響應(yīng)面法優(yōu)化人參花多糖的提取工藝

萬(wàn)茜淋，焦麗麗，馬林，王明珠，劉淑瑩，2

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)　吉林省人參科學(xué)研究院，長(zhǎng)春　130117；2.中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所，長(zhǎng)春　130022）

響應(yīng)面法優(yōu)化人參花多糖的提取工藝

萬(wàn)茜淋1，焦麗麗1，馬林1，王明珠1，劉淑瑩1，2

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省人參科學(xué)研究院，長(zhǎng)春130117；2.中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所，長(zhǎng)春130022）

以人參花為原料，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法，利用中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，對(duì)人參花多糖提取工藝中的各影響因素進(jìn)行優(yōu)化。以提取時(shí)間、液料比、提取次數(shù)和提取溫度為試驗(yàn)因素，人參花多糖提取率為響應(yīng)值，進(jìn)行四因素五水平試驗(yàn)建立模型，獲得多元二次回歸方程。結(jié)果表明：提取時(shí)間2.495h，液料比38.55∶1（g/g），提取次數(shù)5次，提取溫度80℃時(shí)，人參花多糖提取率預(yù)測(cè)值為13.94%。最佳條件下人參花多糖提取率為13.81±0.28%，表明實(shí)測(cè)值與理論值之間具有良好的擬合度，回歸模型切實(shí)可行，優(yōu)化的工藝條件可用于人參花多糖提取。

人參；多糖；提取；響應(yīng)面分析法

人參（Panax Ginseng C.A.Meyer），刺五加科植物，在中國(guó)、韓國(guó)和日本等傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中廣泛使用，具有補(bǔ)氣生津，鎮(zhèn)靜等功效。人參中富含多種活性成分，包括人參皂苷、人參多肽、人參多糖等。中外學(xué)者對(duì)人參中上述成分的功能特性和藥用價(jià)值已進(jìn)行廣泛而深入的研究［1，2］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，人參多糖不僅具有免疫調(diào)節(jié)作用，同時(shí)具有抗腫瘤、抗氧化、抗輻射、抗黏連以及降糖等活性［3-7］。Shin等人研究發(fā)現(xiàn)，人參葉和人參果可能具有與人參根相似的藥理活性，從而在臨床上得到應(yīng)用［8］。然而，目前關(guān)于人參花的研究少之甚少，特別是對(duì)人參花的多糖研究尚未見報(bào)道。

響應(yīng)面法（Response Surface Methodology，RSM）是一種應(yīng)用廣泛的試驗(yàn)優(yōu)化方法，它能夠有效快速地確定多因子系統(tǒng)的最佳條件，已應(yīng)用于多種優(yōu)化試驗(yàn)中［9，10］。響應(yīng)面法通過建立回歸分析模型，縮短試驗(yàn)前期條件摸索的時(shí)間。因此，本研究采用響應(yīng)面法，通過中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)（CentralComposite Design，CCD）原理，優(yōu)化人參花多糖（Ginseng Flower Polysaccharides，GFP）的提取條件，提高GFP的提取率，為人參花多糖的深入研究和開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

人參花采集于中國(guó)吉林省撫松縣人參種植基地，經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)王淑敏教授鑒定為為五加科植物人參Panax ginseng的干燥花蕾。單糖標(biāo)準(zhǔn)試劑購(gòu)于Sigma化工有限公司（St.Louis，MO，USA）。

試驗(yàn)中所有化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

臺(tái)式高速離心機(jī)（Eppendorf公司）；恒溫水浴鍋（北京醫(yī)療設(shè)備廠）；AB 135-S電子分析天平（METTLER TOLEDD公司）；粉碎機(jī)（歐凱萊芙寶業(yè)公司）；KQ-500DA型超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.3方法

1.3.1多糖提取工藝流程

人參花粉碎→95%乙醇回流→離心→沉淀干燥→水提→醇沉→沉淀復(fù)溶→凍干→計(jì)算多糖提取率。

1.3.2多糖提取率計(jì)算

GFP提取率計(jì)算公式如下：

其中，m0（g）表示干燥GFP重量，m（g）表示干燥原料重量。

1.3.3單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

分別對(duì)不同的提取溫度（40、50、60、70、80、90、100℃）、液料比（10、15、20、25、30、35、40、45，g/g）、提取時(shí)間（0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5h）和提取次數(shù)（1、2、3、4、5、6、7次）進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察各單因素對(duì)GFP提取率的影響。

1.3.4響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過單因素試驗(yàn)確定的四個(gè)獨(dú)立變量范圍后，采用CCD設(shè)計(jì)法提供的方案進(jìn)行試驗(yàn)（分別標(biāo)記為：X1，提取時(shí)間；X2，液料比；X3，提取次數(shù)；X4，提取溫度）［11］。根據(jù)CCD設(shè)計(jì)原理，選取對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著影響的因素及其范圍，設(shè)計(jì)四因素五水平的響應(yīng)面試驗(yàn)方案，如表1所示，從而獲得最佳條件組合。

表1　Central composite試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平

CCD試驗(yàn)按照以下方程設(shè)計(jì)：

其中，Xi表示獨(dú)立變量的編碼值，也是實(shí)際變量的值。X0表示獨(dú)立變量中心點(diǎn)的值。ΔXi是獨(dú)立變量的差值。

設(shè)計(jì)的31組試驗(yàn)方案以隨機(jī)次序進(jìn)行，如表2所示，每組試驗(yàn)進(jìn)行3次平行操作，計(jì)算得到平均響應(yīng)值，通過程序分析，得出響應(yīng)面分析圖、擬合方程以及方差分析表，通過Design-Expert 8.0.5b軟件中的程序?qū)υ囼?yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析，經(jīng)二次回歸擬合后，求得響應(yīng)函數(shù)如公式（3）得出回歸方程：

其中，Yk代表響應(yīng)函數(shù)（GFP提取率），βk0表示截距，βki，βkii和βkij分別代表線性系數(shù)，二次系數(shù)，交叉系數(shù)。xi和xj代表獨(dú)立變量。

2　結(jié)果與討論

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1提取溫度對(duì)GFP提取率的影響

在提取時(shí)間2h，液料比35（g/g），提取次數(shù)4次的條件考察不同提取溫度對(duì)GFP提取率的影響。結(jié)果如圖1（a）所示：提取溫度從40℃升高到80℃時(shí)，GFP提取率從8.1%增加到9.2%。提取溫度持續(xù)升高到100℃時(shí)，GFP提取率依然增加，但是隨著提取溫度的升高，會(huì)對(duì)GFP化學(xué)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，工業(yè)化生產(chǎn)過程中也會(huì)增加成本。因此，最佳提取溫度范圍確定為50～90℃。

2.1.2提取時(shí)間對(duì)GFP提取率的影響

在提取溫度70℃，液料比35（g/g），提取次數(shù)4次的條件考察不同提取時(shí)間對(duì)GFP提取率的影響。結(jié)果如圖1（b）所示：隨著提取時(shí)間從0.5h增加到2h，GFP提取率明顯增加，提取時(shí)間2h時(shí)，提取率最大，為9.2%，但是超過2h后，GFP提取率下降。因此，最適宜的提取時(shí)間范圍確定為1～3h之間。

2.1.3液料比對(duì)GFP提取率的影響

在提取溫度70℃，提取時(shí)間2h，提取次數(shù)4次條件下考察不同液料比，對(duì)GFP提取率的影響。結(jié)果如圖1（c）所示：液料比從10到45（g/g），GFP提取率從6.98%增加到14.68%。因此，最佳液料比范圍確定在25～45（g/g）。

2.1.4提取次數(shù)對(duì)GFP提取率的影響

在提取溫度70℃，提取時(shí)間2h，液料比35（g/g）條件下考察提取次數(shù)對(duì)GFP提取率的影響。結(jié)果如圖1（d）所示：GFP提取率隨著提取次數(shù)的增加持續(xù)升高，從5.89%升高到13.29%。為節(jié)約成本，最佳提取次數(shù)范圍選定在2～6次。

根據(jù)上述單因素試驗(yàn)研究結(jié)果，響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)提取參數(shù)范圍如下：提取溫度50～90℃；提取時(shí)間1～3h；液料比25～45（g/g）；提取次數(shù)2～6次（見表1）。

圖1　提取溫度

2.2響應(yīng)面法優(yōu)化GFP提取工藝

2.2.1Central composite試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

與傳統(tǒng)的單因素優(yōu)化方法相比，RSM法具有節(jié)省時(shí)間、空間和原材料的優(yōu)勢(shì)［12］。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用CCD法，為GFP提取設(shè)計(jì)31組優(yōu)化方案。各組試驗(yàn)響應(yīng)值（GFP提取率，Y，%）如表2所示，GFP提取率在9.48%～14.78%之間。

2.2.2模型建立及擬合模型

CCD設(shè)計(jì)方案與響應(yīng)值結(jié)果如表2所示。利用Design-Expert 8.0.5b軟件對(duì)表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式回歸分析、F檢驗(yàn)和方差分析，結(jié)果如表3所示。

同時(shí)，對(duì)試驗(yàn)參數(shù)及結(jié)果進(jìn)行回歸擬合，得到GFP提取率與各因素變量間的多項(xiàng)式方程如下（R2=0.93）：

表2　中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與GFP響應(yīng)值

模型擬合方面，方程F值為14.91，P＜0.0001，說(shuō)明使用上述回歸方程描述提取參數(shù)與響應(yīng)值之間的關(guān)系時(shí)，能夠正確反映因變量與自變量之間的關(guān)系，模型高度顯著，證實(shí)該試驗(yàn)方法的可靠性和準(zhǔn)確性；此模型決定系數(shù)R2=0.9288，表明回歸方程擬合較好；失擬項(xiàng)P＜0.0001，說(shuō)明由噪音引起模型偏差的概率小于0.01%；模型校正決定系數(shù)Radj2=0.8665，表明本實(shí)驗(yàn)86.65%的數(shù)據(jù)變異可以用此回歸方程解釋，能夠較好地確定關(guān)鍵影響因素；離散系數(shù)（C. V.%=3.44%）表示試驗(yàn)的精確度，離散系數(shù)越低，說(shuō)明試驗(yàn)數(shù)值有較高的精度和可靠性［13］。綜上所述，該模型能夠用于表示提取參數(shù)和GFP提取率的關(guān)系，具有較高應(yīng)用價(jià)值。

表3　中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果方差分析及顯著性檢驗(yàn)

P值用于衡量回歸方程中每個(gè)系數(shù)的準(zhǔn)確性，進(jìn)而了解獨(dú)立變量之間的交互作用影響。P＜0.05表明該系數(shù)是非常有意義的［14］。由回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知，表3的線性系數(shù)（X1，X2，X3，X4）中，X2、X3、X4影響極顯著（P＜0.01），X1影響顯著（P＜0.05）；二次項(xiàng)系數(shù)（X12，X22，X32，X42）中，X12，X32影響極顯著（P＜0.01），X42影響顯著（P＜0.05）；交叉乘積系數(shù)（X1X2，X1X3，X1X4，X2X3，X2X4，X3X4）中，僅有X1X2影響顯著（P＜0.05）。綜上所述，各試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值并不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，二次項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值的影響也有很大的關(guān)系，交互作用的影響相對(duì)較小。此外，其他的顯著性差異都大于0.05，說(shuō)明影響不是很明顯。因此，X1、X2、X3、X4、X12、X32、X42和X1X2表示的參數(shù)都是GFP提取過程中重要的因素。針對(duì)4個(gè)提取參數(shù)的研究中，各因素對(duì)響應(yīng)值的影響排序?yàn)椋禾崛囟龋咎崛〈螖?shù)＞液料比＞提取時(shí)間。

2.2.3響應(yīng)面圖及等值線圖分析

RSM方法的數(shù)據(jù)圖形是根據(jù)特定的響應(yīng)值Y與各因素X1，X2，X3，X4之間構(gòu)成的二維和三維圖像，響應(yīng)圖中曲線越陡峭，則表明相對(duì)應(yīng)因素對(duì)響應(yīng)值的影響越大，響應(yīng)值變化越大。三維響應(yīng)面圖能夠直觀反映出各因素對(duì)GFP提取率的影響以及各因素之間的相互作用。響應(yīng)圖中等高線形狀也能夠直觀反映出兩因素之間交互作用大小，等高線呈現(xiàn)橢圓形體現(xiàn)兩因素交互效應(yīng)顯著，而圓形則說(shuō)明因素間交互作用較弱?；貧w方程的2D等值線圖和3D響應(yīng)面圖見圖2和圖3。2D等高線圖和3D響應(yīng)面圖整體趨勢(shì)一致。

圖2　提取時(shí)間（X1），液料比（X2），提取次數(shù)（X3）及提取溫度（X4）對(duì)GFP提取率的3D響應(yīng)面圖

為了研究可變參數(shù)之間的關(guān)系，每圖表示兩個(gè)變量，其他兩個(gè)參數(shù)保持在一定水平（0水平，參見表1）。液料比和提取時(shí)間不同的情況下，3D響應(yīng)面圖和2D等值線圖如圖2（a）和3（a）所示，結(jié)果表明：提取時(shí)間對(duì)GFP提取率影響較小，當(dāng)提取時(shí)間較短時(shí)，液料比和提取時(shí)間出現(xiàn)了交互作用，對(duì)提取率的影響較明顯；圖2（b）和3（b）表示提取時(shí)間和提取次數(shù)交互作用，當(dāng)提取次數(shù)固定在某一水平時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)GFP提取率增加，隨后呈下降趨勢(shì)；由圖2 （c）和3（c）可以看出，當(dāng)提取時(shí)間從1h增加到2.5h時(shí)，提取溫度對(duì)GFP提取率有非常積極的影響，超過2.5h以后，多糖的提取率逐漸下降；如圖2（d）和3 （d）所示，當(dāng)提取次數(shù)為5時(shí)，液料比的積極作用十分明顯，即GFP提取率隨著液料比的增加而增加，但超過5次后GFP提取率呈下降趨勢(shì)；根據(jù)圖2（e）和3（e）得知，GFP提取率隨著液料比和提取溫度的增加而升高，結(jié)果與前期單因素試驗(yàn)的結(jié)果相一致；圖2f與3f體現(xiàn)了提取溫度和提取次數(shù)對(duì)GFP提取率的交互影響，提取次數(shù)小于5時(shí)，隨著提取溫度的增加，多糖提取率明顯增加，但是超過5次時(shí)，GFP提取率開始下降。因此，GFP最高提取率是當(dāng)提取溫度和提取次數(shù)分別為80℃和5次的條件下出現(xiàn)的。

根據(jù)分析結(jié)果，回歸模型預(yù)測(cè)的GFP提取最佳工藝條件為：提取時(shí)間2.495h，液料比38.55（g/g），提取次數(shù)5次，提取溫度80℃。在此條件下，GFP提取率理論值可達(dá)13.94%。

圖3　提取時(shí)間（X1），液料比（X2），提取次數(shù)（X3）及提取溫度（X4）對(duì)GFP提取率的2D等值線圖

2.2.4提取工藝優(yōu)化及預(yù)測(cè)模型驗(yàn)證

為了驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)理論值的準(zhǔn)確性和真實(shí)性，我們根據(jù)模型預(yù)測(cè)的優(yōu)化條件進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，結(jié)果GFP提取率平均值為13.81±0.28%，與模型預(yù)測(cè)理論值13.94%相近，說(shuō)明響應(yīng)面優(yōu)化的條件是合理有效的，具有極強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值和指導(dǎo)意義。

3　結(jié)論

本研究以單因素試驗(yàn)方法作為基礎(chǔ)，確定主要影響人參花多糖提取產(chǎn)量的因素及范圍，結(jié)合CCD設(shè)計(jì)，確定最佳響應(yīng)面區(qū)域，優(yōu)化人參花中多糖提取的工藝條件，優(yōu)化參數(shù)為：提取時(shí)間2.495h，液料比38.55（g/g），提取次數(shù)5次，提取溫度80℃。上述條件下，GFP提取率為13.81±0.28%，與理論值13.94%相近，說(shuō)明該模型比較可靠。

熱水浸提法是一種從植物中提取多糖的傳統(tǒng)方法。將RSM應(yīng)用于人參花多糖的提取過程中，通過建立數(shù)據(jù)模型的方法，解決受多因素的影響的最優(yōu)組合問題，提高人參花多糖的提取率。與傳統(tǒng)的單因素試驗(yàn)相比，該方法不僅能夠節(jié)約條件摸索的時(shí)間，降低提取成本，同時(shí)能夠達(dá)到最高的提取率，是研究多因素試驗(yàn)有力的工具，該方法在人參花多糖提取中的應(yīng)用，不僅為人參花多糖的提取奠定了理論基礎(chǔ)，并為人參花多糖的實(shí)際工業(yè)提取提供理論依據(jù)。

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Optimization of Polysaccharides from Flowers of Panax Ginseng C.A.Meyer Using Response Surface Methodology

WAN Xilin1，JIAO Lili1，MA Lin1，WANG Mingzhu1，LIU Shuying1，2
（1.Jilin Ginseng Academy，Changchun University of Chinese Medicine，Changchun 130117；2.Changchun Institute of Applied Chemistry，Chinese Academy of Sciences，Changchun 130022）

In this study，response surface methodology based on central composite design（CCD）was adopted to optimize the extraction conditions of polysaccharides from the flower of Panax ginseng C.A.Meyer（GFP）.The effects of four parameters，including extraction time（h），ratio of water to raw material，number of extraction and extraction temperature（°C）were investigated by single factor experiments，yield of the polysaccharides as the response values，the experimental data were fitted to a second-order polynomial equation.The optimum extraction conditions were determined as follow：extraction time 2.495 h，ratio of water to raw material 38.55∶1（g/g），and number of extraction 5，extraction temperature 80°C.Under these conditions，the experimental yield was 13.81±0.28%，which was well matched with the predictive yield of 13.94%.The model was significant that can be used for the extraction of GFP.

panax ginseng C.A.meyer；polysaccharides；extraction；response surface methodology（RSM）

Q539

A

1672-9870（2015）06-0154-05

2015-10-21

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（02090106）；吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（20130206059YY）

萬(wàn)茜淋（1987-），女，碩士，助理實(shí)驗(yàn)師，E-mail：wanxilin1987@163.com

劉淑瑩（1943-），博士，研究員，E-mail：syliu@ciac.ac.cn