氰戊菊酯對斑馬魚和稀有鮈鯽不同生命階段的毒性效應

蔣金花，陳江濱，吳聲敢，俞瑞鮮，王彥華，蒼濤，蔡磊明，趙學平

浙江省農業(yè)科學院農產品質量標準研究所省部共建國家重點實驗室培育基地—浙江省植物有害生物防控重點實驗室，農業(yè)部農藥殘留檢測重點實驗室，杭州 310021

氰戊菊酯對斑馬魚和稀有鮈鯽不同生命階段的毒性效應

蔣金花，陳江濱，吳聲敢，俞瑞鮮，王彥華，蒼濤，蔡磊明，趙學平*

浙江省農業(yè)科學院農產品質量標準研究所省部共建國家重點實驗室培育基地—浙江省植物有害生物防控重點實驗室，農業(yè)部農藥殘留檢測重點實驗室，杭州 310021

為探明氰戊菊酯對魚類不同生命階段的毒性效應，以斑馬魚和稀有鮈鯽為測試生物，評價了氰戊菊酯對斑馬魚和稀有鮈鯽不同生命階段的急性毒性差異。研究發(fā)現，氰戊菊酯對斑馬魚和稀有鮈鯽胚胎的96 h-LC50值分別為0.901 (0.664～1.22)和0.636 (0.233～1.74) mg·L-1。氰戊菊酯對稀有鮈鯽胚胎孵化有明顯的促進作用，染毒48 h后，0.188和0.375 mg·L-1氰戊菊酯對稀有鮈鯽胚胎的孵化率分別為88.9%和100%。氰戊菊酯對斑馬魚仔魚、幼魚和成魚的96 h-LC50值分別為0.00340、0.0183、0.00487 mg·L-1，氰戊菊酯對稀有鮈鯽仔魚、幼魚和成魚的96 h-LC50值分別為0.0520、0.00277、0.00345 mg·L-1。因此，氰戊菊酯對斑馬魚不同生命階段的毒性從高到低順序依次為：仔魚>成魚>幼魚>胚胎，氰戊菊酯對稀有鮈鯽胚胎、仔魚、幼魚和成魚的毒性為幼魚>成魚>仔魚>胚胎。試驗結果表明，斑馬魚仔魚對氰戊菊酯的敏感性高于稀有鮈鯽相應的生命階段，相對于斑馬魚，稀有鮈鯽胚胎、幼魚以及成魚對氰戊菊酯的毒性作用更為敏感，說明氰戊菊酯對斑馬魚和稀有鮈鯽不同生命階段的毒性效應差異較大。

氰戊菊酯；斑馬魚；稀有鮈鯽；急性毒性

氰戊菊酯是擬除蟲菊酯類農藥的主要品種，具有高效、低殘留等特點，在各國得到廣泛使用，2011年我國農業(yè)部已將氰戊菊酯列為蔬菜、水果檢測農藥殘留重點監(jiān)測對象之一。隨著農藥的廣泛使用，農藥殘留及其對環(huán)境污染、健康和食品安全產生的危害問題已成為公眾關注的熱門話題。對國內外多種蔬菜、水果和茶葉的調查中均有發(fā)現氰戊菊酯殘留[1-3]，國外土壤檢測也顯示氰戊菊酯大量殘留[4]。農藥在施用過程中約有1%作用于目標生物，大量殘余的農藥留于土壤中并通過雨水沖刷等途徑進入水體進而造成水污染，魚類是水環(huán)境中的主要生物之一，魚類的生態(tài)毒理反應和變化可作為水環(huán)境評價的良好指標?，F有研究發(fā)現，氰戊菊酯對不同魚類的急性毒性差異大，氰戊菊酯對胭脂魚幼魚96 h的LC50值為2.0 μg·L-1[5]，對斑馬魚成魚96 h的急性毒性LC50值為0.09 μg·L-1[6]，對金魚96 h的急性毒性LC50值為12.5 μg·L-1[7]。目前，關于氰戊菊酯對魚類的急性毒性研究較多，而對魚類不同生命階段的毒性影響報道相對較少，因此研究氰戊菊酯對魚類不同生命階段的毒性效應，為氰戊菊酯風險管理和安全使用提供更加全面的毒理學依據。

魚類的毒性實驗在研究水污染和水環(huán)境中占有重要地位，目前OECD、EPA、ISO等各國組織機構常用的生態(tài)毒性檢測魚種是斑馬魚，他們將化學品對斑馬魚急/慢性毒性作為評價污染物對水生環(huán)境危害程度的指標。2003年我國頒布的《新化學物質環(huán)境管理辦法》中明確規(guī)定，“新化學物質的生態(tài)毒理學數據必須包括在中國境內用中國的供試生物完成的測試數據”，其中要求在魚的毒性試驗中應選擇稀有鮈鯽(Gobiocypris rarus)為試驗生物[8]。稀有鮈鯽是一種中國特有的淡水魚類，主要生活于支流的溝渠等小水體中，分布于中國四川省漢源縣等地，具有性成熟快、易于飼養(yǎng)，實驗室內可周年產卵、連續(xù)產卵等優(yōu)點?，F有試驗表明，稀有鮑鯽對重金屬、農藥等化學品非常敏感，是進行化學品毒性測試和環(huán)境水樣毒性實驗的理想材料[9-10]。一般情況下，以一種魚類模式生物的急性毒性結果作為化學品的生態(tài)毒理學數據，可能會造成對本土生物的欠保護或過保護，也無法對化學品的安全性作出全面的評價。因此，本研究以斑馬魚和稀有鮈鯽為供試生物模型，研究了氰戊菊酯對斑馬魚和稀有鮈鯽不同生命階段的毒性效應，通過比較氰戊菊酯對斑馬魚和稀有鮈鯽的毒性差異，補充、完善氰戊菊酯對水生生物尤其是我國特有魚種稀有鮈鯽的毒性效應數據庫，進而為稀有鮈鯽發(fā)展成為國際通用種提供理論數據支撐。試驗結果對進一步研究氰戊菊酯的致毒機制具有一定的現實意義，也為評價氰戊菊酯的安全使用及環(huán)境監(jiān)測提供科學依據。

1　材料與方法(Materials and methods)

1.1儀器與試劑

儀器：24孔細胞培養(yǎng)板和6孔細胞培養(yǎng)板均購自浙江拱東醫(yī)療科技有限公司，分別作為胚胎和仔魚染毒器具；

試劑：氰戊菊酯原藥(90%)，杭州慶豐農化有限公司；分析純吐溫-80(國藥集團化學試劑有限公司)；N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，天津市福晨化學試劑廠。

1.2實驗材料

稀有鮈鯽種魚購自江蘇無錫中科水質環(huán)境技術有限公司，斑馬魚種魚購自武漢中科院水生生物研究所的國家斑馬魚資源中心，AB型品系，本試驗所用斑馬魚和稀有鮈鯽的胚胎、仔魚、幼魚和成魚均為種魚繁殖所得。斑馬魚和稀有鮈鯽胚胎分別為同一天收集的健康胚胎；仔魚為孵化后8日齡；幼魚為孵化后55日齡；成魚為3月齡。仔魚、幼魚和成魚均于正式試驗前24 h停止投餌。

試驗用水為曝氣除氯并經活性炭過濾的自來水，水溫為(25±1) ℃，pH控制在6.5～7.5，光/暗比為14 h/10 h，溶解氧≥5.8 mg·L-1。

1.3試驗方法1.3.1試驗藥液配制

氰戊菊酯原藥用吐溫-80和DMF溶解，經超聲混勻定容后配制成一定濃度的標準儲備液，冷藏備用。試驗時，用移液器吸取適量儲備液加入一定量的標準稀釋水，超聲混勻，按相應倍數逐級稀釋至設計濃度。試驗期間，各試驗容器內的助溶劑DMF在水中的最終濃度均低于0.001mg·L-1。標準稀釋水按照《化學品魚類急性毒性試驗》[11]方法配制。

1.3.2胚胎染毒試驗

參考世界經濟合作與發(fā)展組織(OECD)方法[12]，通過立體顯微鏡觀察，挑選發(fā)育正常的健康受精卵供試。采用24孔細胞培養(yǎng)板，每孔加入2 mL供試藥液并放入1枚受精卵。根據預備試驗結果，設定氰戊菊酯對斑馬魚和稀有鮈鯽胚胎毒性試驗濃度(表1)，按最高濃度組的助劑濃度設置助劑對照組，以稀釋水為空白對照組。每濃度設3次重復，每重復為1個24孔板。

染毒期間環(huán)境溫度為(25±1) ℃，光/暗比為14 h/10 h。每24 h更換1次溶液。試驗期間分別于染毒6、24、48、72、96 h觀察并記錄死亡數、孵化數及相關中毒癥狀，并及時取出死亡個體。

1.3.3仔魚、幼魚和成魚試驗

參考OECD TG 203[13]方法，設計氰戊菊酯對不同生命階段斑馬魚和稀有鮈鯽的急性毒性試驗。試驗用水為曝氣除氯并經活性炭過濾的自來水。根據預備試驗結果，設定斑馬魚和稀有鮈鯽仔魚、幼魚和成魚的試驗濃度(表1)，按最高濃度組的助劑濃度設助劑對照組，以曝氣自來水為空白對照組。

仔魚急性毒性試驗采用6孔板，每孔放入3條仔魚，設2次重復，每重復為1個6孔板；幼魚和成魚采用6 L魚缸，每缸15條魚，均設2次重復。仔魚、幼魚和成魚的試驗過程均采用“半靜態(tài)法” ，每24 h更換1次藥液。

試驗期間分別于6、24、48、72和96 h時間點觀察并記錄各組斑馬魚和稀有鮈鯽中毒癥狀及死亡情況，每隔24 h檢查各組的pH值及溶解氧含量，并及時清除死魚。

1.4數據處理

用DPS數據處理系統(tǒng)9.50標準版計算斑馬魚和稀有鮈鯽胚胎、仔魚、幼魚和成魚的LC50值及其95%置信區(qū)間，分析氰戊菊酯對斑馬魚和稀有鮈鯽各生命階段的毒性差異。

2　結果(Results)

2.1氰戊菊酯對斑馬魚和稀有鮈鯽胚胎的毒性效應

2.1.1致死效應

圖1為斑馬魚胚胎經不同濃度氰戊菊酯處理不同時間后的死亡率。24～72 h不同處理組的胚胎死亡率都在20%以下，72～96 h時胚胎死亡率逐漸上升，0.188、0.375、0.750、1.50、3.00、6.00 mg·L-1氰戊菊酯在96 h時的胚胎死亡率分別達到12.5%、12.5%、41.7%、79.2%、87.5%、91.7%。相對于藥劑處理組，空白對照組和助劑對照組對斑馬魚胚胎的死亡率沒有影響。

圖2為稀有鮈鯽胚胎經不同濃度氰戊菊酯處理不同時間后的死亡率。在24～96 h內，隨著暴露時間的延長，氰戊菊酯各濃度處理組的胚胎死亡率逐漸增加，在96 h時，0.0234、0.0469、0.0938、0.188、0.375、0.750、1.50 mg·L-1試驗組的死亡率分別為0%、5.56%、0%、11.1%、22.2%、50.0%、94.4%。從圖2可見，48～96 h為氰戊菊酯對稀有鮈鯽胚胎毒性作用較明顯的時間段。相對于藥劑處理組，空白對照組和助劑對照組對斑馬魚胚胎的死亡率沒有影響。

表1　氰戊菊酯對斑馬魚和稀有鮈鯽不同生命階段的急性毒性試驗濃度

圖1　氰戊菊酯對斑馬魚胚胎死亡率的影響Fig. 1　Effect of fenvalerate on mortality rate of zebrafish embryo

結果表明，氰戊菊酯對斑馬魚和稀有鮈鯽胚胎的毒性隨處理濃度的增大而增加，同時隨暴露時間的延長而增加，具有一定的劑量-效應和時間-效應關系。

圖2　氰戊菊酯對稀有鮈鯽胚胎死亡率的影響Fig. 2　Effect of fenvalerate on mortality rate of rare minnow embryo

表2為96 h時氰戊菊酯對斑馬魚和稀有鮈鯽胚胎的半致死濃度(LC50)及95%置信區(qū)間。從中可看出，稀有鮈鯽胚胎對氰戊菊酯比較敏感，氰戊菊酯對稀有鮈鯽胚胎的毒性高于斑馬魚胚胎。

2.1.2亞致死效應

從圖3可見，不同濃度的氰戊菊酯對斑馬魚胚胎的孵化有微弱的抑制作用。染毒96 h后，0.188、0.375、0.750、1.50、3.00、6.00 mg·L-1氰戊菊酯對斑馬魚胚胎的孵化率分別為91.7%、95.8%、95.8%、91.7%、83.3%、87.5%?？瞻讓φ战M和助劑對照組對斑馬魚胚胎的孵化率沒有影響。

圖4為不同濃度氰戊菊酯處理后對稀有鮈鯽胚胎孵化的影響。研究發(fā)現，在一定的濃度范圍內，高濃度的氰戊菊酯對稀有鮈鯽胚胎的孵化有明顯的促進作用，染毒48 h后，助劑對照、空白對照組以及試驗組0.0234、0.0469、0.0938、0.188、0.375、0.750、1.50 mg·L-1氰戊菊酯對稀有鮈鯽胚胎的孵化率分別為5.56%、5.56%、0%、0%、16.7%、88.9%、100%、100%、100%，染毒72 h后，試驗組與空白對照和助劑對照組胚胎全部孵化。

圖3　氰戊菊酯對斑馬魚胚胎孵化率的影響Fig. 3　Effect of fenvalerate to hatching rate of zebrafish embryos

圖4　氰戊菊酯對稀有鮈鯽胚胎孵化率的影響Fig. 4　Effect of fenvalerate to hatching rate of rare minnow embryos

表2　氰戊菊酯對斑馬魚和稀有鮈鯽胚胎的急性毒性(96 h)

2.2氰戊菊酯對斑馬魚和稀有鮈鯽仔魚、幼魚和成魚的急性毒性

研究發(fā)現，隨著氰戊菊酯濃度的增加，斑馬魚和稀有鮈鯽仔魚、幼魚和成魚的死亡率都出現逐漸上升的趨勢，說明氰戊菊酯和毒性之間存在劑量-效應關系。斑馬魚和稀有鮈鯽成魚對氰戊菊酯的最終中毒癥狀主要表現為游動變得遲緩，對外界刺激變得遲鈍，嘴開合速度降慢，個別魚出現側翻失衡及沉底現象，最終死亡。氰戊菊酯處理后，斑馬魚和稀有鮈鯽仔魚和幼魚的中毒癥狀沒有成魚明顯，隨著染毒時間的延長，個別魚體出現側翻，脊柱彎曲或者魚體變白腐爛?？瞻捉M和助劑對照組魚游動正常，無異常癥狀。

氰戊菊酯對斑馬魚和稀有鮈鯽3個不同生命階段的急性毒性見表3。由表可見，氰戊菊酯對斑馬魚仔魚、幼魚和成魚的96 h-LC50值分別為0.00340、0.0183、0.00487 mg·L-1，氰戊菊酯對稀有鮈鯽仔魚、幼魚和成魚的96 h-LC50值分別為0.0520、0.00277、0.00345 mg·L-1。因此，氰戊菊酯對斑馬魚仔魚、幼魚和成魚的毒性為：仔魚>成魚>幼魚，氰戊菊酯對稀有鮈鯽仔魚、幼魚和成魚的毒性為：幼魚>成魚>仔魚。研究表明，斑馬魚仔魚對氰戊菊酯的敏感性高于稀有鮈鯽相應的生長階段，相對于斑馬魚幼魚和成魚，稀有鮈鯽幼魚和成魚對氰戊菊酯的毒性作用更為敏感。

3　討論(Discussion)

魚類早期發(fā)育階段是對毒性物質最為敏感的階段，利用魚類進行污染物毒性研究，可以較精確的掌握污染物對魚類的影響。我國尚沒有建立起標準的實驗魚類，缺乏本土生物的生態(tài)毒性數據不但影響了對化學品安全性的全面評價，也難以滿足我國化學品管理的需要。因此，本試驗分別以胚胎、8日齡仔魚、55日齡幼魚和3月齡成魚為研究樣本，以國際通用種斑馬魚和我國特有種稀有鮈鯽為測試生物，研究了氰戊菊酯對斑馬魚和稀有鮈鯽不同生命階段的毒性效應。目前關于化學品對稀有鮈鯽某一生命階段的急性毒性或者慢性毒性效應研究較多[14-18]，對其不同生命階段的毒性差異研究還十分有限。研究氰戊菊酯對斑馬魚和稀有鮈鯽生命周期四個典型生命階段的毒性效應，對氰戊菊酯的生態(tài)風險評估以及水體污染的生物監(jiān)測具有一定的指導意義，在豐富稀有鮈鯽毒性數據庫的同時，為制定相關的測試導則和標準提供數據參考。

目前還沒有氰戊菊酯對稀有鮈鯽毒性效應的相關研究報道，本研究發(fā)現，氰戊菊酯對稀有鮈鯽不同生命階段的毒性為幼魚>成魚>仔魚>胚胎，對斑馬魚胚胎、仔魚、幼魚和成魚的毒性從高到低順序依次為：仔魚>成魚>幼魚>胚胎。斑馬魚和稀有鮈鯽胚胎在四個生命階段中敏感性最低，可能胚胎卵膜起著一定的保護作用。斑馬魚仔魚對氰戊菊酯的敏感性高于稀有鮈鯽相應的生命階段，相對于斑馬魚，稀有鮈鯽成魚、幼魚以及胚胎對氰戊菊酯的毒性作用更為敏感。有趣的是，在仔魚、幼魚和成魚這三個生命階段中，氰戊菊酯對斑馬魚幼魚和稀有鮈鯽仔魚的毒性效應顯著低于斑馬魚和稀有鮈鯽另兩個生命階段，這些毒性差異可能是由于不同生命階段的個體發(fā)育不同，對農藥的吸收和代謝能力不同所導致。

近年來，胚胎毒性試驗以其特有的優(yōu)勢正逐步成為傳統(tǒng)成魚急性毒性試驗的替代手段，也被廣泛應用于化合物的致毒和致畸效應研究，孵化率也是評價化合物對魚類是否產生毒性作用的一個敏感指標[19]。已有研究表明，氰戊菊酯對斑馬魚有一定的致畸效應[20-21]，本研究發(fā)現，氰戊菊酯的暴露對斑馬魚和稀有鮈鯽也存在致畸作用，可以引起心包水腫、脊柱彎曲、尾部彎曲等癥狀。試驗結果表明，在一定的濃度范圍內，較高濃度的氰戊菊酯可明顯促進稀有鮈鯽胚胎的孵化，染毒48 h后，0.0938、0.188、0.375、0.750、1.50 mg·L-1氰戊菊酯對稀有鮈鯽胚胎的孵化率分別為16.7%、88.9%、100%、100%、100%，而隨著處理濃度的降低，氰戊菊酯對胚胎孵化率的影響則逐步降低，當濃度為0.0234、0.0469 mg·L-1時胚胎孵化率與對照組相當。但在相同試驗條件下，氰戊菊酯對斑馬魚胚胎的孵化沒有很大的影響。此差異一方面可能是由于稀有鮈鯽胚胎卵膜比較粘稠，有利于吸附氰戊菊酯，另一方面可能是斑馬魚和稀有鮈鯽的卵膜結構存在一定的差異性，推測當高濃度氰戊菊酯處理時，氰戊菊酯可以與稀有鮈鯽卵膜的活性成分相互作用，進而促進卵膜的溶解，因此高濃度的氰戊菊酯對稀有鮈鯽胚胎孵化具有一定的促進作用。而在相同試驗條件下，斑馬魚胚胎可以作出應急反應，將卵膜上的膜孔迅速關閉，因此氰戊菊酯對斑馬魚胚胎孵化的影響較小。

表3　氰戊菊酯對斑馬魚和稀有鮈鯽不同生長階段的急性毒性(96 h)

研究表明，氰戊菊酯對斑馬魚和稀有鮈鯽不同生命階段的毒性效應差異較大，一方面原因可能是這兩種魚類的起源分布不同，其次是兩者的基因組差異，研究表明，斑馬魚的基因組大小為1.8～1.9 Gb，稀有鮈鯽約為1.3 Gb[22]，推測基因組的差異以及不同生命階段基因表達水平的不同導致了斑馬魚和稀有鮈鯽對氰戊菊酯敏感性的差異。因此，進一步從分子水平研究氰戊菊酯對斑馬魚和稀有鮈鯽不同生命階段的毒性效應，對于闡明氰戊菊酯的生態(tài)毒理學機制具有一定的指導意義。此外，目前農藥對魚類的毒性等級劃分僅局限于成魚階段[23]，而本研究表明不同生命階段的魚類對農藥的敏感性差異較大，因此為了更好的評價農藥的水生毒性效應，應進一步開展不同種類農藥對魚類不同生命階段的毒性效應，尋找毒性效應的規(guī)律和機制，為制定相應的毒性判斷標準提供參考數據，也為農藥安全使用及環(huán)境監(jiān)測提供科學依據。

通訊作者簡介：趙學平(1969-)，男，本科，研究員，主要研究方向為農藥應用與毒理學，發(fā)表學術論文60余篇。

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Toxicity Effects of Fenvalerate to Different Life Stages of Zebrafish (Daniorerio) and Chinese Rare Minnow (Gobiocyprisrarus)

Jiang Jinhua, Chen Jiangbin, Wu Shenggan, Yu Ruixian, Wang Yanhua,Cang Tao, Cai Leiming, Zhao Xueping*

State Key Lab Breeding Base for Zhejiang Sustainable Plant Pest Control, Key Lab for Pesticide Residue Detection of Ministry of Agriculture, Institute of Quality and Standard for Agro-Products, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China

10 February 2015accepted 13 May 2015

To explore the toxic effects of fenvalerate on fish, the acute toxicity of fenvalerate to zebrafish (Danio rerio) and Chinese rare minnow (Gobiocypris rarus) at different life stages were evaluated. The results showed that the 96 h LC50values of fenvalerate to the embryos of zebrafish and rare minnow was 0.901 (0.664～1.22) and 0.636 (0.233～1.74) mg·L-1, respectively. The hatching rate of rare minnow embryos was significantly increased after the exposure to 0.188 and 0.375 mg·L-1fenvalerate for 48 h, and the hatching rate was 88.9% and 100%, respectively. The 96 h LC50values of fenvalerate to larvae, juvenile and adult of zebrafish was 0.00340, 0.0183, 0.00487 mg·L-1, respectively. For the toxicity of fenvalerate to larvae, juvenile and adult of rare minnow, the 96 h LC50values was 0.0520, 0.00277, 0.00345 mg·L-1, respectively. The trend of acute toxicity of fenvalerate to zebrafish and rare minnow at different life stages was as follows: larvae>adult>juvenile>embryos for zebrafish, and juvenile>adult>larvae>embryos for rare minnow. Results demonstrated that zebrafish and rare minnow at different life stages exhibited the different levels of sensitivity to fenvalerate, and rare minnow was more sensitive to fenvalerate at the life stages of embryos, larvae and adult than zebrafish.

fenvalerate; zebrafish (Danio rerio); Chinese rare minnow (Gobiocypris rarus); acute toxicity

浙江省農業(yè)科學院科技創(chuàng)新能力提升工程項目

蔣金花(1985-)，女，博士，研究方向為農藥毒理學，E-mail: jinhuajjh@sina.com；

Corresponding author)， E-mail: zhaoxueping@tom.com

10.7524/AJE.1673-5897.20150210001

2015-02-10 錄用日期：2015-05-13

1673-5897(2015)6-269-07

X171.5

A

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