鐵礦區(qū)水環(huán)境樣品對秀麗隱桿線蟲的毒性研究

郭肖穎，王磊，王斌，趙竑緋，徐文靜，李敏，李虹穎，施六林,*

1. 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)工程研究所，合肥 230031 2. 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤與肥料研究所，合肥 230031

鐵礦區(qū)水環(huán)境樣品對秀麗隱桿線蟲的毒性研究

郭肖穎1，王磊1，王斌1，趙竑緋1，徐文靜1，李敏2，李虹穎2，施六林1,*

1. 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)工程研究所，合肥 230031 2. 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤與肥料研究所，合肥 230031

礦區(qū)環(huán)境問題是近年來各研究領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)。為探究礦區(qū)水環(huán)境潛在的生物安全性問題，以安徽省霍邱縣大型鐵礦區(qū)地表水體為研究對象，以秀麗隱桿線蟲作為實(shí)驗(yàn)動物模型，并以其生長和生殖發(fā)育作為生物檢測終點(diǎn)，考察了線蟲對該礦區(qū)周邊5個地表水樣品的毒性效應(yīng)的響應(yīng)。結(jié)果表明，礦區(qū)水環(huán)境樣品對線蟲的生長和生殖發(fā)育具有明顯的損傷效應(yīng)，且這種損傷效應(yīng)的大小與水樣采集點(diǎn)距離采礦區(qū)的遠(yuǎn)近以及水樣中主要污染物的含量密切相關(guān)。進(jìn)一步通過主成分分析發(fā)現(xiàn)，總鐵、可溶性鐵、銅、鉻和砷是環(huán)境水樣造成線蟲毒性效應(yīng)的主要影響因子。上述研究結(jié)果為鐵礦區(qū)水環(huán)境生物安全性的監(jiān)測和評價提供了一種新的技術(shù)方法和新的視角，并為鐵礦區(qū)健康風(fēng)險規(guī)避提供新的思路和理論基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

礦區(qū)水環(huán)境；秀麗隱桿線蟲；生長抑制；凋亡；孵化率；存活率

近年來，由于采礦引發(fā)的惡性事件屢屢發(fā)生，尤其是金屬礦的開采，致使礦區(qū)自然資源遭到破壞，水環(huán)境質(zhì)量日益惡化，逐漸喪失工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生活用水的功能[1-2]。金屬礦區(qū)污染物包含鉛、鋅、銅、鎘和砷等伴生的重金屬及類金屬，大量的動物、植物和微生物實(shí)驗(yàn)研究表明，鉛、鋅、銅、鎘和砷等重金屬及類金屬暴露可引起染色體畸變和細(xì)胞突變，引發(fā)癌癥等相關(guān)疾病的發(fā)生[3-5]。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，礦區(qū)周邊居民癌癥多發(fā)，其原因與當(dāng)?shù)厮w重金屬污染密切相關(guān)，而污染源主要來自金屬礦開采產(chǎn)生的廢水[6]。

科研人員應(yīng)用物理、化學(xué)、生物的方法從不同的角度對金屬礦區(qū)生態(tài)環(huán)境的安全性問題進(jìn)行了研究探索。目前，有關(guān)物理、化學(xué)評價方法的研究多集中于對金屬礦區(qū)生態(tài)環(huán)境質(zhì)量的監(jiān)測，包括對礦區(qū)大氣、土壤、水體等環(huán)境介質(zhì)中營養(yǎng)元素含量、pH值、重金屬種類和含量等理化指標(biāo)的測定，從而評價礦區(qū)生態(tài)環(huán)境受污染的程度[6]。還有部分學(xué)者通過檢測礦區(qū)農(nóng)作物、蔬菜、水生動植物等生物體內(nèi)主要污染物的種類、含量、轉(zhuǎn)化等相關(guān)指標(biāo)指示礦區(qū)自然資源的安全性[7-8]。但由于礦區(qū)環(huán)境介質(zhì)中有害因子種類繁多，且不同有害因子具有多種形態(tài)和價態(tài)，可能存在著復(fù)雜的相互作用關(guān)系，因此，理化方法的定性、定量分析并不能有效、準(zhǔn)確地反應(yīng)礦區(qū)生態(tài)環(huán)境潛在的生物安全風(fēng)險，這也是物理、化學(xué)評價方法的不足之處。

進(jìn)而，研究人員探索了金屬礦區(qū)生態(tài)環(huán)境安全性的生物評價方法。部分學(xué)者通過分析生活于礦區(qū)土壤、水體等自然資源中微生物菌落種類、數(shù)量、優(yōu)勢種群等生物量的變化，解析礦區(qū)生態(tài)環(huán)境重金屬污染程度和水體富營養(yǎng)化狀況，從而實(shí)現(xiàn)礦區(qū)生態(tài)環(huán)境生物安全性的評價[5,9]。另有部分學(xué)者應(yīng)用礦區(qū)生態(tài)環(huán)境中存活的各種水、陸生動物，研究其生活、生長變化規(guī)律與礦區(qū)生態(tài)環(huán)境質(zhì)量變化的相關(guān)性，預(yù)測和評價礦區(qū)生態(tài)環(huán)境的安全性，解析礦區(qū)生態(tài)環(huán)境污染程度和演變規(guī)律[3,10]。但由于各個金屬礦區(qū)所處的地理位置、氣候條件等的不同，生活于其中的微生物、動植物種類亦不相同，機(jī)體的生物量差異較大，因而，當(dāng)前礦區(qū)生態(tài)環(huán)境安全性評價的生物方法普遍適用性較差，且定量困難。因此，尋找相對穩(wěn)定的動物模型，快速、準(zhǔn)確地預(yù)測、評價金屬礦區(qū)生態(tài)環(huán)境的生物安全性顯得非常重要。

Caenorhabditis elegans，簡稱C. elegans，中文名秀麗隱桿線蟲，屬于線形動物門、線蟲綱動物，被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、環(huán)境毒理、環(huán)境評價等各個領(lǐng)域并取得了重大突破。秀麗隱桿線蟲、果蠅、斑馬魚、小鼠是世界范圍內(nèi)公認(rèn)的模式動物，并且線蟲具有其他幾種模式動物無法比擬的優(yōu)勢[11]。線蟲在不同地理位置、不同氣候條件的環(huán)境介質(zhì)中均大量存在，因而，應(yīng)用線蟲作為模式生物得到的研究結(jié)果具有廣泛的適用性[11]。線蟲個體微小、結(jié)構(gòu)簡單、發(fā)育階段明確，其生長、生殖發(fā)育對環(huán)境有害因子的各種損傷效應(yīng)均有敏感響應(yīng)；線蟲全身透明，外界環(huán)境產(chǎn)生的損傷效應(yīng)易于在活體狀態(tài)下檢測；線蟲易于培養(yǎng)，成本低；線蟲生命周期短，利于實(shí)現(xiàn)礦區(qū)生態(tài)環(huán)境生物安全性在活體水平的快速檢測?；诖?，本文以秀麗隱桿線蟲作為實(shí)驗(yàn)動物模型，以安徽省霍邱縣周油坊鐵礦開采區(qū)為研究對象，在活體水平探索了礦區(qū)水環(huán)境生物安全性的快速評價方法，以期為礦區(qū)生態(tài)環(huán)境質(zhì)量評價提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并為礦區(qū)居民的生產(chǎn)、生活提供安全風(fēng)險的預(yù)測、預(yù)警。

1　材料與方法(Materials and methods)

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1研究對象概況及水樣采集

霍邱鐵礦位于安徽省霍邱縣西部，鐵礦儲量位居全國第五、華東第一。周油坊是其中主要的鐵礦開采區(qū)，占地121公頃，已探明的鐵礦儲量在3億t以上。

實(shí)驗(yàn)以安徽省霍邱縣周油坊鐵礦開采點(diǎn)的選礦水及其方圓2 km的地表水和飲用水為研究對象，按照距采礦點(diǎn)的距離差異分別采集5個水樣。采集的5個水樣分別為：水樣1—取自距離礦區(qū)約2 000 m的水生蔬菜種植塘，水樣2—取自距離礦區(qū)約1 000 m的魚蝦養(yǎng)殖塘，水樣3—取自距離礦區(qū)約1 500 m的農(nóng)田溝渠，水樣4—取自礦區(qū)的選礦水，水樣5—取自距離礦區(qū)約500 m的農(nóng)田溝渠。水樣采集示意圖如圖1所示。

圖1　水樣采集示意圖注：水樣4所在的深色區(qū)域?yàn)殍F礦開采廠區(qū)。Fig. 1　The schematic map of water sampling sites in Zhou Youfang Iron OreNote: Mining area is the dark area around water sample 4.

1.1.2線蟲品系

實(shí)驗(yàn)所用秀麗隱桿線蟲品系為N2 Bristol野生型，該品系由美國國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health, NIH)資助的國際線蟲種質(zhì)中心(CGC)贈送。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1水樣的滅菌處理

將兩片0.22 μm的微孔濾膜放置于對應(yīng)尺寸的濾器中間，組裝好的濾器在121 ℃條件下滅菌處理20 min，再應(yīng)用滅菌后的濾器在無菌操作臺內(nèi)對環(huán)境水樣進(jìn)行過濾處理，過濾后檢查濾膜的完整情況，如破損需重新過濾。

1.2.2線蟲培養(yǎng)

將妊娠期線蟲進(jìn)行同步化處理，24 h后觀察線蟲的卵，當(dāng)95%以上的卵發(fā)育至L1期幼蟲時，將其接入鋪有NGM培養(yǎng)基的平皿中，以E. coli OP50作為線蟲的食物，于20 ℃恒溫條件下將線蟲培養(yǎng)至所需的時期[11]。

1.2.3環(huán)境水樣的線蟲暴露過程

將同步化的線蟲分別暴露于已滅菌處理的水樣中，處理一定的時間后取出進(jìn)行進(jìn)一步分析。線蟲的水樣處理程序參照Williams等的方法[12]，吸取1.0 mL已滅菌的環(huán)境水樣于Costar 12孔組織培養(yǎng)板內(nèi)，以純水為對照(control)，添加2%的E. coli OP50濃縮菌作為線蟲的食物，每孔分別培養(yǎng)100～200條同步化的線蟲，所有處理溫度均為20 ℃。在進(jìn)行礦區(qū)水樣作用于線蟲生長發(fā)育的毒性檢測時，將同步化的L1期幼蟲接種于Costar 12孔板內(nèi)，培養(yǎng)一定時間后進(jìn)行線蟲體長和發(fā)育時間的分析；而在進(jìn)行礦區(qū)水樣作用于線蟲生殖發(fā)育毒性檢測時，將同步化的L4期或早期成蟲接種于Costar 12孔板內(nèi)，培養(yǎng)一定的時候后進(jìn)行生殖細(xì)胞凋亡和后代孵化率及成活率的測定。

1.2.4線蟲體長的測定[13]

2%凝膠片的制備：以M9緩沖液做溶劑配制2%的凝膠混合液，用微波爐加熱使瓊脂粉末溶解，然后如圖2所示的方法制取凝膠片。在載玻片1上垂直放置載玻片2和3，載玻片2和3要保持平行，中間的距離以試驗(yàn)要求而定，約為1～2 cm，然后在載玻片2和3中間的載玻片1上滴加20～30 μL的凝膠溶液，快速將載玻片4放置于載玻片2和3上，將凝膠溶液壓成片，待凝膠溶液凝固后(大約1～2 min)，輕輕取下載波片2、3和4，這樣就可在載玻片1上形成所需的凝膠片。

圖2　凝膠片制備的簡單示意圖Fig. 2　The schematic of the preparation of 2% gel pad

圖像采集：在凝膠片上滴加約10 μL的麻醉液(20 mmol·L-1疊氮鈉，M9做溶劑)，移30條左右的線蟲于麻醉液中，蓋上蓋玻片。滴加的麻醉液不能太多，否則易造成蓋玻片滑動，致使蟲體破裂。在顯微鏡下對蟲子進(jìn)行逐一拍照，所有處理必需保持相同的放大倍數(shù)。

線蟲體長的測定：用Image J軟件逐一測定照片中每條蟲子的體長。

1.2.5線蟲生長周期的觀測[13]

以線蟲生殖腺的發(fā)育形態(tài)作為判定標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)線蟲發(fā)育至L4期，其生殖腺形成2個對稱的U形臂(圖3)。將約100條同步化的L1期幼蟲分別暴露于水樣1～5，以純水為對照(control)，DIC顯微鏡下觀察線蟲生殖腺形狀，統(tǒng)計不同處理90%以上的蟲子發(fā)育至L4期所需的時間。

圖3　雌雄同體的秀麗隱桿線蟲處于L4期/早期成蟲時的生殖腺(DIC顯微鏡觀察)Fig. 3　The gonad development of L4 larvae/young adult in C. elegans (observed under DIC microscope)

1.2.6產(chǎn)卵量和F1代孵化率的檢測[14]

分別吸取50 μL水樣于Costar 96孔組織培養(yǎng)板內(nèi)，以純水為對照(control)，添加2%的E. coli OP50濃縮菌作為線蟲的食物，每孔培養(yǎng)1條同步化的L4期幼蟲，每個處理分別培養(yǎng)20條蟲子，封口膜封口，再將Costar 96孔組織培養(yǎng)板置于20 ℃恒溫?fù)u床150 r·min-1培養(yǎng)。線蟲開始產(chǎn)卵后，每天轉(zhuǎn)板一次，直至不再產(chǎn)卵為止，顯微鏡下統(tǒng)計每條線蟲的產(chǎn)卵個數(shù)，并觀察卵的孵化情況，計算卵的孵化率。孵化率=孵化成小蟲子的卵的數(shù)量/總卵量×100%。孵化出的小蟲子為F1代，繼續(xù)觀察并統(tǒng)計48 h內(nèi)F1代蟲子的存活率。F1代存活率=F1小蟲子的死亡量/F1小蟲子總量×100%。

1.2.7細(xì)胞凋亡檢測

細(xì)胞凋亡的測定依據(jù)Kelly等[15]的方法并略有修改，將處理后的線蟲置于Costar 24孔板內(nèi)，培養(yǎng)板事先已加入500 μL含1%濃縮OP50菌液的M9溶液，以25 μg·mL-1的吖啶橙避光染色1～1.5 h，然后將線蟲轉(zhuǎn)移至3.5 cm NGM上恢復(fù)30～45 min；挑取至少20條線蟲于已滴加30 μL 20 mmol·L-1的疊氮鈉溶液的載玻片中，熒光顯微鏡觀察。凋亡的細(xì)胞呈亮綠色或橙黃色(如圖4所示，紅色箭頭所指細(xì)胞)，這是DNA片斷化的一個重要標(biāo)志，而未凋亡的細(xì)胞呈現(xiàn)均勻的淺綠色[16]。

1.2.8水樣營養(yǎng)元素和重金屬元素含量的測定

氮元素：HJ 636—2012《水質(zhì) 總氮的測定 堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度計法》(北京普析TU-1810分光光度計)；磷元素：鉬酸銨分光光度法GB11893—89(北京普析TU-1810分光光度計)；鉀元素、總鐵、可溶性鐵：GB 7475—87 ICP(美國熱電IRIS)按照該儀器標(biāo)準(zhǔn)推薦條件方法測定；銅：GB 7475-87 ICP(美國熱電IRIS)；鉛、鎘和鉻：GB7475—87原子吸收分光度計-石墨爐(北京普析通用TAS-990原子分光光度計)和GB 7475-87 ICP(美國熱電IRIS)；鋅：GB7475-87 ICP(美國熱電IRIS)；汞和砷：原子熒光(普析通用PF6原子熒光光度)，按照該儀器標(biāo)準(zhǔn)推薦條件方法測定。

圖4　水環(huán)境樣品誘導(dǎo)線蟲的生殖細(xì)胞凋亡注：紅色箭頭所指細(xì)胞為AO陽性細(xì)胞，即凋亡的細(xì)胞。Fig. 4　Mining waters-induced germ cell apoptosis in C. elegansNote: Apoptotic cells were indicated with red arrows.

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

鐵礦區(qū)水環(huán)境樣品誘導(dǎo)線蟲的毒性研究數(shù)據(jù)均應(yīng)用Orign8.0軟件分析，以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤的形式表示，以Turkey多重比較檢驗(yàn)不同水樣的毒性效應(yīng)，利用雙尾t檢驗(yàn)檢測線蟲不同水樣暴露所導(dǎo)致的損傷差異，顯著性水平為P < 0.05。礦區(qū)水環(huán)境樣品中營養(yǎng)元素和重金屬元素含量與其誘導(dǎo)線蟲毒性效應(yīng)的相關(guān)性采用主成分分析法(SPSS軟件包)。

2　結(jié)果(Results)

2.1礦區(qū)水環(huán)境樣品對線蟲生長發(fā)育的影響

2.1.1礦區(qū)水環(huán)境抑制了線蟲的生長發(fā)育

C. elegans的胚后發(fā)育可以分為5個階段，包括L1、L2、L3、L4共4個幼蟲期和1個成蟲期。為了研究礦區(qū)水環(huán)境暴露對線蟲生長發(fā)育的影響，本實(shí)驗(yàn)將L1期幼蟲暴露于不同的水環(huán)境樣品培養(yǎng)，并觀察各處理95%以上的L1期幼蟲發(fā)育至L4/成蟲所需的時間。圖5結(jié)果顯示，未做任何處理的L1期幼蟲(control)95%以上發(fā)育至L4/成蟲期需要(56.4±0.73) h，水樣1、3和5所需時間分別為(54.7±1.52)、(58.6±2.33)和(53.3±1.94) h，與對照無明顯的差異(P > 0.05)；而水樣2則明顯延緩了線蟲的生長發(fā)育周期，其L1期幼蟲95%以上發(fā)育至L4/成蟲期所需的時間為(63.5±1.75) h，與對照的差異顯著(P < 0.05)；更為嚴(yán)重的是，生活于水樣4中的L1期幼蟲，經(jīng)過近70 h的培養(yǎng)，大部分的蟲子仍滯留于L1/L2幼蟲期，水樣4嚴(yán)重阻礙了線蟲的生長發(fā)育。

圖5　礦區(qū)水環(huán)境抑制了線蟲的生長發(fā)育注：同步化的L1期幼蟲暴露于不同的環(huán)境水樣培養(yǎng)，觀察并統(tǒng)計各處理95%以上的L1期幼蟲發(fā)育至L4/成蟲所需的時間。所有數(shù)據(jù)均為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤，n≥20，*表示與對照相比具有顯著差異，P<0.05。Fig. 5　Inhibitory effects of mining waters on growth of C. elegansNote: Synchronized L1-stage worms were exposed to mining water samples, and the growth time that 95% of the worms developed to L4/adult stages were measured. All values are represented by means ±SE; n≥20. * represents statistical significance (P < 0.05).

2.1.2礦區(qū)水環(huán)境樣品對線蟲壽命的影響

將L1期幼蟲暴露于不同環(huán)境水樣培養(yǎng)至所有蟲子全部死亡，每天在解剖鏡下進(jìn)行線蟲死亡數(shù)目的統(tǒng)計。圖6結(jié)果顯示，水樣2、3和4中培養(yǎng)的線蟲在第9天開始死亡，而對照和水樣1、5到第11天才出現(xiàn)死亡現(xiàn)象；隨著培養(yǎng)時間的延長，水樣2培養(yǎng)的蟲子在第19天已全部死亡，水樣4培養(yǎng)的蟲子在第17天已全部死亡，而對照和水樣1、3、5培養(yǎng)的蟲子全部死亡發(fā)生在第21天。上述研究結(jié)果表明，水樣2和4不僅延緩和抑制了幼蟲的生長發(fā)育，而且縮短了線蟲的生命周期。

2.1.3礦區(qū)水環(huán)境樣品減少線蟲的體長

體長是線蟲生長發(fā)育的一個重要標(biāo)志，環(huán)境因子可以通過控制線蟲的體細(xì)胞大小影響蟲子的大小[17]。圖7的研究結(jié)果顯示，L1期幼蟲暴露于不同的環(huán)境水樣培養(yǎng)72 h后，生活于水樣1、2、3和5中的線蟲已基本發(fā)育至成蟲，其體長變化與對照相比無明顯的差異(P > 0.05)；而暴露于水樣4中的L1期幼蟲，其體長僅(270±35) μm，顯著低于對照以及其他水樣(P < 0.05)，該研究結(jié)果進(jìn)一步證明了水樣4對線蟲生長發(fā)育的抑制作用。

圖6　礦區(qū)水環(huán)境對線蟲壽命的影響注：同步化的L1期幼蟲暴露于不同的環(huán)境水樣培養(yǎng)，從第5天開始，每天觀察并統(tǒng)計死亡蟲子的數(shù)量。成活率(%)=(所有蟲子個數(shù)-死亡蟲子個數(shù))/所有蟲子個數(shù)×100%。所有數(shù)據(jù)均為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差，n≥20，*表示與對照相比具有顯著差異，P<0.05。Fig. 6　Effects of mining water on life span of C. elegansNote: Synchronized L1-stage worms were exposed to mining waters throughout their life, and survival rate was calculated by measuring the numbers of dead worms every day. Survival rate (%)=(all worms-dead worms)/all worms×100%. All values are represented by means±SE; n≥20. * represents statistical significance (P < 0.05).

圖7　礦區(qū)水環(huán)境對線蟲體長的影響注：同步化的L1期幼蟲暴露于不同的環(huán)境水樣培養(yǎng)，72 h取出蟲子進(jìn)行固定并拍照，利用Image J軟件測定蟲子的體長。所有數(shù)據(jù)均為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤，n≥20，*表示與對照相比具有顯著差異，P<0.05。Fig. 7　Effects of mining water on body length of C. elegansNote: Synchronized L1-stage worms were exposed to mining water samples, and extracted and fixed for photo taking after 72 hours. The sizes of worm body length were measured by Image J. All values are represented by means ±SE; n≥20. * represents statistical significance (P < 0.05).

2.2礦區(qū)水環(huán)境樣品對線蟲生殖發(fā)育的影響

2.2.1礦區(qū)水環(huán)境樣品誘導(dǎo)線蟲生殖細(xì)胞凋亡顯著增加

為了研究礦區(qū)水環(huán)境對線蟲生殖發(fā)育的影響，實(shí)驗(yàn)選用生殖細(xì)胞凋亡作為生物檢測終點(diǎn)。將L1期幼蟲暴露于不用水樣處理72 h后檢查線蟲其中一條生殖腺的細(xì)胞凋亡數(shù)目，圖8A結(jié)果顯示，暴露于水樣1、3、5的線蟲，其生殖細(xì)胞凋亡數(shù)目分別為(2.98±0.08)、(3.15±0.05)和(2.80±0.09)，與對照(2.77±0.10)相比雖然有所增加，但未表現(xiàn)出顯著性差異(P > 0.05)；暴露于水樣2的線蟲，其生殖細(xì)胞凋亡數(shù)目為(3.40±0.30)，明顯高于對照(P < 0.05)；而暴露于水樣4中的線蟲，由于其生長發(fā)育受到嚴(yán)重的抑制，無法正常發(fā)育至L4/成蟲期，而生殖細(xì)胞凋亡僅發(fā)生于成熟的生殖腺，因此無法檢測到生殖細(xì)胞的凋亡?；诖?，為了進(jìn)一步明確礦區(qū)水環(huán)境對線蟲生殖發(fā)育的影響，實(shí)驗(yàn)選用L4期幼蟲作為活體動物模型，該時期的線蟲，其生殖腺發(fā)育已基本完成，形成了2個對稱的U形生殖腺臂，生殖細(xì)胞的凋亡開始發(fā)生，并敏感響應(yīng)外界環(huán)境因子的影響。將L4期幼蟲暴露于水樣處理24 h，圖8B結(jié)果顯示，水樣2和4均誘導(dǎo)顯著的生殖細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)出明顯的生殖毒性。

2.2.2礦區(qū)水環(huán)境樣品降低后代的孵化率和存活率

生殖腺的正常發(fā)育是線蟲世代傳遞的基礎(chǔ)，生殖細(xì)胞在形成之初已包含母體的遺傳信息，生殖細(xì)胞的損傷易造成子代個體的遺傳不穩(wěn)定性，表現(xiàn)出不同程度的損傷效應(yīng)，如卵的孵化率降低、子代個體的存活率降低等[14]。為了進(jìn)一步驗(yàn)證礦區(qū)環(huán)境水樣造成線蟲的生殖發(fā)育損傷，我們將L4期幼蟲暴露于礦區(qū)環(huán)境水樣處理24 h后，觀察新生卵的孵化率以及新孵化幼蟲的成活率。圖9A和B結(jié)果顯示，暴露于水樣4中的線蟲，其新生卵的孵化率及新F1代幼蟲的成活率均顯著降低；而其他環(huán)境水樣處理的線蟲，其新生卵的孵化率及新F1代幼蟲的成活率雖然有所減少，但并未達(dá)到顯著性的差異，這可能是由于這2種生物檢測終點(diǎn)響應(yīng)環(huán)境因子的敏感性不夠，未能靈敏地表現(xiàn)出損傷效應(yīng)。

2.3水樣指標(biāo)測定

上述研究結(jié)果顯示，不同礦區(qū)環(huán)境水樣作用于線蟲的生長和生殖發(fā)育毒性存在很大的差異，為了探索造成這種差異的原因，實(shí)驗(yàn)檢測了所取水樣中營養(yǎng)元素(總氮、總磷和總鉀)及霍邱鐵礦區(qū)伴生的主要金屬元素(總鐵、可溶性鐵、銅、鉛、鋅、鎘、鉻、汞、砷)的含量。表1結(jié)果顯示，嚴(yán)重抑制線蟲生長發(fā)育并表現(xiàn)出明顯生殖毒性的4號水樣，其營養(yǎng)元素和主要金屬元素的含量(除了汞元素)較其他水樣均有顯著的提升；而2號水樣的銅、鉛、鎘和砷的含量與水樣1、3和5相比有所提升，但卻明顯低于4號水樣。

圖8　礦區(qū)水環(huán)境誘導(dǎo)的線蟲生殖細(xì)胞凋亡注：A)同步化生長的L1幼蟲暴露于不同的環(huán)境水樣培養(yǎng)，72 h后測定其生殖細(xì)胞死亡數(shù)目；B)同步化生長的L4期蟲子或早期成蟲暴露于不同的環(huán)境水樣培養(yǎng)，24 h后測定其生殖細(xì)胞死亡數(shù)目。所有數(shù)據(jù)均為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤，n≥20，*表示與對照相比具有顯著差異，P<0.05。Fig. 8　Mine water induced germ cell apoptosis in C. elegansNote: A) Synchronized L1-stage larvae were cultivated in various water samples for 72 h; B) Synchronized L4-stage or young adult worms were cultivated in water samples for 24 h, and germ cell corpses were counted after AO staining. All values are represented by means±SE; n≥20. * represents statistical significance (P < 0.05).

圖9　礦區(qū)水環(huán)境對線蟲新生卵的孵化率和F1代幼蟲存活率的影響注：同步化的L4期幼蟲暴露于礦區(qū)水樣處理24 h，統(tǒng)計其卵的孵化率和F1代存活率。所有數(shù)據(jù)均為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤，n≥20，*表示與對照相比具有顯著差異，P<0.05。Fig. 9　Effects of mining water on hatchability and F1 survival in C. elegansNote: Synchronized L4-stage worms were treated in water samples for 24 h, and the hatching rate and the survival rate of F1 were counted separately. All values are represented by means±SE; n≥20. * represents statistical significance (P < 0.05).

此外，本文運(yùn)用主成分分析法分析了水樣中營養(yǎng)元素和主要金屬元素含量與水樣誘導(dǎo)線蟲毒性效應(yīng)的相關(guān)性，以期篩選出關(guān)鍵影響因子。主成分分析雖然保證了主成分之間的正交性，但進(jìn)行旋轉(zhuǎn)變換前對主成分不易命名，為此，本文通過對初始因子負(fù)荷矩陣進(jìn)行了四次最大正交旋轉(zhuǎn)變換。由表2可以看出，第1主成分對總方差的貢獻(xiàn)率是75.5%，第2主成分的貢獻(xiàn)為17.4%，即前兩個主成分能把全部水樣中的營養(yǎng)元素與金屬元素提供信息的92.9%反映出來，因此，該問題利用主成分分析是科學(xué)的、可靠的。第1成分表示金屬與非金屬元素對毒性效應(yīng)促進(jìn)作用的量度，總鐵、可溶性鐵、銅、鉻和砷對第1主成分的正向負(fù)荷量較大，得分系數(shù)均在0.99以上(表3)，這說明鐵、銅、鉻和砷4種元素對毒性效應(yīng)影響較大。第2成分表示氮營養(yǎng)元素對毒性效應(yīng)促進(jìn)作用的量度。總氮對毒性效應(yīng)的促進(jìn)量度最大(得分系數(shù)為0.91)，表明氮營養(yǎng)是毒性效應(yīng)的另一個重要的促進(jìn)因子，高濃度氮可能會誘發(fā)毒性效應(yīng)。

表1　5個水樣的營養(yǎng)元素和主要重金屬含量

表2　總方差分解表

表3　旋轉(zhuǎn)后主要成分矩陣

3　討論(Discussion)

金屬礦在開采、運(yùn)輸以及固體廢棄物堆放、處理的過程中，礦物質(zhì)及伴生的其他重金屬元素通過淋溶、遷移、轉(zhuǎn)化等渠道釋放到礦區(qū)及周邊的土壤、水體等環(huán)境介質(zhì)，造成環(huán)境污染，影響當(dāng)?shù)剞r(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量和生物安全，威脅人們的健康[1-3]。而很多礦區(qū)及周邊有大量的農(nóng)田，地下采礦，地上農(nóng)田同時從事農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，農(nóng)業(yè)的面源污染進(jìn)一步加劇了礦區(qū)環(huán)境污染物的復(fù)雜性。當(dāng)前，針對這種復(fù)雜的微環(huán)境潛在生物安全隱患的研究還不多，在活體水平開展的研究工作尤其少，非常不利于礦區(qū)生態(tài)環(huán)境健康風(fēng)險的準(zhǔn)確評價以及合理預(yù)防措施的制定。本文以環(huán)境科學(xué)及毒理學(xué)領(lǐng)域常用的模式生物秀麗隱桿線蟲作為實(shí)驗(yàn)動物模型，以純水中正常生長的線蟲指標(biāo)為對照(補(bǔ)充數(shù)據(jù)1)，評價了鐵礦區(qū)環(huán)境水樣中相關(guān)理化指標(biāo)對生物體的生長、生殖發(fā)育毒性的影響，以期為礦區(qū)生態(tài)環(huán)境生物安全性的預(yù)警、監(jiān)測和評價提供基礎(chǔ)理論數(shù)據(jù)及便捷、快速的技術(shù)方法。

礦區(qū)水樣的采集以霍邱縣周油坊鐵礦為輻射中心點(diǎn)，以距離遠(yuǎn)近布點(diǎn)。水樣主要金屬元素含量檢測數(shù)據(jù)揭示，礦區(qū)主要金屬元素的含量隨著遠(yuǎn)離輻射中心點(diǎn)而不斷降低，進(jìn)一步證明了金屬元素隨距離的遷移、變化規(guī)律；而2號水樣取自養(yǎng)殖塘(魚、鴨、鵝等)，可能由于養(yǎng)殖飼料中重金屬元素等的添加，或礦渣的堆放等原因，使得其中的銅、鉛、鎘等重金屬元素的含量較高[18]。水樣營養(yǎng)元素檢測結(jié)果揭示，農(nóng)田邊廢棄的水溝，可能由于礦區(qū)居民生活垃圾的傾倒、農(nóng)田面源污染等原因，使得氮元素含量偏高，水體富營養(yǎng)化明顯；農(nóng)田溝渠由于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，其營養(yǎng)元素的含量亦較高；而水生蔬菜種養(yǎng)塘，其營養(yǎng)元素可能由于植物的吸收、利用效果，使得營養(yǎng)元素的含量相對較低。

重金屬是重要的環(huán)境污染物。金屬礦的開采是重金屬主要的污染源之一，采礦工業(yè)的發(fā)展不僅造成地下水和河流湖泊的重金屬污染，還造成土壤的污染，對生態(tài)環(huán)境造成巨大威脅，并通過食物鏈富集，過多的重金屬攝入可導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生，包括癌癥的發(fā)生。目前，包括鎘、鉻、銅、砷等在內(nèi)的多種重金屬級類金屬已被列為重要的致癌物，動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，重金屬的暴露可對機(jī)體的生長和生殖發(fā)育產(chǎn)生不同程度的影響。Crouau等[19]報導(dǎo)了砷對跳蟲(Folsomia candida)的生長和生殖毒性效應(yīng)，Brix等[20]亦發(fā)現(xiàn)高濃度的砷酸鈉對大鹽湖鹵蟲的生長、生殖和成活均有顯著影響。Ochi等[21]發(fā)現(xiàn)，鎘可引起DNA鏈斷裂和染色體畸變。Yang等[22]發(fā)現(xiàn)0.4 μmol·L-1以上的鎘暴露可顯著抑制其細(xì)胞增殖，并具有劑量效應(yīng)。還有證據(jù)顯示，鎘可誘導(dǎo)鼠的不同器官和哺乳動物細(xì)胞系的細(xì)胞凋亡[23, 24]。銅雖然是生物體的必需微量元素，但亦有報道顯示，在給予大鼠高水平膽固醇飼料的條件下，微量的銅可誘導(dǎo)腦細(xì)胞的凋亡[25]。低濃度長期的銅暴露(3.2 μmol·L-1暴露28 d)可誘導(dǎo)莫桑比克羅非魚Mozambique tilapia鰓細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死[26]。上述研究結(jié)果顯示，重金屬暴露與機(jī)體的生長和生殖發(fā)育均有密切的相關(guān)性。在本文的研究中，結(jié)合水樣的理化指標(biāo)檢測結(jié)果和以秀麗隱桿線蟲為活體動物模型的毒性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并應(yīng)用主要成分分析法進(jìn)行環(huán)境水樣誘導(dǎo)線蟲生長生殖毒性效應(yīng)主要致毒因素分析，我們發(fā)現(xiàn)，礦區(qū)水環(huán)境作用于線蟲的生長、生殖發(fā)育毒性與鐵礦區(qū)環(huán)境水樣中金屬元素含量的變化密切相關(guān)，并隨著重金屬含量的增加而急劇加大，其中總鐵、可溶性鐵、銅、鉻和砷是環(huán)境水樣毒性效應(yīng)產(chǎn)生的主要影響因子；而當(dāng)水樣中重金屬含量低于一定水平后，線蟲的生長和生殖發(fā)育雖然受到一定的影響，但未達(dá)到顯著性差異。另外，研究還發(fā)現(xiàn)，水樣中營養(yǎng)元素含量的變化(如氮元素)在一定范圍內(nèi)對線蟲無明顯的生長、生長發(fā)育毒性。

總的來說，本文應(yīng)用秀麗隱桿線蟲作為活體動物，以線蟲的生長和生殖發(fā)育作為生物檢測終點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)了鐵礦區(qū)復(fù)雜水體微環(huán)境作用于生物體的潛在安全風(fēng)險，說明線蟲的生長和生殖發(fā)育可以敏感響應(yīng)環(huán)境水樣中復(fù)雜的毒性作用過程，因此，應(yīng)用線蟲作為評價金屬礦區(qū)水環(huán)境的生物安全性是可行的，并具有重要的實(shí)際意義。下一步，研究組將繼續(xù)利用秀麗隱桿線蟲作為實(shí)驗(yàn)動物模型，通過主要致毒因子的添加實(shí)驗(yàn)，開展生物體響應(yīng)礦區(qū)水環(huán)境毒性效應(yīng)的類型和關(guān)鍵作用基因的研究工作，探索礦區(qū)水環(huán)境產(chǎn)生健康風(fēng)險的作用機(jī)制。

致謝：感謝安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院田善富老師在礦區(qū)水樣選點(diǎn)和采集中給予的幫助。

通訊作者簡介：施六林(1964—)，男，生態(tài)農(nóng)業(yè)碩士，研究員，長期從事農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境等方面的研究，在生態(tài)環(huán)境治理修復(fù)利用等方面有較深造詣。

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◆

A Study on Toxicity of Water Sample from Iron Mine Area onCaenorhabditiselegans

Guo Xiaoying1, Wang Lei1, Wang Bin1, Zhao Hongfei1, Xu Wenjing1, Li Min2, Li Hongying2, Shi Liulin1,*

1. Institute of Agricultural Engineering, Anhui Academy of Agricultural Science, Hefei 230031, China 2. Institute of Soil and Fertilizer, Anhui Academy of Agricultural Science, Hefei 230031, China

31 March 2015accepted 27 May 2015

Mine area environment problems have drawn a considerable amount of intentions in various research fields in recent years. In order to investigate the potential biosafety issues within mine area water environment, toxicity of 5 mine area surface water samples around mine areas on Caenorhabditis elegans that was used as an in vivo animal model was studied in Anhui Province Huoqiu Iron Mine Area; both growth and reproductive developments were used as biological endpoints for damage effects determination. The results show that mine area water environment exsited conspicuous damage effects on both growth and reproductive process of Caenorhabditis elegans, and the extent of these damage effects was highly depended on the distance between the water sampling point and the mining spot, as well as the contents of main contaminants within the water samples. The main influencing factors of total iron, soluble iron, copper, chrome and arsenic within water samples on Caenorhabditis elegans toxicology effects was determined through principal component analysis method. This study provide a new technique and approach for monitoring and evaluating mine area ecological and biological safety.

mine water body; Caenorhabditis elegans; growth inhibition; apoptosis; hatchability; survival rate

安徽省科技攻關(guān)計劃項(xiàng)目(1301042115)；安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目(14C1308) ；國家自然科學(xué)基金(21407002)；安徽省自然科學(xué)基金(1508085MB39)；安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(14A1009)

郭肖穎(1979-)，女，副研究員，研究方向?yàn)檗r(nóng)業(yè)生態(tài)和環(huán)境毒理學(xué)，E-mail: gxy2@mail.ustc.edu.cn；

Corresponding author)， E-mail: shiliulin386@126.com

10.7524/AJE.1673-5897.20150331008

2015-03-31 錄用日期：2015-05-27

1673-5897(2015)6-219-09

X171.5

A

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