuangfu,Zhang Hui*

（Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Disease,College of Animal Science&Technology,Shihezi University,XinjiangShihezi832003）

To construct a prokaryotic expression vector for BrucellaⅣsecretion system protein BMEI1069 gene,analyze effect of protein to the expression of Embryonic trophoblast’s cytokines, the BMEI1069 gene was obtained from Brucella melitensis 16M genome.It was connected to the vector of pMD19-T,and constructed recombinant plasmids pET-28a-BMEI1069.The pET-28a-BMEI1069 was transfected into E.coli BL21(DE3)to express,and was analyzed by Western blotting.The cells were infected by purified recombinant proteins,and detected cytokines levels.The results showed that the recombinant plasmids pET-28a-BMEI1069,and BMEI1069 protein has expressed in E.coli BL21 (DE3).The SDS-PAGE showed that the molecular weight of recombinant protein was about 58KDa,the Western blotting test showed that it had immunological characteristics，after adding BMEI1069 recombinant protein in cells,the expression of cytokines IL-1,IL-10 and TNF-α were higher than the control group of PBS,and the difference was significant(P＜0.05).The study has successfully expressed the BrucellaⅣsecretion system protein BMEI1069 gene,and the result showed that ithad immunogenicity.Recombinant protein can influence the expression of cytokines.This will be useful in mechanism researching of immune escape function and maintain persistent infection.

Brucella;BMEI1069;Prokaryotic expression;Cytokine;HPT-8

S855.1+2

B

1672-9692(2015)03-0006-06

2015-02-08

劉來(lái)珍（1988-），男，碩士，主要研究方向?yàn)椴剪斒暇虏C(jī)制。

張輝（1978-），男，副教授，從事傳染病診斷與致病機(jī)制的研究。

國(guó)家自然科學(xué)基金(31460650)