新城疫病毒檢測方法的研究進(jìn)展

楊麗麗　鄒冬輝

摘要：新城疫是由新城疫病毒（NDV）引發(fā)禽類的烈性、急性、高度接觸性疾病，禽類感染NDV后的死亡率可達(dá) 100%，國際獸疫局（OIE）將其列為動物A 類疫病。因此，對新城疫病毒進(jìn)行簡便、快速、準(zhǔn)確的檢測具有重要意義。本文從病毒分離及鑒定、免疫血清學(xué)檢測、分子生物學(xué)檢測、量子點(diǎn)技術(shù)、熒光微球檢測技術(shù)方面闡述了NDV檢測技術(shù)進(jìn)展，以期為臨床和科研工作者提供一定的參考。

關(guān)鍵詞：新城疫病毒；檢測；進(jìn)展

中圖分類號： S852.65 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A DOI編號： 10.14025/j.cnki.jlny.2015.19.049

NDV 在全球范圍內(nèi)分布廣泛，上百種禽類對 NDV 可以實(shí)驗(yàn)室感染或自然感染，同時還有大量的其他種類動物疑似被感染[1]。在1926 年新城疫首次在印度尼西亞的 Java[2]和英國的新城[3]暴發(fā)。90年代后，該病在亞洲多個國家發(fā)生，給禽類養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大損失。因此，世界各國十分重視該病的發(fā)生和流行，NDV快速而準(zhǔn)確的檢測具有重要意義。目前用于檢測NDV的技術(shù)手段種類繁多，現(xiàn)主要介紹以下幾種：

1病毒的分離鑒定

該方法診斷疫病確切，同時可定性感染的毒株。通過將病毒接種SPF雞胚的方法進(jìn)行分離，應(yīng)用血液凝集試驗(yàn)和血液凝集抑制試驗(yàn)對病毒進(jìn)行鑒定。該試驗(yàn)方法的準(zhǔn)確性和敏感性高，重復(fù)性好，特異性強(qiáng)，但其存在高成本、長時間等不足之處，所以不適合該病的快速診斷。

2血清學(xué)技術(shù)

2.1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是通過物理方法將抗原或抗體吸附在固相載體上，然后測定免疫酶。該方法是目前研究最多最廣泛的一門技術(shù)方法，其優(yōu)點(diǎn)主要是程序自動化，可快速獲取結(jié)果，花費(fèi)少。盧建紅[4] 、吳長新[5]、陳昌海[6]、吳紅專[7]、蔣鳳英[8]等建立了多種ELISA方法對新城疫病毒的檢測。研究結(jié)果顯示了該項(xiàng)技術(shù)高度的特異性和敏感性、安全、便捷、快速。

2.2 免疫熒光抗體技術(shù)

該方法是將熒光素如異硫氰酸（FITC）標(biāo)記抗體，然后用熒光顯微鏡觀察熒光以分析示蹤相應(yīng)的抗原或抗體的方法[9]。該種方法具有快速、準(zhǔn)確、簡單的特點(diǎn)。劉建宏[10]等用熒光標(biāo)記的單克隆抗體對病例雞的NDV抗原進(jìn)行檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明免疫熒光技術(shù)的準(zhǔn)確、快速。

2.3免疫膠體金電鏡技術(shù)

該方法是一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)，以膠體金為標(biāo)志物應(yīng)用到抗原抗體。標(biāo)記物制備簡便，方法特異、敏感，無放射性同位素、酶顯色底物，不需要熒光顯微鏡，其應(yīng)用前景廣泛。薛擁志[11]等應(yīng)用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒標(biāo)記NDV抗體，用直接電鏡、免疫電鏡和膠體金免疫電鏡技術(shù)比較觀察新城疫病毒。實(shí)驗(yàn)證明膠體金電鏡技術(shù)作為檢測NDV的檢測方法具有簡單、準(zhǔn)確和快速等優(yōu)點(diǎn)。

3分子生物學(xué)技術(shù)

3.1熒光定量RT-PCR 技術(shù)

熒光定量RT-PCR 技術(shù)檢測新城疫病毒的方法應(yīng)用的是 TaqMan 技術(shù)[12]，通過熒光標(biāo)記的特異性探針來標(biāo)記跟蹤PCR產(chǎn)物。其方法比常規(guī)的檢測方法用時少、周期短、靈敏、準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)、操作簡便等。屈素潔[13]等通過構(gòu)建重組陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的方法，建立檢測NDV核酸的熒光定量PCR方法，其實(shí)驗(yàn)方法實(shí)現(xiàn)了對新城疫的定量檢測。

3.2基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)是近年來基于分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展起來的一種檢測技術(shù)，該方法是將大量的探針分子固定到固相支持物上，借助核酸分子雜交配對的特性對DNA樣品的序列信息進(jìn)行高效的解讀和分析。耿捷[14]等根據(jù)新城疫病毒基因序列設(shè)計(jì)了30條寡核苷酸探針芯片，通過對NDV的檢測說明芯片的穩(wěn)定性、特異性和敏感性較好，成本低廉，方法簡單。為新城疫的檢測提供了新方法，適合新城疫病毒的快速檢測。

4量子點(diǎn)檢測技術(shù)

量子點(diǎn)是最近幾年發(fā)展起來的一種新型熒光材料，具有穩(wěn)定性、生物相容性好等特點(diǎn)，目前已成為病原檢測的新型工具。房保海[15]等應(yīng)用量子點(diǎn)建立了檢測新城疫病毒的新方法，以生物素標(biāo)記的抗NDV單克隆抗體為檢測抗體，NDV的多克隆抗體為捕捉抗體，量子點(diǎn)標(biāo)記的鏈霉親和素為熒光探針。試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法與其他禽類疫病無交叉反應(yīng)，試驗(yàn)靈敏，為臨床早期快速檢測NDV提供了新手段。

5免疫熒光微球技術(shù)

熒光微球是指直徑在納米至微米級范圍內(nèi)，負(fù)載有熒光物質(zhì)，受外界能量刺激時能激發(fā)出熒光的一種固體顆粒[16]。將熒光微球與流式細(xì)胞術(shù)相結(jié)合，形成一種新型的分析檢測系統(tǒng)。應(yīng)用一種激光光源激發(fā)出三種不同的波長，當(dāng)三種波長同時被檢測出來時，就可確定其中一種相應(yīng)的被檢測物質(zhì)的存在。其優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高、特異性強(qiáng)、分析速度快，僅微量樣品就可進(jìn)行多組分同時分析[17]。筆者應(yīng)用熒光微球技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對新城疫病毒和禽流感病毒的快速檢測[18-19]。該方法的特異性、敏感性和重復(fù)性較好。

近年來，隨著新城疫疫情的發(fā)生發(fā)展，更加便捷、快速、高通量的檢測方法一定會被研制出來，為動物疫情的控制與消滅提供強(qiáng)大的科學(xué)技術(shù)手段。

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作者簡介：楊麗麗，碩士，吉林工程技術(shù)師范學(xué)院食品工程學(xué)院，講師，研究方向：食品微生物檢測。