中國鱟β-actim基因的克隆與組織表達(dá)

李文杏,黃靜茹,葉海輝,黃輝洋,李少菁

(廈門大學(xué)海洋與地球?qū)W院,福建廈門361102)

中國鱟β-actim基因的克隆與組織表達(dá)

李文杏,黃靜茹,葉海輝,黃輝洋*,李少菁

(廈門大學(xué)海洋與地球?qū)W院,福建廈門361102)

中國鱟(Tachypleus tridentatus)是一種古老的海洋動物.利用RT-PCR和RACE等分子生物學(xué)技術(shù),獲得中國鱟β-肌動蛋白基因(中國鱟β-actin,簡稱為TTBA)全長cDNA序列,總共1 515 bp,包括70 bp 5′非編碼區(qū)(untranslated regions,UTR)、314 bp 3′UTR和一個1 131 bp的開放閱讀框(open reading frame,ORF).ORF可編碼376個氨基酸殘基,總分子質(zhì)量約為41 807.7 u.同源蛋白的序列比較結(jié)果顯示,TTBA推導(dǎo)氨基酸序列與其他物種具有很高的相似性,推測β-actin基因具有很高的遺傳保守性.而基于β-actin蛋白序列比對而繪制的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示中國鱟與其他節(jié)肢動物具有較高的相似性,此結(jié)果與其現(xiàn)行的分類地位基本一致.以Real-time RT-PCR法檢測表明,在卵子發(fā)生各期的卵巢組織中TTBA表達(dá)量保持穩(wěn)定(p＞0.05),可作為定量檢測的內(nèi)參基因.

中國鱟;β-actin基因;克隆;組織表達(dá)

肌動蛋白(actin)普遍存在于真核生物中,它是細(xì)胞骨架和肌節(jié)的主要成分,其在進(jìn)化上高度保守.肌動蛋白幾乎參與了細(xì)胞的所有生理過程,如細(xì)胞分裂、染色體運動、細(xì)胞器運動等[1-3].它有多種類型,根據(jù)不同的等電點可分為α、β、γ3種[1,4-5].β-肌動蛋白(β-actin)基因不但序列高度保守,且m RNA表達(dá)量大而穩(wěn)定,因而在很多需量化的實驗技術(shù)(如RT-PCR、Northern雜交)中被當(dāng)作內(nèi)參照[6].

鱟是一種古老的海洋底棲動物,具有重要的科研意義和藥用價值.鱟在寒武紀(jì)就已經(jīng)出現(xiàn),直到現(xiàn)在形態(tài)并無重大變化,故人們稱其為“活化石”[7].鱟與三葉蟲有非常近的親緣關(guān)系,因此對鱟的生物學(xué)研究在節(jié)肢動物系統(tǒng)發(fā)生研究中有一定的意義[8].中國鱟(Tachypleus tridentatus),又名三刺鱟,隸屬于節(jié)肢動物門(Arthropoda),肢口綱(Merostomata),劍尾目(Xiphosura),鱟科(Limulidea),東方鱟屬(Tachypleus),是現(xiàn)存肢口綱僅有4個種類之一[7].迄今有關(guān)中國鱟分子生物學(xué)的報道尚少,本研究克隆了中國鱟βactin(簡稱為TTBA)的全長cDNA,并檢測其在卵子發(fā)生各期卵巢組織中的表達(dá)情況,為進(jìn)一步研究該基因的結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎(chǔ),同時也為定量技術(shù)過程中選擇可靠的內(nèi)參基因提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 動物及組織材料

中國鱟購自廈門市大學(xué)路農(nóng)貿(mào)市場,挑選處于卵巢發(fā)育各期的個體[9],實驗室暫養(yǎng)一周后選用健康、附肢完整的個體.取20 mg卵巢組織立即置于液氮中,用于總RNA提取.取100 mg卵巢組織用Bouin固定液(固定液配置體積分?jǐn)?shù)為:75%苦味酸,25%甲醛,5%乙酸)進(jìn)行固定,經(jīng)7μm切片后,以蘇木精和伊紅染色,從而進(jìn)行組織學(xué)觀察.卵巢組織根據(jù)組織形態(tài)特征和卵母細(xì)胞大小進(jìn)行分期[9].

1.1.2 主要試劑

Trizolr Reagent Total RNA Isolation Reagent, Invitrogen公司;p MD18-T、LA Taq、d NTPs、Prime-ScriptTMReverse Transcriptase,5′-Full RACE Kit、3′-Full RACE Core Set Ver.2.0,Takara公司;DNA Marker、DNase I、Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit,Fermentas公司;小量膠回收試劑盒,上海華舜生物工程有限公司.

1.1.3 PCR引物

根據(jù)GenBank中已知的節(jié)肢動物β-actin基因序列和對應(yīng)的蛋白質(zhì)序列,通過Clustalw比對,在保守序列區(qū)域設(shè)計了用于擴(kuò)增TTBA片段的簡并引物BF和BR(簡并性為:R=A或G;X=C或T;D=A,T或G;H=A,T或C;N=A,C,G或T).將片段測序后通過在NCBI上Blast確定是其他物種β-actin的同源序列后,再根據(jù)片段設(shè)計用于擴(kuò)增TTBA 5′末端和3′末端的引物B5和B3,最后根據(jù)全長c DNA設(shè)計用于Real-time RT-PCR法的引物為TF和TR(表1).

表1 引物序列Tab.1 Oligonucleotide primers

1.2 方 法

1.2.1 總RNA提取

取20 mg卵黃發(fā)生前期的中國鱟卵巢組織,參照Invitrogen公司Trizol試劑使用說明提取總RNA.以紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的濃度及純度.取1μg總RNA,參照Fermentas的Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit使用說明,反轉(zhuǎn)錄成c DNA模板,-20℃保存?zhèn)溆?

1.2.2 TTBA全長cDNA的克隆及測序

使用簡并引物BF和BR,以上述cDNA為模板,擴(kuò)增β-actin基因片段.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的回收、連接反應(yīng)及大腸桿菌(Escherichia coli)轉(zhuǎn)化等操作均按分子克隆實驗手冊介紹的方法進(jìn)行,之后挑取陽性克隆送往上海英駿生物技術(shù)有限公司測序.將測得的片段序列在NCBI上Blast確定是其他物種β-actin的同源序列后,根據(jù)片段序列設(shè)計RACE特異性引物(表1).5′末端擴(kuò)增使用引物B5和5′-Full RACE Kit,3′末端擴(kuò)增使用引物為B3和3′-Full RACE Core Set Ver. 2.0,按照試劑盒推薦的反應(yīng)體系和條件進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng).擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離檢測,按上述方法進(jìn)行測序.測序結(jié)果拼接后得到TTBA的全長c DNA序列.

1.2.3 生物信息學(xué)軟件分析

核昔酸和氨基酸序列相似性搜索用Blast軟件,來自NCBI(http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. cgi)[10];開放閱讀框(open reading frame,ORF)的查找采用ORF Finder(http:∥www.ncbi.nih.gov/ gorf/gorf.html)和DNAssist 2.0軟件;引物設(shè)計采用Primer Premier 5軟件;序列同源性分析及分子系統(tǒng)樹的繪制采用Clustalw與Mega軟件;序列分析結(jié)果輸出在Bioedit軟件中進(jìn)行加工.

1.2.4 TTBA基因的組織表達(dá)研究

以上述方法提取各發(fā)育期的卵巢組織的總RNA,卵巢發(fā)育分為4個期:卵原細(xì)胞期、卵母細(xì)胞早期、卵黃發(fā)生前期和卵黃發(fā)生期[9].總RNA經(jīng)DNase I處理以除去DNA.以各組織1μg總RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板,設(shè)置反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中不加反轉(zhuǎn)錄酶為陰性對照,使用熒光定量引物TF和TR(表1),擴(kuò)增β-actin基因片段,擴(kuò)增片段經(jīng)測序證明其正確性.數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用相對定量的方法,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各期相對于第一期的相對表達(dá)量.數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD).每期使用5個中國鱟個體,每個個體試驗5次,每次試驗設(shè)置5個重復(fù).數(shù)據(jù)處理采用SPSS軟件進(jìn)行方差齊性和正態(tài)性的檢驗后,以單因素方差分析(one-way anova)中的鄧肯法(Duncan)進(jìn)行檢驗,差異性顯著分析結(jié)果以p值表示,p＜0.05為差異顯著.

2 結(jié) 果

2.1 TTBA全長cDNA及其推導(dǎo)氨基酸序列分析

將片段序列、5′末端序列和3′末端序列拼接成一條完整的cDNA序列,此序列在GenBank數(shù)據(jù)庫比對時與節(jié)肢動物其他物種的β-actin基因顯示了較高的相似性,從而確定此序列為TTBA全長c DNA.

TTBA全長cDNA(GenBank登錄號: JQ966943),總共1 515 bp,包括70 bp 5′非編碼區(qū)(untranslated regions,UTR)、314 bp 3′UTR和一個1 131 bp的ORF(圖1).在poly(A)上游15 bp處可見加尾信號序列“AATAAA”.ORF可編碼376個氨基酸殘基,總分子質(zhì)量約為41 807.7 u.

2.2 序列同源性分析

TTBA推導(dǎo)的氨基酸序列在NCBI上進(jìn)行Blast搜索,結(jié)果顯示該序列與其他β-actin序列同源性非常高,與美洲鱟(Limulus polyphemus)、擬穴青蟹(Scylla paramamosain)、桔小實蠅(Bactrocera dorsalis)的相似性分別為99%,98%和97%(表2).

圖2是用Clastalw對實驗所得TTBA氨基酸序列與已有的其他一些物種β-actin進(jìn)行對比后,以Mega的Neighbor-Joining(NJ)法繪制的系統(tǒng)進(jìn)化樹.節(jié)點處數(shù)字表示重復(fù)1 000次的bootstrap值(自展值).系統(tǒng)進(jìn)化樹中,中國鱟與美洲鱟聚為一個亞支.雖然未與其他節(jié)肢動物聚為一個亞支,但相對于非節(jié)肢動物而言,中國鱟和美洲鱟與其他節(jié)肢動物顯示了更高的相似性,此結(jié)果與現(xiàn)行的分類地位基本一致.

圖1 TTBA核昔酸及其推導(dǎo)氨基酸序列Fig.1 The nucleotides and deduced peptides of TTBA

表2 TTBA氨基酸序列搜索比對結(jié)果Tab.2 Result of blast with TTBA amino acid sequence

2.3 TTBA在卵巢組織的表達(dá)

根據(jù)卵子發(fā)生過程可將中國鱟卵巢發(fā)育分為4個期:卵原細(xì)胞期、卵母細(xì)胞早期、卵黃發(fā)生前期和卵黃發(fā)生期[9].每期使用5個中國鱟個體,每個個體試驗5次,每次試驗設(shè)置5個重復(fù).差異性顯著分析結(jié)果以p值表示,p＜0.05為差異顯著.Real-time RT-PCR實驗結(jié)果表明,卵子發(fā)育的4期過程中TTBA在卵巢中的表達(dá)量保持穩(wěn)定(p＞0.05)(圖3).

圖2 基于NJ法構(gòu)建的β-actin系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogram ofβ-actin based on NJ method

圖3 Real-time RT-PCR法檢測TTBA在中國鱟卵子發(fā)生各期卵巢中的m RNA表達(dá)Fig.3 Expression profiles of TTBA mRNA in ovary at different stages during oogenesis determined by Real-time RT-PCR

3 討 論

本研究報道了中國鱟β-actin(TTBA)全長cDNA及其推導(dǎo)氨基酸序列.序列分析發(fā)現(xiàn),TTBA氨基酸序列高度保守,與其他節(jié)肢動物具很高的相似性,如美洲鱟、擬穴青蟹、桔小實蠅可達(dá)99%,98%和97% (表2).這與已有的研究結(jié)果一致.目前已得到的肌動蛋白家族成員,從真菌到人類約有100多種,其蛋白序列的相似性都極高[11].而有研究表明,不同的肌動蛋白經(jīng)1億年所發(fā)生的可導(dǎo)致氨基酸改變的核昔酸置換率(rates of nucleotide substitution,RNS)也僅1%左右[12].由此說明肌動蛋白的編碼基因進(jìn)化速度非常慢,這很可能與其作為細(xì)胞骨架的基本功能有重要聯(lián)系.

中國鱟是節(jié)肢動物門肢口綱僅存的4種古老動物之一,其被證明出現(xiàn)在寒武紀(jì),與三葉蟲有著很近的親緣關(guān)系,其形態(tài)直到現(xiàn)在都沒有很大改變[7-8].因此在生物進(jìn)化研究上具有重要地位.現(xiàn)有的研究從形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)等方面將其歸為節(jié)肢動物.如中國鱟雌激素相關(guān)受體(estrogen related receptor,ERR)蛋白序列的進(jìn)化分析將其歸為節(jié)肢動物門[13].在本研究中,中國鱟同樣與其他節(jié)肢動物顯示了較高的相似性(圖2),這與其現(xiàn)行的生物學(xué)分類地位是一致的.

在相關(guān)分子生物學(xué)的研究中,雖然近年來相繼應(yīng)用了GAPDH和28S rRNA等作為內(nèi)參照,但作為一種成熟的參照系統(tǒng),β-actin仍是最常用的內(nèi)參照基因[4,14-17].β-actin的m RNA為真核細(xì)胞中豐富的轉(zhuǎn)錄模板,在所有組織中都有表達(dá),且其表達(dá)幾乎不隨年齡產(chǎn)生變化,因此該基因被廣泛用作定量研究的內(nèi)參照.如Horigane等[18]對非洲鈍緣蜱的研究發(fā)現(xiàn),該昆蟲的actin基因在吸血前后的表達(dá)分析中無顯著變化.唐婷等[19]對一種昆蟲謝氏寬漠王(Mantichorula semenwi)熱激處理后檢測,發(fā)現(xiàn)不同恢復(fù)時間β-actin的表達(dá)量無明顯變化,表明在受外界環(huán)境脅迫作用下,β-actin是研究昆蟲的可靠內(nèi)參照基因.但是,在Sarmiento等[20]對廣溫性的鯉(Cyprinus carpio)進(jìn)行冷適應(yīng)研究中檢測卻發(fā)現(xiàn)β-actin基因的表達(dá)量在冬季和夏季有顯著性差異;Barrallo等[21]利用Northern雜交和組織原位雜交對斑馬魚(Brachydanio rerio)βactin基因的表達(dá)進(jìn)行研究時發(fā)現(xiàn),β-actin基因在腦神經(jīng)細(xì)胞增殖時具有較高的表達(dá)水平.因此可見,在對β-actin基因作為內(nèi)參照進(jìn)行基因表達(dá)研究時,首先要對其作為內(nèi)參照的可靠性進(jìn)行檢測.本研究中Realtime RT-PCR分析結(jié)果顯示,卵子發(fā)育的過程中, TTBA在中國鱟卵巢中的表達(dá)量保持穩(wěn)定(p＞0.05) (圖3),具有良好的穩(wěn)定性,表明該基因適合作為研究組織表達(dá)的內(nèi)參,從而為相關(guān)分子生物學(xué)的研究提供了依據(jù).

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Molecular Cloning and Expression Profiles ofβ-actim Gene in Various Tissues of the Horseshoe Crab, Tachypleus tridemtatus

LI Wen-xing,HUANG Jing-ru,XE Hai-hui,HUANG Hui-yang*,LI Shao-jing
(College of Ocean&Earth Sciences,Xiamen University,Xiamen 361102,China)

The horseshoe crab(Tachypleus tridentatus)is an ancient marine organism.In this study,a full-length cDNA ofβ-actin (designated as TTBA)was cloned from T.tridentatus using RT-PCR and RACE method.Data showed that the full-length cDNA was 1 515 bp,including a 5′untranslated region(UTR)of 70 bp,a 3′UTR of 314 bp,and an open reading frame(ORF)of 1 131 bp nucleotides.The ORF encoded a polypeptide of 376 amino acids with calculated molecular mass of 41 807.7 u.Amino acid sequence alignment showed the TTBA had high similarity with that in other organisms.It suggested thatβ-actin was highly conservative.Phylogenetic analysis based on comparison ofβ-actin proteins showed that T.tridentatus was more similar to arthropod than to other invertebrate species.This result was consistent with the current evolution relationship.Moreover,gene expression profiles by Real-Time RT-PCR revealed that the abundance of TTBA m RNA kept steady during oogenesis in ovary(p＞0.05)indicating that TTBA is suitable as an endogenous control for gene expression study.

Tachypleus tridentatus;β-actin gene;cloning;tissues expression

10.6043/j.issn.0438-0479.2015.02.007

Q 781

A

0438-0479(2015)02-0188-06

2014-06-11 錄用日期:2014-09-08

國家自然科學(xué)基金(40406030)

*通信作者:huiyang@xmu.edu.cn

李文杏,黃靜茹,葉海輝,等.中國鱟β-actin基因的克隆與組織表達(dá)[J].廈門大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2015,54(2): 188-193.

:Li Wenxing,Huang Jingru,Xe Haihui,et al.Molecular cloning and expression profiles ofβ-actin gene in various tissues of the horseshoe crab,Tachypleus tridentatus[J].Journal of Xiamen University:Natural Science,2015,54(2):188-193.(in Chinese)