動(dòng)態(tài)高壓微射流制備β-乳球蛋白納米乳液

蘇佳琪，何曉葉，高彥祥，袁　芳*

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，教育部功能乳品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100083）

動(dòng)態(tài)高壓微射流制備β-乳球蛋白納米乳液

蘇佳琪，何曉葉，高彥祥，袁芳*

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，教育部功能乳品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100083）

該實(shí)驗(yàn)以β-乳球蛋白為原料，利用動(dòng)態(tài)高壓技術(shù)制備β-乳球蛋白納米乳液。以乳液粒度及其分布、電位為評價(jià)指標(biāo)，確定最佳工藝條件（蛋白濃度、均質(zhì)壓力、均質(zhì)次數(shù)），并研究pH、溫度、離子強(qiáng)度、防腐劑等環(huán)境因素對乳液體系穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明：β-乳球蛋白質(zhì)量濃度1.0 g/100 mL、120 MPa高壓微射流均質(zhì)3次為乳液制備的最適條件；乳液的粒徑普遍在200 nm左右，且粒徑分布較為集中，說明通過該法制備的乳液的均一性較高；該乳液對弱酸性及堿性、鹽離子濃度、熱及防腐劑均有較好的穩(wěn)定性，表明β-乳球蛋白乳液具有較高的研究應(yīng)用價(jià)值。

β-乳球蛋白；動(dòng)態(tài)超高壓微射流；納米乳液；乳液穩(wěn)定性

β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-Lg）是由?；蚱渌溉閯?dòng)物的乳腺上皮細(xì)胞合成分泌的一種特殊的乳清蛋白，約占乳清蛋白總含量的50%［1］。天然的β-乳球蛋白是一種由162個(gè)氨基酸殘基組成、分子質(zhì)量約為18.4 ku的球形蛋白［2］，由9條反平行的β-折疊和一條α-螺旋組成［3］，具有相對較大的、有序的二級結(jié)構(gòu)和緊密的三級結(jié)構(gòu)。獨(dú)特的空間結(jié)構(gòu)賦予其特殊的理化特性，其等電點(diǎn)近似于5［4］。在中性的環(huán)境條件中，β-乳球蛋白帶負(fù)電荷，并且能夠通過非共價(jià)相互作用相結(jié)合以二聚體形式存在。β-乳球蛋白具有表面活性，能夠吸附在油-水界面形成單一界面層（厚度約為3 nm）［5］，賦予乳液良好的穩(wěn)定性。然而，β-乳球蛋白易受熱處理、堿性條件、高壓處理或金屬離子的影響而發(fā)生變性，其在食品工業(yè)中的應(yīng)用受到嚴(yán)格限制［6］。

動(dòng)態(tài)高壓微射流均質(zhì)技術(shù)（dynamic high-pressure microfluidization，DHPM）是一種新興的物理改性技術(shù)。集輸送、混合、濕法粉碎、均質(zhì)等多單元操作于一體［7］，其原理是利用高速剪切、高頻振動(dòng)、對流撞擊、瞬時(shí)壓力下降、空穴作用、短時(shí)超高壓處理和連續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)的結(jié)合作用實(shí)現(xiàn)納米乳液的制備［8］。與傳統(tǒng)的高壓均質(zhì)方式相比，微射流均質(zhì)能夠使蛋白的結(jié)構(gòu)和功能特性明顯變化，有效改善乳液的界面吸附特性，從而提高乳液的穩(wěn)定性。

蛋白乳狀液可用于封裝、保護(hù)、傳送和釋放食品功能因子，且是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)［9］。本實(shí)驗(yàn)以β-乳球蛋白為研究對象，利用動(dòng)態(tài)高壓微射流技術(shù)探究乳液制備過程中的工藝條件以及pH值、溫度、鹽離子濃度、防腐劑等因素對乳狀液體系穩(wěn)定性的影響，為β-乳球蛋白在乳狀液中的研究與應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

β-乳球蛋白（純度＞95%）：美國DACISCO有限公司；芥花籽油：加拿大Harwell公司；苯甲酸鈉（食用級）：北京華揚(yáng)致成科技有限公司；氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈉、磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉等試劑均為分析純：北京化工廠。

1.2儀器與設(shè)備

Ultra-turraxT25高速乳化剪切儀：德國IKA公司；M-110EH高壓微射流納米均質(zhì)機(jī)：美國Microfluidics公司；Zetasizer Nano-ZS90激光粒度儀：英國Malvern公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1β-乳球蛋白溶液制備

將β-乳球蛋白（β-Lg）以一定比例溶解于磷酸鹽緩沖液中，置于磁力攪拌器上攪拌4h，溶脹過夜，于4℃冰箱中儲(chǔ)存。

1.3.2β-乳球蛋白粗乳液制備

在高速乳化剪切儀的攪拌下將芥花籽油緩慢加入到上述溶液中，10 000 r/min剪切6 min，形成粗乳液。

1.3.3β-乳球蛋白納米乳液制備

將以上制備的粗乳液樣品通過動(dòng)態(tài)高壓微射流納米均質(zhì)機(jī)在不同均質(zhì)條件下進(jìn)一步處理，得到納米乳液。

1.3.4β-乳球蛋白納米乳液粒徑分析

將納米乳液用蒸餾水稀釋500倍，利用Zetasizer Nano-ZS90激光粒度儀在室溫條件下對乳液的粒徑大小及其分布狀況進(jìn)行分析，經(jīng)過120 s的平衡時(shí)間后采集測量數(shù)據(jù)，每個(gè)樣品進(jìn)行3次平行測量，最終結(jié)果以平均粒徑（nm）和多分散系數(shù)（polydispersity index，PdI）表示。

1.3.5統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為3次平行測定的平均值。采用SPSS16.0軟件的One-Way ANOVA對數(shù)據(jù)在α=0.05水平下進(jìn)行顯著性分析。

2　結(jié)果與分析

乳化過程分為兩個(gè)步驟：（1）液滴的變性和破壞，使乳液液滴的比表面積增加；（2）通過乳化劑防止液滴的重新聚集，穩(wěn)定新界面。換而言之，最終的平均粒徑取決于液滴的破壞和再聚集行為［10］。利用動(dòng)態(tài)高壓微射流制備的乳液是一種非熱力學(xué)穩(wěn)定性體系，因此乳液液滴的尺寸在評價(jià)乳液的穩(wěn)定性、外觀、質(zhì)地、流變性和貨架期等特性方面意義重大［11］。平均粒徑能夠表征乳液液滴粒度大小的平均水平，多分散系數(shù)（PdI）則體現(xiàn)了乳液液滴粒徑的集中分布程度，PdI越小，表明粒徑分布越集中。

2.1不同蛋白質(zhì)量濃度對納米乳液粒徑的影響

制備不同質(zhì)量濃度β-乳球蛋白乳液，通過液滴平均粒徑的變化確定β-乳球蛋白作用的最適質(zhì)量濃度，試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，隨著乳液中β-乳球蛋白質(zhì)量濃度的增加（0.5～3.0 g/100 mL），乳液液滴的平均粒徑先降低后緩慢升高。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)量濃度為0.5 g/100 mL時(shí)，乳液液滴的平均粒徑最大，分析認(rèn)為此時(shí)乳液中的蛋白質(zhì)量濃度過低，即使全部吸附在油-水界面仍未能達(dá)到飽和，溶液中的小液滴因而發(fā)生聚合現(xiàn)象，形成粒徑較大的液滴。當(dāng)質(zhì)量濃度為1.0 g/100 mL時(shí)，液滴平均粒徑與多分散系數(shù)（PdI）同時(shí)達(dá)到最小值，表明在此條件下蛋白在液滴表面形成緊密的界面膜［12］，乳液液滴粒徑相對較?。s為200nm）且其分布較為集中，此時(shí)乳液處于相對均一、穩(wěn)定的狀態(tài)。當(dāng)質(zhì)量濃度從1.0 g/100 mL增加到3.0 g/100 mL時(shí)，液滴的平均粒徑具有緩慢上升的趨勢。說明隨著蛋白分子的不斷吸附，液滴間相對平衡的狀態(tài)被破壞，在此條件下，平均粒徑主要受均質(zhì)條件而非乳化劑性能的影響［13］，吸附在不同液滴上的蛋白分子的結(jié)合可能造成液滴之間的聚合從而導(dǎo)致總體系中平均粒徑的增大。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇質(zhì)量濃度為1.0 g/100 mL的β-乳球蛋白乳液進(jìn)行后續(xù)研究。

圖1　不同β-乳球蛋白質(zhì)量濃度對納米乳液粒徑及多分散系數(shù)PdI的影響Fig.1 Effect of β-lactoglobulin concentration on the particle size and polydispersity PdI of nano-emulsion

2.2不同均質(zhì)次數(shù)對納米乳液粒徑的影響

為了最大程度排除均質(zhì)壓力的影響，針對不同均質(zhì)次數(shù)對乳液影響的研究中選取了3個(gè)不同的壓力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。結(jié)果表明：當(dāng)壓力分別為60 MPa、100 MPa、140 MPa時(shí)，隨著均質(zhì)次數(shù)的增加，乳液平均粒徑均呈現(xiàn)先下降后上升的現(xiàn)象，平均粒徑最小值均出現(xiàn)于第3次均質(zhì)的過程中。而經(jīng)過3次均質(zhì)過程產(chǎn)生的乳液具有較低的PdI，表明經(jīng)此條件制備的乳液穩(wěn)定性最好。因此確定3次為乳液均質(zhì)的最佳次數(shù)。當(dāng)均質(zhì)進(jìn)行至第4次時(shí)，乳液的粒徑及相應(yīng)PdI略有增加，推測可能由于均質(zhì)過程中提供大量能量導(dǎo)致新液滴的快速重聚集，即“過處理現(xiàn)象”［14］。高頻的聚集現(xiàn)象和極高的能量密度是產(chǎn)生“過處理現(xiàn)象”發(fā)生的主要原因之一［15-16］。因此，在本實(shí)驗(yàn)的后續(xù)研究中，對β-乳球蛋白乳液進(jìn)行3次高壓微射流均質(zhì)處理。

圖2　不同均質(zhì)次數(shù)對納米乳液粒徑（A）及多分散系數(shù)PdI（B）的影響Fig.2 Effect of homogenization cycles on the particle size（A）and polydispersity PdI（B）of nano-emulsion

2.3不同均質(zhì)壓力對納米乳液粒徑的影響

調(diào)節(jié)乳狀液的均質(zhì)壓力分別為40 MPa、60 MPa、80 MPa、100 MPa、120 MPa、140 MPa，不同均質(zhì)壓力對納米乳液粒徑的影響見圖3。

圖3　不同均質(zhì)壓力對納米乳液粒徑及多分散系數(shù)PdI的影響Fig.3 Effect of homogenization pressure on the particle size and polydispersity PdI of nano-emulsion

由圖3可以看出，隨著均質(zhì)壓力的升高，平均粒徑依次降低且逐漸趨于穩(wěn)定。該現(xiàn)象表明一定范圍內(nèi)提高均質(zhì)壓力能夠有效提高均質(zhì)效率。當(dāng)均質(zhì)壓力較小時(shí)，乳液雖然經(jīng)過均質(zhì)處理，但對油滴的破碎并不完全，因此無法達(dá)到較為理想的均質(zhì)狀態(tài)；經(jīng)過120 MPa均質(zhì)處理后的乳液液滴平均粒徑達(dá)到最小值，說明在此壓力下，均質(zhì)效果達(dá)到最佳；當(dāng)壓力值超出該范圍時(shí)繼續(xù)提高壓力，不考慮乳化劑的添加量即β-乳球蛋白的濃度或其在均質(zhì)室內(nèi)乳化特性變化時(shí)［17］，能夠觀察粒徑的持續(xù)降低現(xiàn)象，徑降低速度變緩，且維持在一個(gè)相對平衡的數(shù)值區(qū)域間（200～202 nm）。這與CHENG Q等［18］的研究結(jié)果一致：隨著處理壓力的增加，β-乳球蛋白的粒徑逐漸減小最終趨于平衡，這種現(xiàn)象可以歸因于均質(zhì)室內(nèi)對乳液液滴破壞性力量的增加。因此，本實(shí)驗(yàn)選取120 MPa作為均質(zhì)壓力條件進(jìn)行后續(xù)研究中乳液的制備。

2.4不同pH環(huán)境對納米乳液粒徑的影響

存在于不同食品中的功能因子在加工過程中往往需要經(jīng)歷不同的pH條件，人體胃腸道環(huán)境對功能因子的生物轉(zhuǎn)化率和吸收率也具有深遠(yuǎn)的影響。因此，乳液穩(wěn)定存在pH范圍的確定意義重大。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定β-乳球蛋白乳液的最佳制備工藝為：蛋白質(zhì)量濃度1.0 g/100 mL，120 MPa下均質(zhì)3次。將制備好的乳狀液樣品分別調(diào)節(jié)pH至3、5、7、9、11，樣品在室溫條件下靜置過夜，利用激光粒度儀對乳液的粒徑及其多分散系數(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果如圖4所示。

圖4　不同pH環(huán)境對納米乳液粒徑及多分散系數(shù)PdI的影響Fig.4 Effect of pH conditions on the particle size and polydispersity PdI of nano-emulsion

由圖4可知，乳液粒徑在pH 5即β-乳球蛋白等電點(diǎn)時(shí)達(dá)到最大值，分析原因?yàn)樵诘入婞c(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)以兩性離子的形式存在，溶液中的總凈電荷為0，此時(shí)液滴間的電荷排斥作用達(dá)到最小，易發(fā)生聚集現(xiàn)象而形成較大的聚合體，因而平均粒徑達(dá)到最大值。液滴的多分散系數(shù)（PdI）也可佐證。PdI值為0.876，表明乳液中液滴粒徑分布極不均勻，大小不一，有的多個(gè)小液滴通過結(jié)合形成大液滴，有的仍以小液滴的形式存在，因此，在酸性食品體系中該乳液的穩(wěn)定性較差。隨著環(huán)境pH的升高（7～11），乳液液滴的平均粒徑重新維持在200～210nm之間，且具有較低的PdI值，表明堿性條件對于高壓微射流制備的乳液幾乎沒有破壞能力。而隨著環(huán)境pH不斷擴(kuò)大（3～11），Zeta-電位也可以提供乳液界面的組成信息［19］。對不同pH乳液的Zeta-電位進(jìn)行分析，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，發(fā)現(xiàn)乳液液滴帶有負(fù)電荷，且電位保持緩慢降低，然而并未觀察到沉淀或乳析現(xiàn)象，由此可見，通過本法制備的乳液在堿性條件下具有較高的熱力學(xué)穩(wěn)定性。

圖5　不同pH環(huán)境對納米乳液Zeta-電位的影響Fig.5 Effect of pH conditions on the Zeta-potential of nano-emulsion

2.5不同離子強(qiáng)度對納米乳液粒徑的影響

功能因子可能存在于具有不同鹽離子濃度的食品體系中。將制備好的乳液樣品分別調(diào)節(jié)體系離子強(qiáng)度至0.1 mol/L、0.15 mol/L、0.2 mol/L，室溫下靜置12 h。測定其粒徑及PdI，結(jié)果如圖6所示。

圖6　不同離子強(qiáng)度對納米乳液粒徑及多分散系數(shù)PdI的影響Fig.6 Effect of ionic strength on the particle size and polydispersity PdI of nano-emulsion

通常情況下，體系中的高離子強(qiáng)度會(huì)破壞蛋白質(zhì)周圍的雙電層，導(dǎo)致蛋白質(zhì)劇烈聚集，平均粒徑明顯升高［20］。由圖6可知，由β-乳球蛋白制備的乳狀液在一定離子強(qiáng)度范圍內(nèi)，隨著離子強(qiáng)度的升高，粒徑及PdI基本保持不變。說明該乳液能夠在一個(gè)較為廣闊的鹽離子濃度范圍內(nèi)保持相對穩(wěn)定性。因此，該乳液能夠適用于不同離子強(qiáng)度的食品體系。

2.6不同溫度及防腐劑濃度對納米乳液粒徑的影響

將制備好的乳液樣品分別恒溫存放于20℃、40℃、60℃的條件下保持2 h，自然冷卻至室溫，靜止12 h后測量其粒徑及PdI的變化，結(jié)果如圖7所示。

由圖7可知，隨著處理溫度的升高，乳液的粒徑及PdI均無明顯變化，表明β-乳球蛋白乳液的熱穩(wěn)定性較好，能夠耐受一定程度高溫的加工貯藏過程。

圖7　不同貯存溫度對納米乳液粒徑及多分散系數(shù)PdI的影響Fig.7 Effect of storage temperature on the particle size and polydispersity PdI of nano-emulsion

向制備好的乳液中添加不同濃度（0.01 mol/L和0.1 mol/L）的苯甲酸鈉，室溫存放12 h，通過激光粒度儀探究不同濃度的防腐劑的存在對于β-乳球蛋白體系穩(wěn)定性的影響，結(jié)果如圖8所示。

圖8　不同防腐劑濃度對納米乳液粒徑及多分散系數(shù)PdI的影響Fig.8 Effect of antiseptic concentration on the particle size and polydispersity PdI of nano-emulsion

由圖8可知，苯甲酸鈉的添加對β-乳球蛋白乳液的粒徑及PdI幾乎無影響。由此得出，該乳液對防腐劑的穩(wěn)定性較好。

3　結(jié)論

采用動(dòng)態(tài)高壓微射流方法制備β-乳球蛋白乳液，通過研究其粒徑及多分散系數(shù)（PdI）變化，確定β-乳球蛋白乳液的最佳制備工藝為：蛋白質(zhì)量濃度1.0 g/100 mL；120 MPa下均質(zhì)3次。乳液的粒徑普遍處于在200 nm左右，且粒徑分布較為集中，說明通過該法制備的乳液的具有較高的均一性；該乳液對弱酸性及堿性、鹽離子濃度、熱及防腐劑均有較好的穩(wěn)定性，能夠滿足食品介質(zhì)特性多樣化的需求。本實(shí)驗(yàn)為β-乳球蛋白在乳狀液中的研究與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)；為實(shí)現(xiàn)功能因子穩(wěn)態(tài)化及控制釋放提供思路；為推動(dòng)天然食品乳化劑的發(fā)展貢獻(xiàn)力量。

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Fabrication of β-lactoglobulin nanoemulsions by dynamic high-pressure microfluidization

SU Jiaqi，HE Xiaoye，GAO Yanxiang，YUAN Fang*
（College of Food Science&Nutritional Engineering，Key Laboratory of Functional Dairy，China Agricultural University，Beijing 100083，China）

Using β-lactoglobulin as material，nano-emulsion was prepared through dynamic high-pressure mucrofludization.Choosing emulsion particle size and its distribution，as well as zeta-potential as evaluation indexes，the optimal technological conditions（protein concentration，pressure and homogenization times）were determined，and the effect of pH，temperature，ionic strength and antiseptic on emulsion stability was studied.Results revealed that 1.0 g/100 ml of β-lactoglobulin，homogenized three times under the pressure of 120 MPa were the optimum conditions for emulsion formation.The particle sizes of emulsion were around 200 nm，and the distribution was relatively concentrated，which illuminated that emulsion formatted by this method had higher homogeneity.Besides，emulsion formatted by this process was provided with a good stability.The emulsion also showed good stability under weak acidity and alkalinity，high or low ionic strength，through heating，or adding antiseptic，which indicated that the β-lactoglobulin emulsion had high research and application value.

β-lactoglobulin；dynamic high-pressure microfluidization；nano-emulsions；emulsion stability

TS201.7

A

0254-5071（2015）10-0098-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.10.022

2015-09-21

國家自然科學(xué)基金（31371836）

蘇佳琪（1993-），女，本科生，研究方向?yàn)槭称诽砑觿?/p>

袁芳（1967-），女，副教授，博士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物與功能食品。