• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    雜色鮑血細(xì)胞分類、結(jié)構(gòu)和免疫功能的流式細(xì)胞術(shù)分析

    2015-10-13 08:13:44冼健安王冬梅張秀霞苗玉濤潘訓(xùn)彬王安利
    海洋科學(xué) 2015年12期
    關(guān)鍵詞:雜色溶酶體顆粒細(xì)胞

    冼健安 , 錢 坤, 郭 慧, 王冬梅 張秀霞 苗玉濤, 潘訓(xùn)彬, 王安利

    (1. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶生物技術(shù)研究所, 海南 ???571101; 2. 華南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 廣東省水產(chǎn)健康安全養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 生態(tài)與環(huán)境科學(xué)廣東普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東 廣州 510631; 3. 廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院, 南海水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物增養(yǎng)殖廣東普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東 湛江 524025)

    雜色鮑(Haliotis diversicolor)是我國南方重要的名貴海水水產(chǎn)品。近年來, 由于鮑類疾病的肆虐,鮑類養(yǎng)殖業(yè)遭受嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失, 迫切需要對(duì)鮑類的免疫及病理學(xué)進(jìn)行深入研究。鮑類只有先天性異性免疫功能, 血細(xì)胞在其細(xì)胞免疫和體液免疫過程中均起著十分重要的作用, 如對(duì)病原體進(jìn)行吞噬和包裹, 釋放各類抗菌因子等[1]。目前鮑類血細(xì)胞的研究仍相對(duì)滯后, 主要還集中在血細(xì)胞的分類和結(jié)構(gòu)研究上[2-5], 對(duì)各類血細(xì)胞的具體功能和相互協(xié)同作用仍知之甚少。研究滯后的其中一個(gè)主要原因是受限于研究技術(shù), 對(duì)血細(xì)胞在細(xì)胞水平上的研究一直依賴于各類顯微鏡。流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry, FCM)是早在 20世紀(jì) 70年代發(fā)展起來的,對(duì)細(xì)胞的物理和化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行快速檢測的技術(shù), 具有客觀準(zhǔn)確、快速、同時(shí)測定多個(gè)指標(biāo)等優(yōu)點(diǎn), 在臨床上的應(yīng)用已十分廣泛, 近年來已逐步應(yīng)用到水產(chǎn)無脊椎動(dòng)物如蝦類[6-8]和雙殼類[9-12]的研究中, 但在鮑類血細(xì)胞上的研究仍甚少[13-14]。本研究應(yīng)用FCM 分析雜色鮑血細(xì)胞的分類、結(jié)構(gòu)和免疫功能,為進(jìn)一步研究鮑類血細(xì)胞免疫以及病害防治研究提供基礎(chǔ)資料, 并建立一套快捷、準(zhǔn)確的鮑類血細(xì)胞指標(biāo)的FCM檢測方法。

    1 材料和方法

    1.1 材料與試劑

    雜色鮑(Haliotis diversicolorReeve)購自廣州黃沙水產(chǎn)品市場, 規(guī)格為殼長 6~7cm, 于實(shí)驗(yàn)室海水(鹽度 30, 溫度 20~22℃)中充氣暫養(yǎng) 1周, 暫養(yǎng)期間定時(shí)投喂海帶, 清理殘餌和糞便。

    二乙酸熒光素(FDA)和 2’, 7’-二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉(DCFH-DA)購自 Sigma公司, Annexin VFITC/PI(碘化丙啶)凋亡檢測試劑盒、LysoTracker Red、MitoTracker Green和黃綠色熒光微球(yellow-green fluorescent carboxylate-modified FluoSpheres?beads, 直徑1 μm)購自Invitrogen公司, 其他試劑為國產(chǎn)分析純。

    1.2 血細(xì)胞懸液的制備

    采用腹足創(chuàng)傷法取鮑血淋巴, 用過濾無菌海水以1∶1稀釋, 此時(shí)細(xì)胞密度約為106個(gè)/mL。共測定10只鮑, 每個(gè)個(gè)體的稀釋血淋巴作為一單獨(dú)樣品進(jìn)行測定。

    1.3 流式細(xì)胞儀

    流式細(xì)胞儀為美國 BD(Becton Dickinson)公司FACSCalibur, 應(yīng)用 CellQuest軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的獲取和分析。前向角散射光(Forward light scatter,FSC)反映細(xì)胞大小, 側(cè)向角散射光(Side light scatter,SSC)反映細(xì)胞顆粒復(fù)雜度; FITC(異硫氰酸熒光素)、MitoTracker Green、黃綠色熒光微球、FDA和DCF(2’, 7’-二氯熒光黃)的綠色熒光用第一熒光通道(FL1)檢測, PI和LysoTracker Red的紅色熒光用第二熒光通道(FL2)檢測。

    1.4 血細(xì)胞分類與組成比例

    稀釋血淋巴用 200目篩網(wǎng)過濾后直接上機(jī)進(jìn)行檢測, 每個(gè)樣品的細(xì)胞獲取數(shù)為10 000個(gè)。以SSC為橫坐標(biāo)、FSC為縱坐標(biāo)作散點(diǎn)圖, 在SSC-FSC散點(diǎn)圖上設(shè)門劃分各個(gè)細(xì)胞亞群, 分析各類血細(xì)胞所占的比例。

    1.5 血細(xì)胞凋亡率

    以Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒檢測血細(xì)胞的自然凋亡率。血淋巴取出后, 立即進(jìn)行離心然后重懸于1x Annexin V結(jié)合緩沖液中, 調(diào)整細(xì)胞濃度約 3×106個(gè)/mL, 每 100 μL血細(xì)胞懸液加入 5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI工作液, 避光染色15 min,再加入400 μL 1x Annexin V結(jié)合緩沖液, 200目篩網(wǎng)過濾后立即上機(jī)檢測, 每個(gè)樣品的細(xì)胞獲取數(shù)為10 000個(gè)。結(jié)果以Annexin V-FITC熒光強(qiáng)度(FL1)為橫坐標(biāo), PI熒光強(qiáng)度(FL2)為縱坐標(biāo)的散點(diǎn)圖顯示。如圖 2, 用十字門劃分各類細(xì)胞的區(qū)域: 活細(xì)胞(Annexin V-FITC-/PI-)位于象限 a, 前期凋亡細(xì)胞(Annexin V-FITC+/PI-)位于象限b, 后期凋亡細(xì)胞和死細(xì)胞(Annexin V-FITC+/PI+)位于象限c, 分析各象限細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例。細(xì)胞總凋亡和死亡率為前期凋亡、后期凋亡和死亡細(xì)胞(象限b+c)所占的比例。為避免血細(xì)胞離體時(shí)間過長對(duì)結(jié)果造成影響,從樣品制備到上樣的整個(gè)過程應(yīng)盡量控制在30 min以內(nèi)。

    1.6 吞噬活性

    以黃綠色熒光微球作為被吞噬物測定血細(xì)胞的吞噬活性。分別取血細(xì)胞懸液 400 μL, 加入 10 μL濃度為 1/10的微球稀釋液, 室溫避光孵育 1 h, 用200目篩網(wǎng)過濾后上機(jī)檢測, 每個(gè)樣品的細(xì)胞獲取數(shù)為10 000個(gè)。結(jié)果以FL1熒光量為橫坐標(biāo), 細(xì)胞數(shù)量為縱坐標(biāo)的單參數(shù)直方圖顯示, 以標(biāo)尺劃定吞噬微球的區(qū)域, 分析吞噬不同數(shù)量微球的細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例。

    1.7 線粒體數(shù)量

    應(yīng)用MitoTracker Green作為線粒體的特異性熒光探針, MitoTracker Green對(duì)于線粒體的染色不依賴于線粒體膜電位。取血細(xì)胞懸液200 μL, 加入50 nmol/L MitoTracker Green室溫避光孵育30 min, 用200目篩網(wǎng)過濾后上機(jī)檢測, 每個(gè)樣品的細(xì)胞獲取數(shù)為10 000個(gè)。結(jié)果以MitoTracker Green熒光量(FL1)為橫坐標(biāo), 細(xì)胞數(shù)量為縱坐標(biāo)的單參數(shù)直方圖顯示。根據(jù) SSCFSC散點(diǎn)圖中劃分的血細(xì)胞亞群, 作不同類型血細(xì)胞的MitoTracker Green直方圖, 分析不同類型血細(xì)胞的 MitoTracker Green平均熒光量, 細(xì)胞的 Mito-Tracker Green熒光量與線粒體數(shù)量成正比。

    1.8 溶酶體數(shù)量

    應(yīng)用LysoTracker Red作為溶酶體的特異性熒光探針, 它是DND99進(jìn)行了熒光標(biāo)記的帶有弱堿性的熒光探針, 可以選擇性地滯留在偏酸性的溶酶體中, 從而實(shí)現(xiàn)對(duì)于溶酶體的特異性熒光標(biāo)記。取血細(xì)胞懸液200 μL, 加入50 nmol/L LysoTracker Red室溫避光孵育60 min, 用200目篩網(wǎng)過濾后上機(jī)檢測, 每個(gè)樣品的細(xì)胞獲取數(shù)為10 000個(gè)。結(jié)果以LysoTracker Red熒光量(FL2)為橫坐標(biāo), 細(xì)胞數(shù)量為縱坐標(biāo)的單參數(shù)直方圖顯示。根據(jù)SSC-FSC散點(diǎn)圖中劃分的血細(xì)胞亞群,作不同類型血細(xì)胞的 LysoTracker Red直方圖, 分析不同類型血細(xì)胞的 LysoTracker Red平均熒光量, 細(xì)胞的LysoTracker Red熒光量與溶酶體數(shù)量成正比。

    1.9 非特異性酯酶活性

    以FDA為標(biāo)記探針檢測非特異性酯酶活性的變化。取血細(xì)胞懸液200 μL, 加入5 μmol/LFDA室溫避光孵育30 min, 經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾后上機(jī)檢測, 每個(gè)樣品的細(xì)胞獲取數(shù)為10 000個(gè)。結(jié)果以FDA熒光量(FL1)為橫坐標(biāo), 細(xì)胞數(shù)量為縱坐標(biāo)的單參數(shù)直方圖顯示。根據(jù)SSC-FSC散點(diǎn)圖中劃分的血細(xì)胞亞群,作不同類型血細(xì)胞的FDA直方圖, 分析不同類型血細(xì)胞的FDA平均熒光量, 細(xì)胞的FDA熒光量與非特異酯酶活性成正比。

    1.10 活性氧(ROS)含量

    以DCFH-DA為標(biāo)記探針檢測ROS含量的變化。取血細(xì)胞懸液200 μL, 加入10 μmol/LDCFH-DA室溫避光孵育30 min, 經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾后上機(jī)檢測, 每個(gè)樣品的細(xì)胞獲取數(shù)為10 000個(gè)。結(jié)果以DCF熒光量(FL1)為橫坐標(biāo), 細(xì)胞數(shù)量為縱坐標(biāo)的單參數(shù)直方圖顯示。根據(jù)SSC-FSC散點(diǎn)圖中劃分的血細(xì)胞亞群, 作不同類型血細(xì)胞的DCF直方圖, 分析不同類型血細(xì)胞的DCF平均熒光量, 細(xì)胞的DCF熒光量與ROS含量成正比。

    1.11 統(tǒng)計(jì)分析

    結(jié)果顯示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean ± SD), 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用 SPSS 13.0進(jìn)行 Tukey單因素方差分析,P<0.05確認(rèn)為差異性顯著。

    2 結(jié)果

    2.1 血細(xì)胞分類與組成比例

    圖1A為血細(xì)胞散點(diǎn)圖, 圖1B為等高圖。在等高圖中, 細(xì)胞密度相同的點(diǎn)連成一環(huán)線, 處于中央位置的閉合等高線圈為某類細(xì)胞最集中的區(qū)域, 據(jù)此定義為一類細(xì)胞, 將該區(qū)域進(jìn)行劃定。如圖1所示,根據(jù)血細(xì)胞FSC和SSC特征的不同, 可把雜色鮑血細(xì)胞劃分為三個(gè)亞群: R1, R2和R3。亞群R1的FSC和 SSC值都相對(duì)最小, 表明該亞群的細(xì)胞最小, 顆粒復(fù)雜度也最低, 為透明細(xì)胞; R3亞群細(xì)胞的 FSC和 SSC值都相對(duì)最大, 表明該亞群的細(xì)胞最大, 顆粒復(fù)雜度也最高, 為大顆粒細(xì)胞。R2亞群的細(xì)胞大小和顆粒復(fù)雜度處于R1和R3亞群之間, 為小顆粒細(xì)胞。各類細(xì)胞的FSC和SSC強(qiáng)度見表1, 不同個(gè)體的大顆粒細(xì)胞的比例有較大的差異, 如圖 1所示,A圖的大顆粒細(xì)胞(R3)較少, B圖的較多; 其組成比例的結(jié)果見表2, 順序?yàn)? 小顆粒細(xì)胞>透明細(xì)胞>大顆粒細(xì)胞, 三類細(xì)胞之間的比例存在顯著差異(P<0.05)。

    2.2 細(xì)胞凋亡率

    圖1 雜色鮑血細(xì)胞SSC-FSC散點(diǎn)圖(A)和等高圖(B)Fig.1 SSC-FSC dot plot (A)and contour plot (B)of H. diversicolor hemocytes

    表1 雜色鮑3類血細(xì)胞的大小和顆粒復(fù)雜度(A.U.)Tab.1 Size and granular complexity of three hemocyte subpopulations from H. diversicolor (A.U.)

    圖2為雜色鮑新鮮血細(xì)胞Annexin V-FITC/PI凋亡染色散點(diǎn)圖。測定了10只雜色鮑的血細(xì)胞自然凋亡率, 結(jié)果見表3, 其平均總凋亡和死亡率為3.76%。

    表2 雜色鮑3類血細(xì)胞的組成比例(%)Tab.2 Proportion of three hemocyte subpopulations from H. diversicolor (%)

    圖2 雜色鮑血細(xì)胞Annexin V-FITC/PI染色凋亡散點(diǎn)圖Fig.2 Apoptosis dot plot of H. diversicolor hemocytes stained with Annexin V-FITC and PI

    表3 雜色鮑血細(xì)胞凋亡率(%)Tab.3 Apoptotic ratio of H. diversicolor hemocytes (%)

    2.3 吞噬活性

    雜色鮑血細(xì)胞吞噬熒光微球的直方圖如圖 3所示, 從圖上可以清晰區(qū)分吞噬1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)及以上熒光微球的血細(xì)胞, 第一個(gè)峰為吞噬 1個(gè)熒光微球的血細(xì)胞(記為 M1), 第二個(gè)峰為吞噬 2個(gè)熒光微球的血細(xì)胞(記為 M2), 其后為吞噬 3個(gè)及以上熒光微球的血細(xì)胞(記為M3), M4為吞噬了1個(gè)及以上熒光微球的血細(xì)胞。血細(xì)胞的吞噬活性如表4所示, 吞噬1個(gè)微球的血細(xì)胞占22.31%; 吞噬2個(gè)微球的血細(xì)胞占16.39%, 個(gè)體差異較大, 最低只有8.17%, 最高可達(dá) 21.76%; 吞噬 3個(gè)及以上微球的血細(xì)胞占24.96%; 總吞噬率為63.67%。

    圖3 雜色鮑血細(xì)胞吞噬熒光微球的直方圖Fig.3 Distribution histogram of H. diversicolor hemocytes phagocytosed fluorescent beads

    表4 雜色鮑血細(xì)胞的吞噬活性(%)Tab.4 Phagocytic activity of H. diversicolor hemocytes (%)

    2.4 線粒體數(shù)量和溶酶體數(shù)量

    結(jié)果如表 5所示, 線粒體和溶酶體的數(shù)量均在大顆粒細(xì)胞中最多, 小顆粒細(xì)胞次之, 透明細(xì)胞最少。大顆粒細(xì)胞的線粒體數(shù)量約為小顆粒細(xì)胞的3.4倍, 透明細(xì)胞的 10.4倍; 大顆粒細(xì)胞的溶酶體數(shù)量約為小顆粒細(xì)胞的3.7倍, 透明細(xì)胞的10.2倍。三類細(xì)胞線粒體數(shù)量和溶酶體數(shù)量均存在顯著差異(P<0.05)。

    表5 雜色鮑3類血細(xì)胞的生理特征Tab.5 Physiological characteristics of three hemocyte subpopulations from H. diversicolor (A.U.)

    2.5 非特異性酯酶活性和ROS含量

    結(jié)果如表 5所示, 酯酶活性在大顆粒細(xì)胞中最高, 小顆粒細(xì)胞次之, 透明細(xì)胞最低; 大顆粒細(xì)胞約為小顆粒細(xì)胞的1.2倍, 透明細(xì)胞的5.3倍。ROS含量在大顆粒細(xì)胞中最多, 小顆粒細(xì)胞次之, 透明細(xì)胞最少; 大顆粒細(xì)胞約為小顆粒細(xì)胞的2.7倍, 透明細(xì)胞的17.1倍。三類細(xì)胞線粒體數(shù)量和溶酶體數(shù)量均存在顯著差異(P<0.05)。

    3 討論

    3.1 鮑類血細(xì)胞的分類

    對(duì)于鮑類血細(xì)胞的分類, 目前仍沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)細(xì)胞含有顆粒的情況以及細(xì)胞大小, 可以基本分為兩大類: 顆粒細(xì)胞和無顆粒細(xì)胞(或稱透明細(xì)胞)。王江勇等[5]根據(jù)細(xì)胞大小、顆粒組成特征等將雜色鮑血細(xì)胞分為顆粒細(xì)胞和無顆粒細(xì)胞。張劍誠等[15]也將皺紋盤鮑(H. discus hannai)血細(xì)胞分為顆粒細(xì)胞和透明細(xì)胞兩大類。Sahaphong等[16]應(yīng)用光鏡和電鏡觀察認(rèn)為耳鮑(H. asinina)血細(xì)胞可分為顆粒細(xì)胞和透明細(xì)胞。饒小珍等[3]把九孔鮑(H. diversicolor supertexa)血細(xì)胞分為大細(xì)胞、中等細(xì)胞和小細(xì)胞; 透射電鏡下血細(xì)胞可分為兩類: 顆粒細(xì)胞對(duì)應(yīng)于光鏡下的大細(xì)胞和中等細(xì)胞; 無顆粒細(xì)胞對(duì)應(yīng)于光鏡下的小細(xì)胞。有的學(xué)者根據(jù)血細(xì)胞的一些超微結(jié)構(gòu)特征, 將血細(xì)胞類型分得更為細(xì)致。李太武等[2]觀察雜色鮑血細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu), 認(rèn)為除了顆粒細(xì)胞和透明細(xì)胞外, 還有一種胞質(zhì)電子密度高、數(shù)量最少的小細(xì)胞。陳全震等[4]通過對(duì)皺紋盤鮑血細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)的觀察, 將顆粒細(xì)胞分為大顆粒細(xì)胞、小顆粒細(xì)胞和特殊顆粒細(xì)胞, 無顆粒細(xì)胞分為透明細(xì)胞和淋巴樣細(xì)胞。一些外國學(xué)者只觀察到少量顆粒細(xì)胞, 有的研究甚至沒有發(fā)現(xiàn)顆粒細(xì)胞。Travers等[17]應(yīng)用顯微觀察和流式細(xì)胞術(shù)對(duì)歐洲鮑(H. tuberculata)血細(xì)胞進(jìn)行了分類研究, 均認(rèn)為其血細(xì)胞主要由透明細(xì)胞和漿樣細(xì)胞組成, 只發(fā)現(xiàn)有極少量的顆粒細(xì)胞,其中漿樣細(xì)胞占 10%。Donaghy等[14]也應(yīng)用顯微觀察和流式細(xì)胞術(shù)對(duì)盤鮑(H. discus discus)血細(xì)胞分類進(jìn)行了研究, 結(jié)果認(rèn)為血細(xì)胞由透明細(xì)胞和漿樣細(xì)胞組成, 應(yīng)用此兩種方法得出漿樣細(xì)胞所占比例分別為3.82%和6.75%。本研究應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù), 根據(jù)血細(xì)胞大小和顆粒復(fù)雜度的差異, 可將血細(xì)胞清晰地分為三個(gè)類群: 大顆粒細(xì)胞、小顆粒細(xì)胞和透明細(xì)胞, 與饒小珍等[3]對(duì)九孔鮑研究的結(jié)果相似。比較流式細(xì)胞術(shù)和顯微觀察兩種分類方法, 顯微觀察需要對(duì)血細(xì)胞進(jìn)行染色處理, 染色效果對(duì)后續(xù)觀察有較大的影響, 血細(xì)胞類型的鑒定也受觀察者的主觀判定影響。相對(duì)而言, 流式細(xì)胞術(shù)檢測量大, 數(shù)據(jù)較為客觀、準(zhǔn)確, 還具有快速簡便、可同時(shí)進(jìn)行計(jì)數(shù)或熒光分析等優(yōu)點(diǎn), 但關(guān)于血細(xì)胞類型的劃定, 對(duì)研究人員的分析水平要求也較高。

    3.2 鮑類血細(xì)胞的組成比例

    對(duì)于鮑類血細(xì)胞的組成比例, 以往的研究結(jié)果也存在一定的差異。王江勇等[5]研究認(rèn)為雜色鮑的顆粒細(xì)胞和無顆粒細(xì)胞分別占55.1%和44.9%; 張劍誠等[15]測得皺紋盤鮑的顆粒細(xì)胞和透明細(xì)胞分別占40%和 60%; 饒小珍等[3]觀察得出九孔鮑的大細(xì)胞(顆粒細(xì)胞)、中等細(xì)胞(顆粒細(xì)胞)和小細(xì)胞(無顆粒細(xì)胞)分別占3.6%、91.7%和4.7%; 本研究分析得出雜色鮑的大顆粒細(xì)胞、小顆粒細(xì)胞和透明細(xì)胞分別占8.55%、58.17%和32.71%。

    不同類型的血細(xì)胞在功能上存在一定的差異,血細(xì)胞組成比例可能反映了機(jī)體的不同生理和免疫狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)雜色鮑經(jīng)病毒注射感染后, 其顆粒細(xì)胞比例從初始的55%到感染6 h后增加至67%, 然后逐漸下降, 至感染36 h降到45%; 而無顆粒細(xì)胞從初始的45%下降到感染6 h 的33%, 然后逐漸增加,至感染36 h升至55%[18]。因此, 以往的研究得到差異較大的結(jié)果, 可能與物種種類、大小、環(huán)境因素和健康狀態(tài)等有關(guān)。

    3.3 血細(xì)胞的結(jié)構(gòu)

    血細(xì)胞結(jié)構(gòu)的差異是區(qū)分不同類型血細(xì)胞的主要依據(jù)之一。李太武等[2]應(yīng)用電鏡觀察發(fā)現(xiàn)雜色鮑顆粒細(xì)胞的胞質(zhì)電子密度較高, 含有較多顆粒以及細(xì)胞器, 如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、溶酶體等, 而透明細(xì)胞的細(xì)胞器較少。饒小珍等[3]也發(fā)現(xiàn)九孔鮑的顆粒細(xì)胞胞質(zhì)含有豐富的細(xì)胞器, 有較多的線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等, 而無顆粒細(xì)胞則只有少量線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。本研究中, 應(yīng)用特異性的探針對(duì)血細(xì)胞的線粒體和溶酶體進(jìn)行標(biāo)記從而分析其數(shù)量, 結(jié)果顯示這兩類細(xì)胞器均在大顆粒細(xì)胞中最多, 小顆粒細(xì)胞次之, 透明細(xì)胞中最少, 與以往超微觀察的研究報(bào)道一致[2-3]。細(xì)胞器的多寡從側(cè)面反映了各類血細(xì)胞在功能上也存在差異。兩類顆粒細(xì)胞的線粒體較多, 表明它們的生理代謝過程更為活躍, 包括免疫酶類的合成、吞噬作用以及脫顆粒等耗能過程; 較多的溶酶體表明兩類顆粒細(xì)胞對(duì)異物、病原體以及壞死細(xì)胞等的清除能力更強(qiáng), 在免疫過程中擔(dān)當(dāng)更為重要的角色。

    3.4 血細(xì)胞的免疫功能

    細(xì)胞凋亡是機(jī)體正常細(xì)胞在受到生理和病理性刺激后出現(xiàn)的一種自發(fā)的死亡過程。本研究發(fā)現(xiàn), 正常雜色鮑的血細(xì)胞中也可檢測到一定的凋亡細(xì)胞, 這是機(jī)體正常新陳代謝的表現(xiàn), 在蝦類的研究中也有相似的結(jié)果[7]。另有研究發(fā)現(xiàn), 貝類在受到環(huán)境污染物脅迫后,血細(xì)胞會(huì)受到毒性損傷, 從而被誘導(dǎo)發(fā)生凋亡[12,19],雖然細(xì)胞凋亡是機(jī)體清除損傷細(xì)胞的重要過程, 但血細(xì)胞凋亡率的持續(xù)上升可能會(huì)引起血細(xì)胞數(shù)量的下降,從而導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降, 甚至危及生命[20]??梢? 血細(xì)胞凋亡在環(huán)境毒理學(xué)和免疫學(xué)研究中都是一個(gè)重要的敏感指標(biāo), 在往后的研究中可加以重視。

    吞噬作用是血細(xì)胞的主要免疫功能之一, 對(duì)異物、病原體以及自身的壞死細(xì)胞、碎片等進(jìn)行清除。由于流式細(xì)胞術(shù)具有準(zhǔn)確、快捷、重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn), 已被應(yīng)用于多種貝類血細(xì)胞吞噬作用研究中[9,13-14,21]。本研究根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)所建立的測定條件, 對(duì)雜色鮑血細(xì)胞的總體吞噬情況進(jìn)行分析, 結(jié)果顯示總吞噬率為 54.32%~75.17%, 吞噬一個(gè)微球的血細(xì)胞占15.74%~28.80%。有的國外學(xué)者認(rèn)為為了減少非特異性粘附所帶來的誤差, 應(yīng)以吞噬三個(gè)及以上微球的血細(xì)胞的比例來衡量吞噬活性[9,14,21], 本研究中測得該比例達(dá)到了 20.03%~31.64%, 可見本研究的測定條件同樣適用于此衡量標(biāo)準(zhǔn)。大部分貝類研究報(bào)道認(rèn)為吞噬作用主要由顆粒細(xì)胞完成, 透明細(xì)胞也具有一定的吞噬能力[22-23]。在本研究中, 由于血細(xì)胞進(jìn)行吞噬作用, 細(xì)胞發(fā)生了變形, 其大小和顆粒度發(fā)生不同程度的改變, 另外由于吞噬過程被激活,血細(xì)胞的脫顆粒免疫反應(yīng)也可能被進(jìn)一步激活, 也對(duì)血細(xì)胞的大小和顆粒復(fù)雜度產(chǎn)生影響, 從而在FSC-SSC散點(diǎn)圖中難以區(qū)分各類血細(xì)胞, 因此本研究未能對(duì)不同類型血細(xì)胞的吞噬活性進(jìn)行分析。

    非特異性酯酶普遍存在于各類細(xì)胞中, 是溶酶體酶類之一, 參與對(duì)異物、病原體的殺傷及清除。細(xì)胞化學(xué)研究顯示九孔鮑各類血細(xì)胞中均含有非特異性酯酶, 總陽性率達(dá) 86.3%[3]。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)分析, 也表明雜色鮑各類血細(xì)胞均具有非特異性酯酶活性, 且在各類血細(xì)胞中存在差異, 兩類顆粒細(xì)胞顯著高于透明細(xì)胞, 此結(jié)果與溶酶體數(shù)量的結(jié)果相吻合。

    活性氧(reactive oxygen species, ROS)包括超氧陰離子(O2–)、過氧化氫( H2O2)和羥自由基(·OH)等, 是機(jī)體進(jìn)行防御殺菌的重要物質(zhì)。血細(xì)胞在自然生理?xiàng)l件下也存在一定量的ROS, 當(dāng)病菌入侵時(shí), ROS含量會(huì)迅速上升, 以進(jìn)行免疫殺菌, 此過程稱為呼吸爆發(fā)[23]。研究表明鮑類血細(xì)胞經(jīng)細(xì)菌、病毒或抗原物質(zhì)刺激后, 均會(huì)產(chǎn)生大量的ROS進(jìn)行免疫防御[15,18,24]。本研究對(duì)自然生理狀態(tài)下雜色鮑各類血細(xì)胞的非誘導(dǎo)性 ROS含量進(jìn)行比較, 結(jié)果顯示大顆粒細(xì)胞的 ROS含量最多, 小顆粒細(xì)胞次之, 透明細(xì)胞最少。線粒體數(shù)量、溶酶體數(shù)量、非特異性酯酶以及ROS含量均得到了一致的結(jié)果, 表明兩類顆粒細(xì)胞在鮑類的免疫防御過程中可能發(fā)揮更為重要的作用。

    [1]黃勇超, 劉志昕. 鮑非特異性免疫研究進(jìn)展[J].水產(chǎn)科學(xué), 2008, 27(1): 51-54.

    [2]李太武, 李曄, 蘇秀榕. 雜色鮑的血細(xì)胞[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2007, 31(增刊): 12-17.

    [3]饒小珍, 陳寅山, 林崗, 等. 九孔鮑血細(xì)胞的研究[J].福建師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2007, 23(3): 71-76.

    [4]陳全震, 楊俊毅, 王小谷, 等. 皺紋盤鮑血細(xì)胞的亞顯微結(jié)構(gòu)及分類研究[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2001, 25(6): 492-494.

    [5]王江勇, 郭志勛, 馮娟, 等. 雜色鮑血細(xì)胞的分類及顯微與超微結(jié)構(gòu)研究[J].臺(tái)灣海峽, 2008, 27(2): 156-160.

    [6]冼健安, 茍妮娜, 陳曉丹, 等. 流式細(xì)胞術(shù)檢測蝦類血細(xì)胞活性氧含量方法的建立[J].海洋科學(xué), 2012, 36(2): 29-33.

    [7]冼健安, 王安利, 苗玉濤. 流式細(xì)胞術(shù)在克氏原螯蝦血細(xì)胞的分類、活性和免疫功能中的應(yīng)用[J].淡水漁業(yè),2012, 42(1): 9-14.

    [8]冼健安, 王安利. 飼料中銅離子對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦血細(xì)胞組成、活性和免疫功能的影響[J].海洋科學(xué), 2013, 37(2): 40-46.

    [9]Bado-Nilles A, Gagnaire B, Thomas-Guyon H, et al.Effects of 16 pure hydrocarbons and two oils on haemocyte and haemolymphatic parameters in the Pacific oyster,Crassostrea gigas(Thunberg)[J].Toxicology in Vitro, 2008, 22(6): 1610-1617.

    [10]Brousseau P, Pellerin J, Morin Y, et al. Flow cytometry as a tool to monitor the disturbance of phagocytosis in the clamMya arenariahemocytes following in vitro exposure to heavy metals[J].Toxicology, 2000, 142: 145-156.

    [11]Gagnaire B, Thomas-Guyon H, Renault T. In vitro effects of cadmium and mercury on Paci fi c oyster,Crassostrea gigas(Thunberg), haemocytes[J].Fish & Shell fi sh Immunology, 2004, 16: 501-512.

    [12]王清, 楊紅生, 王曉宇. 鎘和苯并芘脅迫對(duì)文蛤血細(xì)胞功能的影響[J].海洋科學(xué), 2010, 34(9): 82-86.

    [13]李進(jìn)壽, 陳軍, 唐艷霞, 等. 利用流式細(xì)胞儀技術(shù)研究雜色鮑血細(xì)胞的吞噬率[J].臺(tái)灣海峽, 2010, 29(4): 460-465.

    [14]Donaghy L, Hong H, Lambert C, et al. First characterisation of the populations and immune-related activities of hemocytes from two edible gastropod species,the disk abalone,Haliotis discus discusand the spiny top shell,Turbo cornutus[J].Fish & Shellfish Immunology,2010, 28: 87-97.

    [15]張劍誠, 張峰, 王吉橋. 皺紋盤鮑血細(xì)胞分類及活性氧產(chǎn)生機(jī)理的研究[J].大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào), 2004, 19(3):182-188.

    [16]Sahaphong S, Linthong V, Wanichano C, et al. Morphofunctional study of the hemocyte ofHaliotis asinine[J].Joumal of Shellfish Research, 2001, 20(1): 51-54.

    [17]Travers M, da Silva P M, Go?c N L, et al. Morphologic,cytometric and functional characterisation of abalone(Haliotis tuberculata)haemocytes[J].Fish & Shellfish Immunology, 2008, 24: 400-411.

    [18]王江勇, 郭志勛, 馮娟, 等. 雜色鮑血細(xì)胞免疫特點(diǎn)及免疫功能的研究[J].熱帶海洋學(xué)報(bào), 2010, 29(3): 71-76.

    [19]劉靜, 潘魯青, 朱現(xiàn)曄. 苯并(a)芘對(duì)櫛孔扇貝血細(xì)胞損傷與凋亡的研究[J].海洋環(huán)境科學(xué), 2011, 30(2): 153-157.

    [20]Xian J A, Wang A L, Chen X D, et al. Cytotoxicity of nitrite on haemocytes of the tiger shrimp,Penaeus monodon, using flow cytometric analysis[J].Aquaculture,2011, 317: 240-244.

    [21]Donaghy L, Kim B, Hong H, et al. Flow cytometry studies on the populations and immune parameters of the hemocytes of the Suminoe oyster,Crassostrea ariakensis[J].Fish &Shell fi sh Immunology, 2009, 27: 296-301.

    [22]馬洪明, 麥康森. 貝類血細(xì)胞的吞噬作用和非我識(shí)別[J].海洋科學(xué), 2003, 27(2): 16-18.

    [23]孫敬鋒, 吳信忠. 貝類血細(xì)胞及其免疫功能研究進(jìn)展[J].水生生物學(xué)報(bào), 2006, 30(5): 601-607.

    [24]張峰, 李光友, 張培軍. 皺紋盤鮑血細(xì)胞活性氧產(chǎn)生的研究[J].中國水產(chǎn)科學(xué), 1999, 6(3): 36-40.

    猜你喜歡
    雜色溶酶體顆粒細(xì)胞
    MicroRNA調(diào)控卵巢顆粒細(xì)胞功能的研究進(jìn)展
    溶酶體功能及其離子通道研究進(jìn)展
    生物化工(2021年2期)2021-01-19 21:28:13
    溶酶體及其離子通道研究進(jìn)展
    生物化工(2020年1期)2020-02-17 17:17:58
    高中階段有關(guān)溶酶體的深入分析
    讀與寫(2019年35期)2019-11-05 09:40:46
    大腿肌內(nèi)顆粒細(xì)胞瘤1例
    家蠶現(xiàn)行品種871雜色卵發(fā)生誘因初探*
    淺談溶酶體具有高度穩(wěn)定性的原因
    補(bǔ)腎活血方對(duì)卵巢早衰小鼠顆粒細(xì)胞TGF-β1TGF-βRⅡ、Smad2/3表達(dá)的影響
    中成藥(2017年9期)2017-12-19 13:34:22
    革命的“雜色”與雜糅的語言———評(píng)馬步升《革命切片》的兩個(gè)特色
    人間(2015年21期)2015-03-11 15:23:08
    不同濃度苯并(a)芘對(duì)雜色鮑抗氧化酶活性的影響
    91在线精品国自产拍蜜月| 联通29元200g的流量卡| 一级av片app| 亚洲av不卡在线观看| 欧美极品一区二区三区四区| 天堂网av新在线| 亚洲在久久综合| 国产精品1区2区在线观看.| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 亚洲乱码一区二区免费版| 色吧在线观看| 久久久久久大精品| 久久久久九九精品影院| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲在线观看片| 午夜视频国产福利| 99精品在免费线老司机午夜| 欧美最黄视频在线播放免费| 国产伦一二天堂av在线观看| 免费av观看视频| 久久久欧美国产精品| 亚洲欧美精品综合久久99| 亚洲精品456在线播放app| 成人欧美大片| 边亲边吃奶的免费视频| 丰满乱子伦码专区| a级毛色黄片| 看黄色毛片网站| 欧美一区二区精品小视频在线| 五月玫瑰六月丁香| 午夜爱爱视频在线播放| 日韩欧美国产在线观看| av.在线天堂| 国产精品一及| 欧美色视频一区免费| 亚洲在线自拍视频| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| АⅤ资源中文在线天堂| 久久午夜亚洲精品久久| 国产激情偷乱视频一区二区| 国产极品天堂在线| 精品免费久久久久久久清纯| 国产精品久久电影中文字幕| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 爱豆传媒免费全集在线观看| 日本欧美国产在线视频| 天堂网av新在线| 亚洲一区二区三区色噜噜| 爱豆传媒免费全集在线观看| 国内精品宾馆在线| 欧美变态另类bdsm刘玥| 亚洲自拍偷在线| 久久综合国产亚洲精品| 欧美极品一区二区三区四区| 熟女电影av网| 变态另类丝袜制服| 好男人在线观看高清免费视频| 99热这里只有是精品50| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 又爽又黄无遮挡网站| 国产精品电影一区二区三区| 免费看a级黄色片| 国国产精品蜜臀av免费| 久久精品久久久久久久性| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 18+在线观看网站| 亚洲经典国产精华液单| 亚洲成人中文字幕在线播放| 一边摸一边抽搐一进一小说| 99精品在免费线老司机午夜| 亚洲av中文av极速乱| 亚洲最大成人av| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 精品国产三级普通话版| 天堂√8在线中文| 日韩亚洲欧美综合| 国产精品电影一区二区三区| 国产真实伦视频高清在线观看| 一级毛片久久久久久久久女| 色尼玛亚洲综合影院| 一级黄色大片毛片| 成人国产麻豆网| 日韩精品有码人妻一区| 只有这里有精品99| 91久久精品电影网| 一边摸一边抽搐一进一小说| 欧美日韩乱码在线| 免费观看的影片在线观看| 97热精品久久久久久| 国产人妻一区二区三区在| 国产美女午夜福利| 91精品国产九色| av黄色大香蕉| 赤兔流量卡办理| 边亲边吃奶的免费视频| 亚洲av一区综合| 欧美成人免费av一区二区三区| 黄色一级大片看看| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 亚洲成人久久爱视频| 少妇的逼水好多| 久久欧美精品欧美久久欧美| 69av精品久久久久久| 欧美高清性xxxxhd video| av天堂中文字幕网| 爱豆传媒免费全集在线观看| 欧美色欧美亚洲另类二区| 成人永久免费在线观看视频| 精品一区二区免费观看| 欧美xxxx性猛交bbbb| kizo精华| 久久久成人免费电影| 一本久久中文字幕| 尾随美女入室| 丰满的人妻完整版| 亚洲人与动物交配视频| 看免费成人av毛片| 波多野结衣高清作品| 久99久视频精品免费| 91精品一卡2卡3卡4卡| 91av网一区二区| 精品久久久久久久末码| 国产在线男女| 国内揄拍国产精品人妻在线| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 久久鲁丝午夜福利片| 亚洲欧洲国产日韩| 成人av在线播放网站| 久久久欧美国产精品| 国产 一区精品| 一区二区三区免费毛片| 黄色欧美视频在线观看| 久久久午夜欧美精品| 日本av手机在线免费观看| 99热这里只有精品一区| 精品人妻偷拍中文字幕| 亚洲五月天丁香| 国产日韩欧美在线精品| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | 国产成人午夜福利电影在线观看| 婷婷六月久久综合丁香| 国内精品宾馆在线| 亚洲欧美成人精品一区二区| 国产高清激情床上av| 久久久久九九精品影院| 欧美+日韩+精品| 精品国产三级普通话版| 在线免费观看不下载黄p国产| 国产成人一区二区在线| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 国产精品永久免费网站| 白带黄色成豆腐渣| 久久精品人妻少妇| 3wmmmm亚洲av在线观看| 免费看美女性在线毛片视频| 成人二区视频| 国产高潮美女av| 国产精品爽爽va在线观看网站| 国产精品伦人一区二区| 国产精品一区二区性色av| 听说在线观看完整版免费高清| 国产精品蜜桃在线观看 | 免费看美女性在线毛片视频| 别揉我奶头 嗯啊视频| 精品一区二区三区人妻视频| av在线播放精品| av在线老鸭窝| 国产极品天堂在线| 国产亚洲精品久久久com| 亚洲人成网站在线观看播放| 色噜噜av男人的天堂激情| 亚洲四区av| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 爱豆传媒免费全集在线观看| 中文字幕制服av| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 国产精品爽爽va在线观看网站| 精品日产1卡2卡| 欧美区成人在线视频| 久久精品综合一区二区三区| 国产在视频线在精品| 日本免费一区二区三区高清不卡| 欧美成人a在线观看| 国产欧美日韩精品一区二区| 99热网站在线观看| 国产精品伦人一区二区| 成年女人看的毛片在线观看| 欧美zozozo另类| 99热这里只有是精品50| 午夜a级毛片| 国产淫片久久久久久久久| 特级一级黄色大片| 99热只有精品国产| 禁无遮挡网站| 天堂网av新在线| 日韩一本色道免费dvd| 嫩草影院精品99| 久久人人爽人人片av| 国产精品不卡视频一区二区| 亚洲国产精品sss在线观看| 一夜夜www| 直男gayav资源| 寂寞人妻少妇视频99o| a级毛片免费高清观看在线播放| 久久精品国产亚洲网站| 国内精品久久久久精免费| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 我要看日韩黄色一级片| 午夜激情欧美在线| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 亚洲精品国产成人久久av| 亚洲av不卡在线观看| 边亲边吃奶的免费视频| 亚洲国产欧美在线一区| 精品欧美国产一区二区三| 观看免费一级毛片| 网址你懂的国产日韩在线| 永久网站在线| 亚洲国产精品成人久久小说 | 欧美变态另类bdsm刘玥| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 成人三级黄色视频| 久久久久久大精品| 好男人在线观看高清免费视频| 老女人水多毛片| 一级黄色大片毛片| 亚洲综合色惰| 日韩欧美精品免费久久| 高清在线视频一区二区三区 | 久久99热6这里只有精品| 精品久久久噜噜| 日本黄色视频三级网站网址| 丰满人妻一区二区三区视频av| 午夜免费激情av| 久久久a久久爽久久v久久| 亚洲成人av在线免费| a级毛片a级免费在线| 直男gayav资源| av在线观看视频网站免费| 男插女下体视频免费在线播放| 亚洲无线观看免费| 久久精品综合一区二区三区| 欧美一级a爱片免费观看看| 亚洲精品成人久久久久久| 亚洲国产色片| 国产黄片美女视频| 搡老妇女老女人老熟妇| 免费av观看视频| 久久久久久久久久黄片| 日本三级黄在线观看| 波多野结衣高清无吗| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 伦精品一区二区三区| 精品午夜福利在线看| 亚洲欧美精品综合久久99| 国产乱人视频| 国产老妇伦熟女老妇高清| 国产精品.久久久| 听说在线观看完整版免费高清| 国产成人a区在线观看| 亚洲精品成人久久久久久| 国产成人aa在线观看| 99视频精品全部免费 在线| 一级毛片久久久久久久久女| 国产激情偷乱视频一区二区| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 成年av动漫网址| 亚洲真实伦在线观看| 精品一区二区三区视频在线| 欧美三级亚洲精品| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产黄片美女视频| 日本av手机在线免费观看| 麻豆一二三区av精品| 美女黄网站色视频| 精品久久久久久久久久久久久| 国产 一区精品| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 桃色一区二区三区在线观看| 日韩一本色道免费dvd| 男插女下体视频免费在线播放| 黄色一级大片看看| 超碰av人人做人人爽久久| 国产精品电影一区二区三区| 天堂√8在线中文| 精品久久久久久久久久久久久| 国内揄拍国产精品人妻在线| 久久国内精品自在自线图片| 国产高清不卡午夜福利| 男女视频在线观看网站免费| 成人高潮视频无遮挡免费网站| or卡值多少钱| 赤兔流量卡办理| 国产精品一区二区三区四区久久| 国产成人a区在线观看| 日韩制服骚丝袜av| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 国产 一区精品| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 寂寞人妻少妇视频99o| 国模一区二区三区四区视频| 在线观看66精品国产| 一个人免费在线观看电影| 国产在线男女| 综合色av麻豆| 国产欧美日韩精品一区二区| 亚洲欧洲日产国产| 国产精品野战在线观看| 亚洲国产欧美人成| 久久这里有精品视频免费| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 国产精品久久电影中文字幕| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 91午夜精品亚洲一区二区三区| 亚洲四区av| 亚洲成人av在线免费| 91久久精品国产一区二区成人| 中文资源天堂在线| av在线天堂中文字幕| 欧美变态另类bdsm刘玥| a级毛片a级免费在线| 99精品在免费线老司机午夜| 有码 亚洲区| 久久久久久久亚洲中文字幕| 国产成年人精品一区二区| 日本在线视频免费播放| 免费av毛片视频| 亚洲久久久久久中文字幕| 精华霜和精华液先用哪个| 夜夜夜夜夜久久久久| 久久欧美精品欧美久久欧美| 国产视频内射| 国产一区二区三区av在线 | 色综合亚洲欧美另类图片| 人妻久久中文字幕网| 亚洲自拍偷在线| 国产精品一二三区在线看| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 麻豆成人午夜福利视频| 国产爱豆传媒在线观看| 国产美女午夜福利| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 在线免费十八禁| 不卡一级毛片| 国产精品一区www在线观看| 三级国产精品欧美在线观看| 午夜爱爱视频在线播放| 亚洲国产高清在线一区二区三| 九九热线精品视视频播放| 国产成人a区在线观看| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 国产淫片久久久久久久久| 亚洲经典国产精华液单| 99riav亚洲国产免费| 在线观看66精品国产| 亚洲五月天丁香| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 亚洲av.av天堂| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 精品国产三级普通话版| 精品人妻一区二区三区麻豆| av免费在线看不卡| 日韩视频在线欧美| 久久久久久久午夜电影| 国产伦理片在线播放av一区 | 一级毛片aaaaaa免费看小| 哪里可以看免费的av片| 看黄色毛片网站| or卡值多少钱| 不卡视频在线观看欧美| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 成人性生交大片免费视频hd| 久久精品人妻少妇| 啦啦啦啦在线视频资源| 欧美日韩精品成人综合77777| 欧美成人免费av一区二区三区| 日韩中字成人| 高清在线视频一区二区三区 | 最近视频中文字幕2019在线8| 麻豆一二三区av精品| a级毛片免费高清观看在线播放| 麻豆一二三区av精品| a级毛片a级免费在线| 日韩一区二区视频免费看| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 色视频www国产| 日韩欧美 国产精品| 国产精品久久久久久av不卡| 亚洲在久久综合| 久久久久久国产a免费观看| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 午夜激情欧美在线| 国产亚洲欧美98| 女同久久另类99精品国产91| 偷拍熟女少妇极品色| 天堂网av新在线| 搡女人真爽免费视频火全软件| 久久久久性生活片| 国产精品久久久久久久电影| 夜夜爽天天搞| 九草在线视频观看| 搡老妇女老女人老熟妇| 在线播放无遮挡| 欧美一区二区国产精品久久精品| 国产精品电影一区二区三区| 国产男人的电影天堂91| 男女那种视频在线观看| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 嘟嘟电影网在线观看| 三级国产精品欧美在线观看| 日本av手机在线免费观看| 国产精品不卡视频一区二区| 国产一区二区激情短视频| 中文在线观看免费www的网站| 日韩精品有码人妻一区| 晚上一个人看的免费电影| 久久国产乱子免费精品| 99热全是精品| 欧美日韩综合久久久久久| 中国国产av一级| 美女被艹到高潮喷水动态| 99在线人妻在线中文字幕| 午夜久久久久精精品| 免费观看a级毛片全部| 一级黄片播放器| 日韩av不卡免费在线播放| 国产人妻一区二区三区在| 成人特级黄色片久久久久久久| 91久久精品国产一区二区成人| 精品久久久噜噜| 国产男人的电影天堂91| 一本精品99久久精品77| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 1024手机看黄色片| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 一区二区三区四区激情视频 | 婷婷色综合大香蕉| 一进一出抽搐动态| 免费观看在线日韩| 丝袜美腿在线中文| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 深爱激情五月婷婷| 国产成人一区二区在线| 国产精品女同一区二区软件| 国产亚洲精品av在线| 色综合站精品国产| 久久久久久久久中文| 97在线视频观看| 成人欧美大片| 色吧在线观看| 国产在线精品亚洲第一网站| 97超视频在线观看视频| 国产av一区在线观看免费| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 成人亚洲精品av一区二区| 午夜福利成人在线免费观看| 亚洲精品久久久久久婷婷小说 | 亚洲av第一区精品v没综合| 精品欧美国产一区二区三| 亚洲欧美精品自产自拍| 亚洲高清免费不卡视频| 欧美不卡视频在线免费观看| 最近视频中文字幕2019在线8| 久久人妻av系列| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 久久久国产成人免费| 99久久九九国产精品国产免费| 久久人人爽人人爽人人片va| 国产精品伦人一区二区| 国产乱人视频| 午夜精品在线福利| 国产精品国产高清国产av| 色哟哟·www| 国产成人a区在线观看| 一区福利在线观看| 成年免费大片在线观看| 大型黄色视频在线免费观看| 日韩亚洲欧美综合| 此物有八面人人有两片| 亚洲不卡免费看| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 成人永久免费在线观看视频| 插阴视频在线观看视频| 2022亚洲国产成人精品| 日本三级黄在线观看| 国产av不卡久久| 亚洲性久久影院| 精品久久久久久久末码| 在线观看av片永久免费下载| 极品教师在线视频| 久久久久久久久久黄片| 91狼人影院| 一边摸一边抽搐一进一小说| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | 国产亚洲91精品色在线| 亚洲在久久综合| 日本一二三区视频观看| 亚洲精品久久久久久婷婷小说 | 看片在线看免费视频| 最近中文字幕高清免费大全6| 免费观看在线日韩| 成人鲁丝片一二三区免费| 高清日韩中文字幕在线| 97超碰精品成人国产| 天天躁日日操中文字幕| 成人毛片a级毛片在线播放| 嘟嘟电影网在线观看| 亚州av有码| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 在线观看午夜福利视频| 波多野结衣高清无吗| 别揉我奶头 嗯啊视频| 色哟哟·www| 少妇高潮的动态图| 亚洲国产色片| av免费观看日本| 国产日韩欧美在线精品| 亚洲av第一区精品v没综合| 国产极品精品免费视频能看的| 夜夜夜夜夜久久久久| av免费在线看不卡| 国产成人一区二区在线| 99久久精品国产国产毛片| 日韩av不卡免费在线播放| 高清毛片免费看| 久久久久久久午夜电影| 欧美最新免费一区二区三区| 秋霞在线观看毛片| 美女国产视频在线观看| 国产伦理片在线播放av一区 | 成年版毛片免费区| 国产美女午夜福利| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 日韩在线高清观看一区二区三区| 99riav亚洲国产免费| 免费看a级黄色片| 观看免费一级毛片| 日韩成人av中文字幕在线观看| 日本-黄色视频高清免费观看| 婷婷色av中文字幕| 久久人人爽人人爽人人片va| 99久久九九国产精品国产免费| 午夜爱爱视频在线播放| 久久这里只有精品中国| 国产精品人妻久久久久久| 午夜福利在线观看吧| 精品人妻偷拍中文字幕| 在线播放国产精品三级| 成人漫画全彩无遮挡| av.在线天堂| 91精品国产九色| 欧美精品国产亚洲| 国内精品一区二区在线观看| 久99久视频精品免费| 草草在线视频免费看| 亚洲成av人片在线播放无| 最近手机中文字幕大全| 日本色播在线视频| 日韩一区二区视频免费看| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 亚洲精品久久久久久婷婷小说 | 在线播放无遮挡| 久久韩国三级中文字幕| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 免费看日本二区| 草草在线视频免费看| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 欧美另类亚洲清纯唯美| 色噜噜av男人的天堂激情| 午夜久久久久精精品| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 欧美变态另类bdsm刘玥| 久久久精品欧美日韩精品| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 欧美色视频一区免费| 中文欧美无线码| 又爽又黄a免费视频| 一级毛片电影观看 | 午夜久久久久精精品| 国产精品日韩av在线免费观看| 日韩国内少妇激情av| 一本久久中文字幕| 2022亚洲国产成人精品| 高清毛片免费看| 精品久久久久久久久av| 麻豆成人av视频| 最后的刺客免费高清国语| 国产精品综合久久久久久久免费| 婷婷色av中文字幕| 日韩欧美三级三区| 国产精品不卡视频一区二区| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 日韩欧美 国产精品| 男人狂女人下面高潮的视频| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 日韩欧美在线乱码| 69av精品久久久久久| 日本黄大片高清| 成年免费大片在线观看| 少妇丰满av| 级片在线观看| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 99国产精品一区二区蜜桃av| 九九在线视频观看精品| 毛片女人毛片| 欧美又色又爽又黄视频| 午夜精品一区二区三区免费看| 男女视频在线观看网站免费| 村上凉子中文字幕在线| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 国产成人a∨麻豆精品|