全氟辛烷基磺酸鉀(PFOS)和納米氧化鋅(Nano-ZnO)復合暴露對斑馬魚下丘腦-垂體-甲狀腺軸功能的影響

杜佳，王樹濤，尤宏,*

1. 哈爾濱工業(yè)大學 水資源與環(huán)境國家重點實驗室，哈爾濱 150090 2. 佳木斯大學 公共衛(wèi)生學院，佳木斯 154007

全氟辛烷基磺酸鉀(PFOS)和納米氧化鋅(Nano-ZnO)復合暴露對斑馬魚下丘腦-垂體-甲狀腺軸功能的影響

杜佳1,2，王樹濤1，尤宏1,*

1. 哈爾濱工業(yè)大學 水資源與環(huán)境國家重點實驗室，哈爾濱 150090 2. 佳木斯大學 公共衛(wèi)生學院，佳木斯 154007

全氟辛烷基磺酸鉀(PFOS)和納米氧化鋅(Nano-ZnO)廣泛存在于環(huán)境中，但是它們復合暴露對水生生物的潛在毒性機制尚未明確。本文探討PFOS和Nano-ZnO復合暴露對斑馬魚下丘腦-垂體-甲狀腺軸(HPT軸)毒性的影響。將斑馬魚胚胎從孵化開始暴露于PFOS(0.2、0.4、0.8 mg·L-1)、Nano-ZnO(6.75、12.5、25 mg·L-1)、PFOS+Nano-ZnO(0.2+6.75、0.4+12.5、0.8+25 mg·L-1)溶液中15 d后，分析幼魚的發(fā)育毒性，體內(nèi)的甲狀腺激素(甲狀腺素(T4)和三碘甲狀腺氨酸(T3)含量和與甲狀腺有關基因(CRF、TSH、NIS、TG和TPO)的表達情況。結果發(fā)現(xiàn)復合暴露組與單獨暴露組相比，前者顯著誘導了幼魚的畸形率，降低了幼魚的存活率，并抑制了幼魚的體長。復合暴露組顯著增加了幼魚體內(nèi)T3含量，同時抑制體內(nèi)T4的含量。與單獨暴露組相比，復合暴露組顯著誘導了CRF和NIS基因的表達，同時抑制了TSHβ和TG基因的表達。而TPO基因的表達水平在單獨和復合暴露組中沒有顯著差異。本研究首次證明了PFOS和Nano-ZnO復合暴露對斑馬魚幼魚甲狀腺軸的干擾效果并對其進行了機制探討。

全氟辛烷磺酸鉀(PFOS)；納米氧化鋅(Nano-ZnO)；斑馬魚；下丘腦-垂體-甲狀腺軸；甲狀腺激素

全氟類化合物在表面活性劑、農(nóng)藥、潤滑油、粘合劑、阻燃劑、推進劑和藥物中被廣泛應用[1-2]。全氟化合物的廣泛使用使其在全球范圍內(nèi)廣泛分布[3-4]。全氟辛烷基磺酸鉀(PFOS)是許多全氟化合物的環(huán)境降解產(chǎn)物。PFOS在野生動物和人體內(nèi)被廣泛檢出[5-6]，并且其污染在全球范圍內(nèi)均有分布，這引起了人們對其危害的關注[7-10]。PFOS能夠誘導斯普拉格-道利小鼠子代肺部的氧化應激和細胞凋亡反應[11]。Keiter等[12](2012)報道了PFOS能導致斑馬魚甲狀腺、性腺和肝臟產(chǎn)生病變和生物蓄積。Kim等[13](2010)報道PFOS能夠誘導鯽魚體內(nèi)產(chǎn)生DNA損傷反應。PFOS還能誘導神經(jīng)毒性和細胞毒性等[14-15]。納米技術在過去10年間快速發(fā)展并廣泛應用于許多領域[16]。納米氧化鋅(Nano-ZnO)是5種納米金屬氧化物之一，在光電、化妝品、催化劑和陶瓷顏料等許多領域被廣泛應用[17]。最近一些研究表明Nano-ZnO在河流、土壤和底泥中廣泛存在，并且危害人類和動物的健康[18]。Nano-ZnO也可以誘導DNA損傷、炎癥反應、氧化應激，導致發(fā)育毒性等[19-22]。

甲狀腺激素(THs)受下丘腦-垂體-甲狀腺軸(HPT)調(diào)控，是脊椎動物生長和發(fā)育的重要調(diào)節(jié)激素[23]。THs在胚胎發(fā)育和物種蛻變中起著重要的作用[24-26]。甲狀腺素(T4)和三碘甲狀腺氨酸(T3)是THs的2種主要形式。當血清中T3和T4含量太低時，促甲狀腺素釋放激素(TRH)能夠促進碘的吸收和甲狀腺激素的合成。鈉碘同向轉運體(NIS)是甲狀腺激素生產(chǎn)路徑的組件，也是轉運碘進入甲狀腺濾泡細胞的膜蛋白[27-28]。甲狀腺球蛋白過氧化物酶(TPO)是一種氧化酶，在碘化離子(I-)轉運到甲狀腺濾泡細胞后，TPO可將碘化離子氧化成碘(I0)。De Groef等[29](2006)發(fā)現(xiàn)促腎上腺皮質(zhì)激素-釋放激素(CRH)可以刺激促甲狀腺激素(TSH)分泌，并調(diào)節(jié)甲狀腺激素的合成。PFOS可以誘導嚙齒動物，黑頭呆魚和斑馬魚的胚胎發(fā)育毒性[30-32]。Zhao等[21](2013)報道Nano-ZnO也能導致斑馬魚胚胎的發(fā)育毒性。Du等[33](2009)報道了PFOS長期暴露后會導致斑馬魚胚胎內(nèi)T3含量的增加。Shi等[32](2009)報道了PFOS暴露改變了斑馬魚幼魚HPT軸相關的基因表達。Varghese等[34](2001)發(fā)現(xiàn)甲狀腺內(nèi)部平衡的破壞可能會影響機體內(nèi)部的氧化脅迫反應。PFOS和Nano-ZnO單獨暴露都能誘導動物機體內(nèi)的氧化脅迫反應[11, 35]。而PFOS和Nano-ZnO對以上毒性的誘導都與甲狀腺功能密不可分。

環(huán)境中的污染物正趨于多元化和復雜化，環(huán)境污染以各種污染物構成的復合污染為主。在這種狀態(tài)下，多種污染物共存于同一環(huán)境并相互作用。目前，越來越多的科學家開始研究有毒物質(zhì)的復合暴露毒性[36-38]。單獨毒性評價已經(jīng)不能對污染物進行全面的風險評估。生物體在環(huán)境中經(jīng)常暴露在混合污染物中，所以了解混合污染物的毒性機制并做出正確的環(huán)境風險評價已經(jīng)成為必然趨勢。Altenburger等[39](2012)報道稱混合污染物的毒性分析應該使用混合毒性模型。Sarigiannis和Hansen[40](2012)利用單獨污染物的積累效果來評估混合污染物的風險。PFOS和Nano-ZnO復合暴露的毒性效應研究還很少。雖有Du等[41](2014)報道了PFOS和Nano-ZnO復合暴露可誘導斑馬魚的發(fā)育毒性，但PFOS和Nano-ZnO復合暴露的具體毒性機制尚不清晰。本研究將斑馬魚的胚胎暴露在混合的PFOS和Nano-ZnO溶液中，通過分析斑馬魚幼魚的發(fā)育毒性，幼魚體內(nèi)的甲狀腺激素含量和基因轉錄等指標的變化情況，研究二者復合引起的甲狀腺毒性作用，試圖探討其潛在的毒性機理。

1　材料與方法 (Materials and methods)

1.1實驗材料

成年AB品系斑馬魚(Danio rerio)由中國科學院武漢水生生物研究所提供。斑馬魚體長約為3～4 cm，養(yǎng)殖于經(jīng)活性炭和珊瑚砂過濾的標準化紫外滅菌循環(huán)水箱內(nèi)。斑馬魚(雌雄性比例1：2)飼養(yǎng)在水箱中，水溫控制為(28±1) ℃，光照周期明暗比為14 h：10 h，控制飼養(yǎng)1個月左右開始收集魚卵。飼養(yǎng)水中加入營養(yǎng)鹽(294 mg·L-1CaCl2·2H2O、123.3 mg·L-1MgSO4·7H2O、63.0 mg·L-1NaHCO3和5.5 mg·L-1KCl)，pH 6.85～7.0，每日喂2次(每次大約10 mL吸管量)豐年蟲。

1.2儀器和試劑

水平電泳儀(DYY-6C，北京六一儀器廠)，UVP凝膠圖像分析儀(Vilber Lourmat)，CEX96TM PCR儀(Bio-Rad)，定量PCR儀器(American, ABI)，電子天平(VIC-412，賽多利斯)，臺式高速冷凍離心機(Allegra X-22R，德國貝克曼)，熒光體式顯微鏡(SteREO Lumar.V12，德國蔡司)，酶標儀(WD-2102A，杭州匯爾儀器設備有限公司)。

全氟辛烷磺酸鉀(PFOS，C8HF17KO3S，純度≥98%，Sigma公司)；二甲基亞砜(DMSO，≥99.9%，Sigma公司)；納米氧化鋅粒子分散液(CAS no:1314-13-2，<100 nm，Sigma公司)；測甲狀腺激素含量試劑盒，南京建成科技有限公司；Trizol試劑，PrimeScript RT reagents Kit試劑盒和SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒(TaKaRa)。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3實驗方法

1.3.1發(fā)育毒性測定

根據(jù)預實驗結果，PFOS的96 h-LC50為3.502 mg·L-1(95%的置信區(qū)間為2.369～5.051 mg·L-1)，Nano-ZnO的96 h-LC50為60 mg·L-1(95%的置信區(qū)間為44.16～83.35 mg·L-1)。實驗結果顯示胚胎暴露在1.6 mg·L-1PFOS溶液中與暴露在50 mg·L-1Nano-ZnO溶液中的死亡率相同均為25%。根據(jù)1：1等毒性配比，我們選擇Nano-ZnO(6.75、12.5、25 mg·L-1)、PFOS(0.2、0.4、0.8 mg·L-1)單獨暴露組和PFOS+Nano-ZnO(0.2+6.75、0.4+12.5、0.8+25 mg·L-1)復合暴露組進行實驗。暴露時間選擇為胚胎產(chǎn)出0 d至15 d。

以斑馬魚培養(yǎng)水為對照溶液，在500 mL燒杯中分別加入上述溶液200 mL，每個燒杯中隨機放入發(fā)育正常的200個斑馬魚胚胎，每個濃度設置3個重復。暴露試驗進行15 d，每天更換一次染毒液。每天觀察、記錄并挑出死亡個體。暴露結束后，首先在萬分之一電子天平上稱量2 mL空管重量，然后隨機將40條幼魚收集在離心管中，通過前后重量差計算每條幼魚的重量，每個濃度重復3次。在熒光體式顯微鏡上通過標尺測量每條幼魚的體長。將測完體重的幼魚儲存在-80 ℃冰箱中用于基因表達分析。

1.3.2甲狀腺激素測定

甲狀腺激素的提取參照Crane等[42]抽提黑頭呆魚(fathead minnow)甲狀腺素的方法。每個暴露濃度取50條幼魚加入預冷的0.5 mL的生理鹽水中勻漿。然后將勻漿的樣品用超聲破碎儀(100 W，10 min)破碎后，4 ℃、5 000 r·min-1離心10 min，收集上清液。在室溫下真空干燥過夜。所得樣品用0.05 mL甲醇、氯仿和巴比妥重新溶解。將溶解液4 ℃、3 500 r·min-1離心10 min，收集上清液真空干燥過夜。所得樣品保存于-80 ℃冰箱中。抽提效率是在樣品抽提前加入100 L放射性的I125標記T3和T4，抽提過程完全結束后再次檢測樣品內(nèi)的放射性物質(zhì)的剩余量來確定的。按照南京建成Elisa試劑盒的說明書進行，每個樣品3次重復。

教師要摒棄只灌輸理論知識的教學方法，學生平時積極參加體育課或者有關的體育活動是因為學生僅有的主動性來自對體育運動的喜愛。所以不能把體育課當成文化課的課程方式教學。教師應當明確確定體育教學方向，必須要讓學生明白體育課程設置的價值。促進學生能夠主動參與到體育學習和訓練過程中來。當代學生課業(yè)繁重，體育的作用對于學生有利無弊。

表1　下丘腦-垂體-甲狀腺軸(HPT軸)和甲狀腺素相關基因引物序列

1.3.3甲狀腺基因Real-time PCR測定

用Trizol抽提出斑馬魚的總RNA，利用核酸測定儀測出RNA濃度，UVP凝膠圖像分析儀分析RNA圖像，利用Prime Script RT reagents Kit試劑盒將總RNA反轉錄成cDNA；然后用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒進行Real-time PCR。以上實驗步驟均按說明書操作。實驗結果用2-ΔΔCt方法分析數(shù)據(jù)，引物序列見表1。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗結果均以“平均值±標準誤差”即(mean±SD)表示，使用Levene’s進行方差齊性檢驗。如果數(shù)據(jù)沒有通過測試，進行對數(shù)轉化，再次進行方差齊性檢驗。如果滿足方差齊性檢驗，采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析進行單因素方差分析(One Way ANOVA)。進一步進行組間兩兩比較時，采用Tukey’s檢驗，以P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2　結果與分析(Results and analysis)

2.1PFOS和Nano-ZnO暴露對斑馬魚的發(fā)育毒性

斑馬魚胚胎自受精開始，暴露15 d后，所有暴露組的存活率和畸形率統(tǒng)計結果如圖1所示。DMSO處理組與水對照組相比沒有顯著差異，所以助溶劑DMSO對斑馬魚發(fā)育、存活率和畸形率無顯著影響。由圖1(A)可見，隨著PFOS和Nano-ZnO暴露濃度的升高，單一處理組與復合處理組存活率均降低且呈現(xiàn)濃度依賴關系。其中0.8 mg·L-1PFOS單獨處理組和所有復合處理組與對照組相比差異顯著(P<0.05)，復合暴露組的存活率分別由對照組的75.16%±2.64%下降至41.66%±15.17%、42.66%±5.50%和31.33%±3.24%。所有Nano-ZnO單獨處理組雖與對照組相比略有降低，但差異不顯著，而與復合處理組與對照組相比差異顯著(P<0.05)。可見，復合處理能夠增加斑馬魚幼魚的死亡率。由圖1(B)可見，單獨和復合暴露均能引起幼魚的形態(tài)學異常， (PFOS 0.4 mg·L-1+Nano-ZnO 12.5 mg·L-1，)復合處理組的畸形率較其他2個復合處理組低，可能是由于實驗誤差造成，需要重復試驗次數(shù)，但整體呈現(xiàn)上升趨勢。(PFOS 0.2 mg·L-1+Nano-ZnO 6.75 mg·L-1)和(PFOS 0.8 mg·L-1+Nano-ZnO 25 mg·L-1)復合處理組的畸形率分別由對照組的4.03%±0.62%上升至21.07%±7.14%和24.16%±6.06% (P<0.05)。復合暴露引起的形態(tài)學變化如圖2所示。復合處理組引起斑馬魚的畸形率高于2種物質(zhì)單獨暴露引起的畸形率，結果表明在本實驗暴露濃度下2種物質(zhì)復合暴露對幼魚畸形率的誘導存在協(xié)同效應。

圖1　PFOS和Nano-ZnO不同濃度處理對斑馬魚幼魚存活率(A)和畸形率(B)的影響注：P 0.2表示0.2 mg·L-1 PFOS，Z 0.4表示0.4 mg·L-1 Nano-ZnO，P 0.2+Z 6.75表示PFOS 0.2 mg·L-1+Nano-ZnO 6.75 mg·L-1；*P<0.05和**P<0.01表示暴露組與對照組相比差異顯著；#P<0.05代表PFOS或Nano-ZnO單獨處理組與其相同濃度的復合處理組有顯著差異，下同。Fig. 1　The change of (A) surviving rate and (B) malformation rate of zebrafish larvae exposed to single and joint PFOS and Nano-ZnO Note: P 0.2 stands for 0.2 mg·L-1 PFOS, Z 0.4 stands for 0.4 mg·L-1 Nano-ZnO, P 0.2+ Z 6.75 stands for PFOS 0.2 mg·L-1+Nano-ZnO 6.75 mg·L-1; * P<0.05 and ** P<0.01 indicate significant differences between exposure groups and the corresponding control;#P<0.05 indicate significant differences between singe-exposure groups and the corresponding co-exposure groups; the same below.

圖3　PFOS和Nano-ZnO不同濃度處理對斑馬魚幼魚體長(A)和體重(B)的影響Fig. 3　The change of (A) body length and (B) body weight of zebrafish larvae exposed to single and joint PFOS and Nano-ZnO

圖3為PFOS和Nano-ZnO單獨處理組與復合處理組15 d后斑馬魚幼魚體長和體重的變化。如圖所示，DMSO處理組與水對照組相比沒有顯著差異。由圖3(A)所示，PFOS與Nano-ZnO單獨處理組的體長與對照組相比沒有顯著變化，且不存在劑量效應。但是在PFOS與Nano-ZnO復合處理組幼魚體長較對照組有下降趨勢，且呈現(xiàn)濃度依賴關系，同時(PFOS 0.8 mg·L-1+Nano-ZnO 25 mg·L-1) mg·L-1暴露組幼魚的體長較對照組顯著降低(P<0.05)，由對照組的(5.25±0.35) mm降至(4.58±0.05) mm。所有處理組幼魚的體重與對照組相比略有降低，但是均無顯著差異見圖3(B)。由實驗數(shù)據(jù)可以看出，PFOS和Nano-ZnO復合暴露對幼魚的發(fā)育毒性，主要表現(xiàn)在對存活率和畸形率的影響。

2.2PFOS和Nano-ZnO暴露對甲狀腺激素水平影響

從圖4(A)中可以看出，在PFOS單獨和復合處理組中T3的含量都呈現(xiàn)劑量濃度效應，在Nano-ZnO單獨處理組中T3的含量與對照組相比呈現(xiàn)上升趨勢。0.8 mg·L-1PFOS和25 mg·L-1Nano-ZnO單獨與復合暴露組與對照組相比都差異顯著，由對照組的(0.75±0.02) ng·g-1，分別上升至(1.29±0.01) ng·g-1、(1.19±0.04) ng·g-1和(1.45±0.04) ng·g-1。而在(PFOS 0.8 mg·L-1+Nano-ZnO 25 mg·L-1)復合暴露組中，T3的含量大于對應的單獨暴露組。由圖4(B)所示，T4的含量在單獨處理組中與對照組相比略有減少但無顯著差異。并且在PFOS單獨暴露組中，不存在劑量效應。在(PFOS 0.4 mg·L-1+Nano-ZnO 12.5 mg·L-1)和(PFOS 0.8 mg·L-1+Nano-ZnO 25 mg·L-1)復合暴露組中，T4的含量分別為(46.48±3.83) ng·g-1和(43.69±1.17) ng·g-1與對照組的(63.76±0.34) ng·g-1、0.4 mg·L-1PFOS單獨處理組的(58.67±6.18) ng·g-1和0.8 mg·L-1PFOS單獨處理組的(61.96±6.17) ng·g-1組相比差異顯著(P<0.05)。由此可知，PFOS和Nano-ZnO復合暴露對斑馬魚幼魚T3含量的誘導起促進作用，而對T4含量的誘導起抑制作用，而DMSO處理組與水對照組相比沒有顯著差異。

圖4　PFOS和Nano-ZnO不同濃度處理對斑馬魚幼魚體內(nèi)甲狀腺激素T3(A)和T4(B)含量的影響Fig. 4　The whole body content of T3 (A) and T4 (B) of zebrafish larvae exposed to single and joint PFOS and Nano-ZnO

圖5　PFOS和Nano-ZnO不同濃度處理對斑馬魚幼魚CRH(A)和TSHβ(B)基因表達的影響Fig. 5　The transcriptional level of CRH (A) and TSHβ (B) of zebrafish larvae exposed to single and joint PFOS and Nano-ZnO

2.3PFOS和Nano-ZnO暴露對斑馬魚HPT軸相關基因表達影響

圖5顯示了PFOS和Nano-ZnO暴露15 d對幼魚體內(nèi)CRH與TSHβ基因表達的影響。如圖5(A)所示，隨著暴露濃度的升高，PFOS低濃度處理組與Nano-ZnO單獨處理組中CRH基因表達與對照組相比無顯著差異。在0.8 mg·L-1PFOS單獨處理組中，幼魚體內(nèi)CRH基因表達顯著上調(diào)至對照組的3.54倍(P<0.05)。在(PFOS 0.4 mg·L-1+Nano-ZnO 12.5 mg·L-1)和(P 0.8 mg·L-1+Z 25 mg·L-1)處理組中，幼魚體內(nèi)CRH基因表達顯著上調(diào)分別至對照組的2.56倍和4.15倍(P<0.05)。其中，0.4 mg·L-1PFOS和25 mg·L-1Nano-ZnO單獨處理組與其對應的復合處理組相比差異顯著(P<0.05)。如圖5(B)所示，在Nano-ZnO單獨處理組中，TSHβ基因的轉錄水平與對照組相比略有減少但沒有顯著差異。在PFOS單獨與復合處理組中，隨著暴露濃度的升高TSHβ基因的轉錄水平顯著下降(P<0.05)。由此可見，Nano-ZnO單獨暴露對TSHβ基因的表達水平?jīng)]有顯著影響，而復合暴露對TSHβ基因表達的抑制作用明顯。

圖6　PFOS和Nano-ZnO不同濃度處理對斑馬魚幼魚NIS(A)、TG(B)和TPQ(C)基因表達的影響Fig. 6　The transcriptional level of NIS (A), TG (B) and TPQ (C) of zebrafish larvae exposed to single and joint PFOS and Nano-ZnO

如圖6(A)所示，NIS基因表達在PFOS和Nano-ZnO單獨處理組中相對于對照組沒有顯著上調(diào)。而在復合暴露組中相對于對照組分別顯著上調(diào)了2.07、1.78和3.12倍(P<0.05)。NIS基因表達在(PFOS 0.8 mg·L-1+Nano-ZnO 25 mg·L-1)暴露組與單獨處理組相比上調(diào)差異顯著(P<0.05)。如圖6(B)所示，在所有PFOS單獨處理組中，TG基因表達相對于對照組下調(diào)趨勢明顯。在復合處理組中，隨著Nano-ZnO濃度的提高，TG基因表達分別下調(diào)至對照組的0.39倍、0.36倍和0.20倍(P<0.05)。在Nano-ZnO單獨處理組中，TG基因表達相對于對照組略有下調(diào)但不顯著。如圖6(C)所示，TPO基因表達在所有處理組中，都沒有劑量效應，并且與對照組相比差異不顯著?？梢姡?種污染物復合暴露對NIS基因的表達誘導存在相互協(xié)同效應。對TG基因的表達存在抑制作用，而對TPO基因的表達沒有影響。

3　討論(Discussion)

PFOS在水環(huán)境中具有持久性及內(nèi)分泌干擾性，這些特性會影響魚體內(nèi)的正常甲狀腺功能。在本研究中，我們對PFOS和Nano-ZnO聯(lián)合暴露對斑馬魚甲狀腺干擾功能進行了測試和評估。

甲狀腺激素在幼魚的早期發(fā)育過程中起著重要作用。Liu等[43](2002)發(fā)現(xiàn)甲狀腺激素在斑馬魚從胚胎到幼魚轉化階段中起著至關重要的作用。Zhao等[21](2013)報道了Nano-ZnO對斑馬魚幼魚發(fā)育毒性的誘導和Shi等[32](2009)發(fā)現(xiàn)0.4 mg·L-1PFOS能夠顯著抑制斑馬魚幼魚的生長，與我們的研究結果相吻合。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)PFOS和Nano-ZnO高劑量單獨以及兩者復合暴露組顯著抑制斑馬魚幼魚的生長發(fā)育，并且復合暴露組對斑馬魚幼魚的發(fā)育毒性抑制作用大于單獨暴露組。

研究結果表明PFOS和Nano-ZnO復合暴露能顯著影響斑馬魚幼魚體內(nèi)甲狀腺激素的分泌，對其產(chǎn)生甲狀腺毒性。Wang等[44](2011)發(fā)現(xiàn)PFOS和四溴二苯醚復合暴露導致了阿爾維斯塔小鼠親本和子代血清中T3和T4含量的變化。在本研究中，T4的含量在單獨暴露組中與對照組相比沒有發(fā)生顯著改變，而復合暴露組顯著抑制了T4的含量。

在幼魚的發(fā)育過程中，CRH基因的表達上調(diào)歸因于外界刺激垂體合成促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)并調(diào)節(jié)HPT軸[29]。TSHβ是一種垂體激素，能夠刺激甲狀腺產(chǎn)生T4。T4進一步轉換為三碘甲狀腺氨酸(T3)。T3是比較活躍的甲狀腺激素，刺激有機體的新陳代謝過程[45]。在本研究中，最高濃度復合暴露組中，CRH基因表達與對照組相比顯著上調(diào)。而TSHβ基因的轉錄水平在PFOS暴露組中顯著下調(diào)。結果說明了PFOS和Nano-ZnO共同暴露可能擾亂了甲狀腺激素體內(nèi)平衡并可增強毒性效果。

NIS能夠調(diào)節(jié)甲狀腺卵泡細胞對碘化物的吸收，這個過程是合成甲狀腺激素的第一步[27]。TG是一種甲狀腺卵泡細胞產(chǎn)生的二聚蛋白，通過這種蛋白可生甲狀腺激素T4和T3[46]。TPO是一種甲狀腺分泌的膠質(zhì)化酶，由TSH刺激產(chǎn)生[47]，同時催化TG中絡氨酸殘碘化并耦合成為碘甲腺原氨酸[48]。本研究中，復合暴露組中NIS基因的表達顯著上調(diào)，而TG基因的表達顯著下調(diào)。在所有暴露組中，TPO基因的表達沒有發(fā)生顯著的變化，而TG基因在PFOS暴露組中出現(xiàn)了顯著的下調(diào)。TPO基因受PFOS和Nano-ZnO脅迫的影響較小。Yu等[49](2009)也發(fā)現(xiàn)斯普拉格-道利小鼠甲狀腺內(nèi)TPO酶的活性未受PFOS暴露影響。TG基因在幼魚發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用。我們發(fā)現(xiàn)PFOS和Nano-ZnO暴露都能改變斑馬魚體內(nèi)TG基因的表達。復合暴露能通過改變與下丘腦-垂體-甲狀腺軸相關基因的表達，進而影響斑馬魚幼魚的甲狀腺功能。

結果證明PFOS和Nano-ZnO共同暴露會顯著影響斑馬魚幼魚的發(fā)育，干擾甲狀腺激素的分泌，改變HPT軸相關基因的表達水平。表面活性劑PFOS能夠破壞細胞膜的脂質(zhì)結構[50]，使ZnO納米粒子更易穿透細胞膜毒害生物。有研究發(fā)現(xiàn)PFOS和一些納米粒子可以形成一種阻力機制，這種機制的產(chǎn)生可以增強細胞毒性[51]。通過這些理論和實驗基礎，我們認為PFOS和Nano-ZnO在試驗濃度范圍內(nèi)對斑馬魚甲狀腺的聯(lián)合毒性作用類型為協(xié)同作用。復合污染未來的研究重點應該放在污染物在水中的相互作用機制以及污染物在魚體內(nèi)的代謝分解途徑。

通訊作者：尤宏(1961-)，男，黑龍江省哈爾濱市人，教授，博士，工業(yè)廢水深度處理與回用技術；近五年來主持和參加包括國家“973計劃”課題、國家“863計劃”課題、國家科技重大專項課題、省科技攻關項目、國際合作項目課題等10余項。獲得黑龍江省科技進步二等獎、環(huán)境保護部環(huán)?？萍级泉劦仁〔考壙蒲歇?項。發(fā)表論文60余篇，獲得授權專利5件，軟件著作權2件。

[1]Key B D, Howell R D, Criddle C S. Fluorinated organics in the biosphere [J]. Environmental Science & Technology, 1997, 31(9): 2445-2454

[2]Renner R. Growing concern over perfluorinated chemicals [J]. Environmental Science & Technology, 2001, 35(7): 154A-160A

[3]Giesy J P, Kannan K. Global distribution of perfluorooctane sulfonate in wild life [J]. Environmental Science & Technology, 2001, 35(7): 1339-1342

[4]Kannan K, Choi J W, Iseki N, et al. Concentrations of perfluorinated acids in livers of birds from Japan and Korea [J]. Chemosphere, 2002, 49(3): 225-231

[4]Lein N P H, Fujii S, Tanaka S, et al. Contamination of perfluorooctane sulfonate (PFOS) and perfluorooctanoate (PFOA) in surface water of the Yodo River basin (Japan) [J]. Desalination, 2008, 226(1-3): 338-347

[6]Giesy J P, Kannan K. Perfluorochemical surfactants in the environment [J]. Environmental Science & Technology, 2002, 36(7): 146A-152A

[7]So M K, Taniyasu S, Yamashita N, et al. Perfluorinated compounds in coastal waters of Hong Kong, South China, and Korea [J]. Environmental Science & Technology, 2004, 38(15): 4056-4063

[8]Apelberg B J, Goldman L R, Calafat A M, et al. Determinants of fetal exposure to polyfluoroalkyl compounds in Baltimore, Maryland [J]. Environmental Science & Technology, 2007, 41(11): 3891-3897

[9]Inoue K, Okada F, Ito R, et al. Perfluorooctane sulfonate (PFOS) and related perfluorinated compounds in human maternal and cord blood samples: Assessment of PFOS exposure in a susceptible population during pregnancy [J]. Environmental Health Perspectives, 2004, 112(11):1204-1207

[10]Karrman A, Ericson I, van Bavel B, et al. Exposure of perfluorinated chemicals through lactation: Levels of matched human milk and serum and a temporal trend, 1996-2004, in Sweden [J]. Environmental Health Perspectives, 2007, 115(2): 226-230

[11]Chen T, Zhang L, Yue J Q, et al. Prenatal PFOS exposure induces oxidative stress and apoptosis in the lung of rat off-spring [J]. Reproductive Toxicology, 2012, 33(4): 538-545

[12]Keiter S, Baumann L, Farber H, et al. Long-term effects of a binary mixture of perfluorooctane sulfonate (PFOS) and bisphenol A (BPA) in zebrafish (Danio rerio)[J]. Aquatic Toxicology, 2012, 118-119: 116-129

[13]Kim W K, Lee S K, Jung J. Integrated assessment of biomarker responses in common carp (Cyprinus carpio) exposed to perfluorinated organic compounds [J]. Journal Hazardous Materials, 2010, 180(1-3): 395-400

[14]劉曉暉, 胡宏, 李雙月, 等. 全氟辛烷磺酸神經(jīng)發(fā)育毒性機制研究進展[J]. 生態(tài)毒理學報, 2013, 8(5): 643-649

Liu X H, Hu H, Li S Y, et al. Research progress on mechanisms in the developmental neurotoxicity of PFOS [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2013, 8(5): 643-649 (in Chinese)

[15]端正花, 王勛功, 王華, 等. 全氟辛烷羧酸(PFOA)與全氟辛烷磺酸(PFOS)的細胞毒性效應[J]. 生態(tài)毒理學報, 2014, 9(2): 353-357

Duan Z H, Wang X G, Wang H, et al. The cytotoxic effect of PFOA and PFOS [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2014, 9(2): 353-357 (in Chinese)

[16]Zhang X, Guo Q, Cui D. Recent advances in nanotechnology applied to biosensors [J]. Sensors (Basel), 2009, 9(2):1033-1053

[17]Lanone S, Boczkowski J. Biomedical applications and potential health risks of nanomaterials:Molecular mechanisms [J]. Current Molecular Medicine, 2006, 6(6): 651-663

[18]Johnston B D, Scown T M, Moger J, et al. Bioavailability of nanoscale metal oxides TiO(2), CeO(2), and ZnO to fish [J]. Environmental Science & Technology, 2010, 44(3): 1144-1151

[19]Sharma V, Anderson D, Dhawan A. Zinc oxide nanoparticles induce oxidative DNA damage and ROS-triggered mitochondria mediated apoptosis in human liver cells (HepG2) [J]. Apoptosis (London), 2012, 17(8): 852-870

[20]Gojova A, Guo B, Kota R S, et al. Induction of inflammation in vascular endothelial cells by metal oxide nanoparticles: Effect of particle composition [J]. Environmental Health Perspectives, 2007, 115(3): 403-409

[21]Zhao X, Wang S, Wu Y, et al. Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish [J]. Aquatic Toxicology, 2013, 136-137: 49-59

[22]劉慧, 朱方偉, 尹穎, 等. 納米ZnO對鯽魚肝臟的毒性[J]. 生態(tài)毒理學報, 2010, 5(5): 698-703

Liu H, Zhu F W, Yi Y, et al. Toxicity of Nano-ZnO onliver of goldfish (Carassius auratus) [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2010, 5(5): 698-703 (in Chinese)

[23]Erik B, Havitcioglu H, Aktan S, et al. Biomechanical properties of human hair with different parameters [J]. Skin Research Technology, 2008, 14(2): 147-151,.

[24]Kawakami Y, Nozaki J, Seoka M, et al. Characterization of thyroid hormones and thyroid hormone receptors during the early development of Pacific bluefin tuna (Thunnus orientalis)[J]. General and Comparative Endocrinology, 2008, 155(3): 597-606

[25]Marchand O, Duffraisse M, Triqueneaux G, et al. Molecular cloning and developmental expression patterns of thyroid hormone receptors and T3 target genes in the turbot (Scophtalmus maximus) during post-embryonic development [J]. General and Comparative Endocrinology, 2004, 135(3): 345-357

[26]Walpita C N, Van der Geyten S, Rurangwa E, et al. The effect of 3,5,3'-triiodothyronine supplementation on zebrafish (Danio rerio) embryonic development and expression of iodothyronine deiodinases and thyroid hormone receptors [J]. General and Comparative Endocrinology, 2007, 152(2-3): 206-214

[27]Dohan O, De la Vieja A, Paroder V, et al. The sodium/iodide Symporter (NIS): Characterization, regulation, and medical significance [J]. Endocrine Reviews, 2003, 24(1): 48-77

[28]Eskandari S, Loo D D, Dai G, et al. Thyroid Na+/I- symporter. Mechanism, stoichiometry, and specificity [J]. Journal of Biological Chemistry, 1997, 272(43): 27230-27238

[29]De Groef B, Van der Geyten S, Darras V M, et al. Role of corticotropin-releasing hormone as a thyrotropin-releasing factor in non-mammalian vertebrates [J]. General and Comparative Endocrinology, 2006, 146(1): 62-68

[30]Lau C, Thibodeaux J R, Hanson R G, et al. Exposure to perfluorooctane sulfonate during pregnancy in rat and mouse. II: Postnatal evaluation [J]. Toxicological Sciences, 2003, 74(2): 382-392

[31]Ankley G T, Kuehl D W, Kahl M D, et al. Reproductive and developmental toxicity and bioconcentration of perfluorooctanesulfonate in a partial life-cycle test with the fathead minnow (Pimephales promelas) [J]. Environmental Toxicology and Chemistry, 2005, 24(9): 2316-2324

[32]Shi X, Liu C, Wu G, et al. Waterborne exposure to PFOS causes disruption of the hypothalamus-pituitary-thyroid axis in zebrafish larvae [J]. Chemosphere, 2009, 77(7): 1010-1018

[33]Du Y, Shi X, Liu C, et al. Chronic effects of water-borne PFOS exposure on growth, survival and hepatotoxicity in zebrafish: A partial life-cycle test [J]. Chemosphere, 2009, 74(5): 723-729

[34]Varghese S, Shameena B, Oommen O V. Thyroid hormones regulate lipid peroxidation and antioxidant enzyme activities in Anabas testudineus (Bloch) [J]. Comparative Biochemistry and Physiology B-Biochemisty Molecular Biology, 2001, 128(1): 165-171

[35]Wang J, Deng X, Zhang F, et al. ZnO nanoparticle-induced oxidative stress triggers apoptosis by activating JNK signaling pathway in cultured primary astrocytes [J]. Nanoscale Research Letters, 2014, 9(1): 117

[36]Zhang W, Sun X, Chen L, et al. Toxicological effect of joint cadmium selenium quantum dots and copper ion exposure on zebrafish [J]. Environmental Toxicology and Chemistry, 2012, 31(9): 2117-2123

[37]Zhang W, Miao Y, Lin K, et al. Toxic effects of copper ion in zebrafish in the joint presence of CdTe QDs [J]. Environmental Pollution, 2013, 176: 158-164

[38]Thienpont B, Barata C, Raldua D. Modeling mixtures of thyroid gland function disruptors in a vertebrate alternative model, the zebrafish eleuthero embryo [J]. Toxicology and Applied Pharmacology, 2013, 269(2): 169-175

[39]Altenburger R, Scholz S, Schmitt-Jansen M, et al. Mixture toxicity revisited from a toxicogenomic perspective [J]. Environmental Science & Technology, 2012, 46(5): 2508-2522

[40]Sarigiannis D A, Hansen U. Considering the cumulative risk of mixtures of chemicals -A challenge for policy makers [J]. Environmental Health, 2012, 11(S1): S18

[41]Du J, Wang S, You H, et al. Developmental toxicity and DNA damage to zebrafish induced by perfluorooctane sulfonate in the presence of ZnO nanoparticles [J]. Environmental Toxicology, DOI: 10.1002/tox.22050

[42]Crane H M, Pickford D B, Hutchinson T H, et al. Developmental changes of thyroid hormones in the fathead minnow, Pimephales promelas [J]. General and Comparative Endocrinology, 2004, 139(1): 55-60

[43]Liu Y W, Chan W K. Thyroid hormones are important for embryonic to larval transitory phase in zebrafish [J]. Differentiation, 2002, 70(1): 36-45

[44]Wang F, Liu W, Jin Y, et al. Interaction of PFOS and BDE-47 co-exposure on thyroid hormone levels and TH-related gene and protein expression in developing rat brains [J]. Toxicology Sciences, 2011, 121(2): 279-291

[45]Nishiyama R H. Overview of surgical pathology of the thyroid gland [J].World Journal of Surgery, 2000, 24(8): 898-906

[46]Venturi S, Donati F M, Venturi A, et al. Environmental iodine deficiency: A challenge to the evolution of terrestrial life? [J]. Thyroid, 2000, 10(8): 727-729

[47]Ruf J, Carayon P. Structural and functional aspects of thyroid peroxidase [J]. Archives of Biochemistry and Biophysics, 2006, 445(2): 269-277

[48]Dunn J T, Dunn A D. Update on intrathyroidal iodine metabolism [J]. Thyroid, 2001, 11(5): 407-414

[49]Yu W G, Liu W, Jin Y H. Effects of perfluorooctane sulfonate on rat thyroid hormone biosynthesis and metabolism [J]. Environmental Toxicology and Chemistry, 2009, 28(5): 990-996

[50]Wang D, Lin Z, Yao Z, et al. Surfactants present complex joint effects on the toxicities of metal oxide nanoparticles [J]. Chemosphere, 2014, 108: 70-75

[51]Anselmo H M, van den Berg J H, Rietjens I M. Inhibition of cellular efflux pumps involved in multi xenobiotic resistance (MXR) in echinoid larvae as a possible mode of action for increased ecotoxicological risk of mixtures [J]. Ecotoxicology, 2012, 21: 2276-2287

◆

Co-Exposure to PFOS and Nano-ZnO Disrupted the Hypothalamus-Pituitary-Thyroid Axis in Zebrafish Larvae

Du Jia1,2, Wang Shutao1, You Hong1,*

1. State Key Laboratory of Urban Water Resource and Environment, Harbin Institute of Technology, Harbin 150090, China 2. School of Public Health, Jia Mu Si University, Jiamusi 154007, China

11 August 2010accepted 1 October 2010

Perfluorooctanesulphonic acid potassium salt (PFOS) and ZnO nanoparticles (Nano-ZnO) are widely distributed in the environment. However, the potential toxicity of co-exposure to PFOS and Nano-ZnO remains to be fully elucidated. Our present study investigated the effects of co-exposure to PFOS and Nano-ZnO on the hypothalamic-pituitary-thyroid (HPT) axis in zebrafish. The embryos were exposed to PFOS (0.2, 0.4, 0.8 mg·L-1) single solutions, Nano-ZnO (6.75, 12.5, 25 mg·L-1) single solutions and PFOS plus Nano-ZnO (0.2+6.75, 0.4+12.5, 0.8+25 mg·L-1) mixture solutions for 15 days. We analyzed development toxicity, the whole-body content of TH and the expression of genes (corticotropin-releasing factor (CRF), thyroid-stimulating hormone (TSHβ), sodium/iodide symporter (NIS), thyroglobulin (TG), thyroid peroxidase (TPO) related to the HPT axis. Compared with single-exposure groups, the body length and survival rate decreased, the malformation rates increased in co-exposure groups. The triiodothyronine (T3) levels increased and the thyroxine (T4) content decreased in co-exposure groups. Compared with the exposure to PFOS and Nano-ZnO alone, the expression of genes (CRF and NIS) significantly up-regulated and the expression of genes (TSHβ and TG) significantly down-regulated in co-exposure groups. In addition, the expression of TPO gene was unchanged in both the single and co-exposure groups. Our results were the first evidence for the thyroid-disrupting effects of PFOS and Nano-ZnO co-exposure in zebrafish. The results also provide insight into the mechanism of disruption of the thyroid status by PFOS and Nano-ZnO.

perfluorooctanesulphonic acid potassium salt (PFOS); ZnO nanoparticles (Nano-ZnO); zebrafish; hypothalamic-pituitary-thyroid axis; thyroid hormone

哈爾濱工業(yè)大學城市水資源與水環(huán)境國家重點實驗室導向類自主課題(2013DX09)

杜佳(1986-)，女，博士，研究方向為環(huán)境毒理學，E-mail: dujia532158064@163.com

Corresponding author)， E-mail: youhong@hit.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20150528004

2015-05-28錄用日期：2015-08-25

1673-5897(2015)6-144-10

X171.5

A

杜佳, 王樹濤, 尤宏. 全氟辛烷基磺酸鉀(PFOS)和納米氧化鋅(Nano-ZnO)復合暴露對斑馬魚下丘腦-垂體-甲狀腺軸功能的影響[J]. 生態(tài)毒理學報，2015, 10(6): 144-153

Du J, Wang S T, You H. Co-exposure to PFOS and nano-ZnO disrupted the hypothalamus-pituitary-thyroid axis in zebrafish larvae [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(6): 144-153 (in Chinese)