西瓜離體組織培養(yǎng)再生體系的研究進(jìn)展

牛美麗++黨選民++賀滉++詹園鳳

摘 要 闡述了西瓜離體組織培養(yǎng)再生體系建立過(guò)程中的一些重要影響因素，如苗齡、基因型、外植體等方面，探討其存在的問(wèn)題，并對(duì)西瓜再生體系的未來(lái)進(jìn)行展望。

關(guān)鍵詞 西瓜 ；離體組織培養(yǎng) ；再生體系

分類(lèi)號(hào) S651

Research Progress of in Vitro Regeneration System of Watermelon

NIU Meili1） DANG Xuanmin2） HE Huang2） ZHAN Yuanfeng2）

（1 College of agriculture Hainan University， Haikou， Hainan 570208；

2 Tropical Crops Genetic Resources Institute， CATAS， Danzhou， Hainan 571737）

Abstract This paper expounds some important factors of the regeneration system of the tissue culture of the watermelon including seedling age， genotype， and explants， discusses some problems， and looks forward to the establishment of regeneration system of watermelon in the future.

Keywords watermelon ； tissue culture ； regeneration system

西瓜[Citrullus lanatus （Thunberg） Matsumura et Nakai]屬葫蘆科（Cucurbitaceae）雙子葉開(kāi)花植物，是我國(guó)重要的水果類(lèi)經(jīng)濟(jì)作物，為了滿(mǎn)足廣大消費(fèi)者的需求，西瓜育種技術(shù)也在不斷創(chuàng)新。近年來(lái)，隨著植物基因工程技術(shù)的迅速發(fā)展，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行種質(zhì)創(chuàng)新，培育優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的抗病新品種成為西瓜遺傳育種研究的熱點(diǎn)。西瓜離體高效組培再生體系的建立是轉(zhuǎn)基因成功的關(guān)鍵。1971年Andrus[1]首次報(bào)道，成功建立了無(wú)籽西瓜的無(wú)性繁殖體系，隨后許多學(xué)者相繼做了大量的研究[2-4]。

西瓜離體培養(yǎng)的基本原理是利用植物的再生能力及植物細(xì)胞的全能性。與大多數(shù)植物相比，西瓜的再生能力較弱，不易通過(guò)愈傷組織途徑形成再生植株，而且玻璃化現(xiàn)象嚴(yán)重，移栽不易成活。因此，加強(qiáng)西瓜高效組織培養(yǎng)的研究，有助于提高轉(zhuǎn)基因技術(shù)在西瓜育種方面的應(yīng)用。筆者對(duì)目前西瓜離體培養(yǎng)再生體系的研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，為進(jìn)一步完善西瓜再生體系提供理論基礎(chǔ)。

1 影響西瓜離體培養(yǎng)再生體系建立的因素

1.1 苗齡

苗齡對(duì)于不定芽誘導(dǎo)率的影響較大，苗齡的不同決定著外植體生理狀態(tài)的不同。Tabei[5]、Dong[6]和Compton[7]等認(rèn)為，苗齡為5 d的幼苗子葉的不定芽誘導(dǎo)頻率最高；馬國(guó)斌等[8]認(rèn)為，不同苗齡子葉的不定芽分化率有明顯差異，2 d苗齡子葉的不定芽分化頻率最高，這與王春霞等[9]的報(bào)道一致；任春梅等[10]的研究認(rèn)為，剛剛由黃轉(zhuǎn)綠的苗齡（4～5 d）的子葉誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽的頻率最高，而苗齡為8～9 d的子葉誘導(dǎo)產(chǎn)生的不定芽最多；Chaturvedi等[11]則認(rèn)為，7 d苗齡的子葉誘導(dǎo)率最高；趙彩萍等[12]認(rèn)為，4～6 d苗齡子葉誘導(dǎo)不定芽的效率較高；袁建民[13]的研究認(rèn)為，苗齡為3～5 d的子葉不定芽誘導(dǎo)率最高，超過(guò)5 d不定芽誘導(dǎo)率隨之下降，10 d以上苗齡的子葉不能誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽；肖守華等[14]同樣認(rèn)為，西瓜苗齡為3～5 d子葉不定芽誘導(dǎo)率維持在較高水平，而且觀察到此時(shí)子葉顏色由淡黃色轉(zhuǎn)為淺綠色，隨著子葉顏色加深，誘導(dǎo)率下降。因此，在西瓜離體培養(yǎng)中，一般多采用4～5 d苗齡的無(wú)菌苗子葉作為外植體。但是，由于不同品種的種子發(fā)育快慢存在差異，以培養(yǎng)的天數(shù)來(lái)確定苗齡并不合適，而以子葉顏色判斷可能更加有效，無(wú)菌苗子葉呈現(xiàn)淡綠色時(shí)不定芽誘導(dǎo)率最高，這在黃學(xué)森[15]、任春梅[10]、王果萍[16]及袁建民[13]等學(xué)者的研究中都有報(bào)道。

1.2 基因型

基因型是影響植株再生的內(nèi)因。選用合適的基因型材料是西瓜組織培養(yǎng)成功與高效的關(guān)鍵，不同的基因型材料誘導(dǎo)分化率有很大差別[4]。一些研究發(fā)現(xiàn)，不定芽的誘導(dǎo)不僅受植物激素的影響，而且跟外植體的基因型有關(guān)[4，13，17-20]。如鄭先波[21]報(bào)道，基因型與愈傷組織誘導(dǎo)關(guān)系密切，品種黑蜜5號(hào)是最易產(chǎn)生愈傷組織的基因型；董焱等[22]則認(rèn)為，以未成熟胚為外植體建立的西瓜再生體系對(duì)基因型的依賴(lài)性不強(qiáng)，如果以未成熟胚為遺傳轉(zhuǎn)化的受體，有望克服其品種局限性。

1.3 外植體

可以作為西瓜離體再生的外植體種類(lèi)很多，如頂芽、體胚、真葉、子葉塊、莖尖及下胚軸等，但即使是源自于同一植株的不同外植體類(lèi)型，其誘導(dǎo)頻率也不相同[23]。任春梅[10]、萬(wàn)勇[24]等認(rèn)為，頂芽誘導(dǎo)不定芽的誘導(dǎo)率高于子葉；張志忠等[25]則認(rèn)為，莖尖和子葉塊是誘導(dǎo)不定芽較好的外植體；張全美[26]采用子葉近胚軸端（帶1 mm下胚軸）誘導(dǎo)西瓜不定芽，其誘導(dǎo)率達(dá)到100%，遠(yuǎn)高于遠(yuǎn)胚軸端，這與Compton[27]和王果萍[16]的研究結(jié)果一致；袁建民[13]的研究也認(rèn)為，子葉近胚軸端是不定芽誘導(dǎo)的最佳外植體。外植體的發(fā)育時(shí)期也會(huì)影響西瓜的再生能力。Compton等[28]用西瓜未成熟胚的子葉作外植體得到了體細(xì)胞胚胎，但是他們同時(shí)用成熟子葉作外植體進(jìn)行研究時(shí)，就沒(méi)有得到體細(xì)胞胚胎或者不定芽。這說(shuō)明未成熟胚的子葉再生能力更強(qiáng)。目前大多數(shù)研究者在組織培養(yǎng)過(guò)程中采用最多的是子葉作為外植體。

目前，針對(duì)外植體接種方式對(duì)不定芽誘導(dǎo)影響的研究也相對(duì)比較少。商麗敏[23]將外植體分別以近軸端和遠(yuǎn)軸端2種方式接種在芽誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基上，研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論以哪種方式將外植體接種在培養(yǎng)基上，不定芽產(chǎn)生的部位總是局限于近軸端；其他學(xué)者也有類(lèi)似報(bào)道[7，20，29]。

1.4 激素濃度配比

生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的濃度及配比，是調(diào)控植物器官產(chǎn)生愈傷組織和叢生芽的主導(dǎo)因素。因此，培養(yǎng)基中激素的種類(lèi)、濃度與組合對(duì)愈傷組織及叢生芽的形成起著至關(guān)重要的作用[30]。在西瓜的離體培養(yǎng)中，多數(shù)選擇從子葉或下胚軸直接誘導(dǎo)芽分化途徑，可以獲得很高的分化率。在培養(yǎng)基中加入細(xì)胞分裂素的目的，主要是促進(jìn)細(xì)胞分裂和分化不定芽，生長(zhǎng)素被用于誘導(dǎo)細(xì)胞的分裂。

1.4.1 激素濃度配比對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)影響

宋道軍等[4]研究認(rèn)為，改良的MS（MS+2.0 mg/L 6-AB+0.1 mg/L NAA）是西瓜愈傷組織誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基；邱敏等[31]將外植體接種于MS+5.0 mg/L 6-BA培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織，誘導(dǎo)率可達(dá)100%；閆靜[32]則發(fā)現(xiàn)，使用培養(yǎng)基MS+1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L BA+2.0 mg/L KT誘導(dǎo)京欣愈傷組織時(shí)效果最好，不僅誘導(dǎo)率高，而且誘導(dǎo)的愈傷組織質(zhì)量好，沒(méi)有外植體褐化情況發(fā)生。

由于西瓜通過(guò)誘導(dǎo)愈傷組織形成再生植株難度大、周期長(zhǎng)及容易出現(xiàn)玻璃化苗，因此在西瓜再生體系建立中，通常是直接誘導(dǎo)外植體形成不定芽再生完整植株。

1.4.2 激素濃度配比對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響

激素是誘導(dǎo)外植體產(chǎn)生不定芽的重要因素之一。不同的激素類(lèi)型和濃度配比對(duì)不定芽影響明顯，很多學(xué)者對(duì)此也進(jìn)行了研究。統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1。

表1的研究結(jié)果均為直接誘導(dǎo)外植體產(chǎn)生不定芽，且一定濃度的6-BA是誘導(dǎo)西瓜外植體分化所必須的激素，附加低濃度的IAA、IBA或者NAA則有利于不定芽的誘導(dǎo)分化，但是不同基因型的西瓜不定芽誘導(dǎo)率存在一定的差異。而宋道軍[4]則認(rèn)為，加入適量的AgNO3能不同程度地提高西瓜外植體不定芽的分化能力，以5 mg/L最為適宜，其對(duì)不定芽分化的誘導(dǎo)率最大可以提高10%。有研究指出，在植物離體培養(yǎng)中，AgNO3不僅可減少外植體愈傷組織的形成，使褐化現(xiàn)象受到抑制，而且還能提高芽誘導(dǎo)率[37-39]。

1.4.3 激素濃度配比對(duì)不定芽伸長(zhǎng)的影響

萬(wàn)勇等[24]認(rèn)為，不定芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基是MS+0.5 mg/L BA +1.0 mg/L IAA；張志忠等[25]將不定芽移入新鮮的MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA上獲得了很好的伸長(zhǎng)效果，這與陳克農(nóng)等[35]的觀點(diǎn)一致；劉獨(dú)臣等[34]利用改良的MS+0.2 mg/L KT+0.01 mg/L IAA培養(yǎng)基對(duì)不定芽進(jìn)行培養(yǎng)，伸長(zhǎng)率高達(dá)97%；高寧寧等[36]認(rèn)為，不定芽的最佳伸長(zhǎng)培養(yǎng)基為MS+0.2 mg/L KT，任春梅[10]、袁建民[13]及肖守華[14]等也均有類(lèi)似報(bào)道；而李娟[19]則認(rèn)為，添加了0.2 mg/L KT的MS培養(yǎng)基對(duì)不定芽的伸長(zhǎng)無(wú)明顯促進(jìn)作用，且伸長(zhǎng)后的不定芽較難生根。

1.4.4 激素濃度配比對(duì)生根的影響

雖然NAA、KT、IAA和IBA都能明顯地促進(jìn)生根，但不同激素種類(lèi)及濃度對(duì)生根的影響也有差異。任春梅等[10]認(rèn)為，KT、NAA和IAA這3種激素對(duì)生根誘導(dǎo)無(wú)明顯差異；劉獨(dú)臣等[34]將不定芽移栽1/2 MS+0.05 mg/L IAA在培養(yǎng)基上生根率達(dá)95%；陳克農(nóng)等[35]則認(rèn)為，最適宜的生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0.4 mg/L IAA；而高寧寧[36]、商麗敏[23]等則認(rèn)為，最佳的生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0.1 mg/L IAA。肖守華等[14]研究認(rèn)為，在MS培養(yǎng)基中添加0.2 mg/L的IBA或者IAA皆可誘導(dǎo)出形態(tài)正常、有明顯根毛的不定根，綜合考慮最終認(rèn)為，西瓜再生植株生根采用MS+0.2 mg/L IBA培養(yǎng)基較為理想；趙爽[40]則認(rèn)為，在MS培養(yǎng)基中附加0.05 mg/L NAA最適合再生苗的生根培養(yǎng)。

1.5 培養(yǎng)條件

溫度和光照是影響植物芽誘導(dǎo)的重要環(huán)境條件。西瓜外植體離體培養(yǎng)的溫度一般控制在（25±2）℃，最適光照一般控制在1 500～3 000 lx，光照時(shí)間控制在12～16 h/d。王春霞等[9]認(rèn)為，對(duì)外植體進(jìn)行暗處理是獲得高頻再生的關(guān)鍵，未經(jīng)暗處理外植體的出芽率（19%）顯著低于經(jīng)過(guò)6 d暗處理外植體的出芽率（86%）。袁建民[13]的研究認(rèn)為，先暗培養(yǎng)3 d，待不定根長(zhǎng)到0.5 cm左右時(shí)轉(zhuǎn)到光照下培養(yǎng)較為適宜?？傊?，適當(dāng)?shù)陌堤幚碛欣诓欢ㄑ康男纬伞?/p>

2 存在的問(wèn)題

玻璃化現(xiàn)象在西瓜組織培養(yǎng)過(guò)程中比較嚴(yán)重。萬(wàn)勇等[24]研究發(fā)現(xiàn)，在不定芽的繼代培養(yǎng)與伸長(zhǎng)培養(yǎng)過(guò)程中，均有不同程度的玻璃化現(xiàn)象。尤其是芽的伸長(zhǎng)，采用MS+KT 0.2 mg/L培養(yǎng)基，有50%的玻璃化苗，這類(lèi)苗轉(zhuǎn)入生根誘導(dǎo)后不能形成完整植株。Thomas等[41]也指出，這種情況幾乎無(wú)法避免，這與培養(yǎng)基類(lèi)型、瓊脂濃度、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、通氣情況等均有關(guān)。張志忠等[25]通過(guò)每2周繼代1次、降低外植體密度和定期于無(wú)菌條件下通氣等措施，在很大程度上緩解了玻璃化現(xiàn)象，芽伸長(zhǎng)過(guò)程中繼代時(shí)適當(dāng)降低激素濃度也有所幫助。

此外，許多研究表明，西瓜試管苗的生根都比較容易，但直接移栽有難度，需通過(guò)嫁接保證其成活率[2-3，10]。孫治圖等[18]將試管苗先移入消毒的草炭和蛭石，待其長(zhǎng)出新根后再移栽，采用這種延緩試管苗移栽的方法，可以讓試管苗在無(wú)菌條件下適應(yīng)移栽后的生長(zhǎng)環(huán)境，提高其適應(yīng)能力，減少根系的損傷，起到煉苗作用，提高其成活率。

3 展望

目前，有報(bào)道通過(guò)誘導(dǎo)完全脫分化愈傷組織，然后進(jìn)行再生不定芽培養(yǎng)，已經(jīng)成功獲得了由伊選和京欣兩類(lèi)西瓜間接再生不定芽，并通過(guò)伸長(zhǎng)、生根培養(yǎng)獲得了完整植株。但是愈傷組織再生成不定芽的頻率很低，因此，需要進(jìn)一步加強(qiáng)這方面的基礎(chǔ)理論研究。另外，如何采取更加有效的措施解決西瓜組織培養(yǎng)過(guò)程中的問(wèn)題也必不可少，這將為建立適合西瓜的快速、高效繁殖再生體系提供有力保障。

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