納米二氧化鈦(nTiO2)與雙酚A對(duì)斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)的聯(lián)合毒性效應(yīng)

趙麗紅，朱小山,，王一翔，晉慧，王江新，王超，勞永民，姜玥璐，陶益，周進(jìn)，蔡中華

1. 清華大學(xué)環(huán)境學(xué)院，北京 100084 2. 清華大學(xué)深圳研究生院海洋學(xué)部，深圳 518055 3. 清華大學(xué)生命學(xué)院，北京 100084 4. 深圳大學(xué)生命學(xué)院，深圳 518060 5. 香港高等科技教育學(xué)院，香港特別行政區(qū) 6. 清華大學(xué)深圳研究生院能源與環(huán)境學(xué)部，深圳 518055

納米二氧化鈦(nTiO2)與雙酚A對(duì)斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)的聯(lián)合毒性效應(yīng)

趙麗紅1,2，朱小山1,2,，王一翔1,2，晉慧2,3，王江新4，王超5，勞永民2，姜玥璐2，陶益6，周進(jìn)2，蔡中華2

1. 清華大學(xué)環(huán)境學(xué)院，北京 100084 2. 清華大學(xué)深圳研究生院海洋學(xué)部，深圳 518055 3. 清華大學(xué)生命學(xué)院，北京 100084 4. 深圳大學(xué)生命學(xué)院，深圳 518060 5. 香港高等科技教育學(xué)院，香港特別行政區(qū) 6. 清華大學(xué)深圳研究生院能源與環(huán)境學(xué)部，深圳 518055

納米二氧化鈦(nTiO2)在被人們廣泛使用的同時(shí)，其潛在的環(huán)境影響也受到越來(lái)越多的關(guān)注。為深入探討nTiO2與環(huán)境中現(xiàn)有污染物的相互作用及生物效應(yīng)，以斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)為受試生物，按照毒性單位法、相加指數(shù)法和混合毒性指數(shù)法，研究了nTiO2與雙酚A(BPA，一種常見(jiàn)的環(huán)境類雌激素)的聯(lián)合毒性效應(yīng)。結(jié)果顯示，nTiO2與BPA對(duì)S. obliquus生長(zhǎng)的72 h半抑制濃度(EC50)分別為28.7 mg·L-1與1.81 mg·L-1。而nTiO2與BPA共存時(shí)，在不同毒性比(4:1，3:1，2:1，1:1，1:2和1:3)下，其聯(lián)合毒性作用(以BPA計(jì))的72 h EC50值分別為2.198，1.58，1.153，0.428，0.306和0.189 mg·L-1。兩者的聯(lián)合毒性作用不僅僅是簡(jiǎn)單的相加，而是隨著兩者毒性比的變化，由拮抗作用轉(zhuǎn)變?yōu)橄嗉幼饔?，繼而轉(zhuǎn)變?yōu)閰f(xié)同作用。這表明，nTiO2進(jìn)入環(huán)境后與現(xiàn)有污染物的毒性比(濃度比)可能是其聯(lián)合毒性作用模式的一個(gè)重要影響因素。

納米二氧化鈦；雙酚A；斜生柵藻；聯(lián)合毒性

人工納米材料(manufactured nanomaterials，MNMs)是指至少有一維方向上的粒徑處于納米尺度范圍(1～100nm)，且具有高度均勻性的材料[1-2]。MNMs由于其尺寸較小，結(jié)構(gòu)特殊，因此具備多種優(yōu)異的物理化學(xué)特性，如小尺寸效應(yīng)，巨大的表面活性，界面效應(yīng)，量子效應(yīng)等[3-4]。MNMs已經(jīng)在社會(huì)生產(chǎn)和生活方面獲得了廣泛地應(yīng)用。納米二氧化鈦(nanoscale titanium dioxide，nTiO2)是當(dāng)前產(chǎn)量最大的MNMs之一，已廣泛應(yīng)用于化妝品、醫(yī)藥、涂料、環(huán)保等多個(gè)領(lǐng)域[5-8]。廣泛的使用以及不斷增加的產(chǎn)量，使nTiO2不可避免會(huì)進(jìn)入到環(huán)境之中。近年來(lái)，nTiO2已在表面徑流及污水中被檢測(cè)到[9-10]，美國(guó)具有代表性的十處污水處理廠進(jìn)水中nTiO2的濃度為181～1 233 μg·L-1[11]。研究表明，nTiO2進(jìn)入水環(huán)境后不僅會(huì)對(duì)水生生物產(chǎn)生一定的毒性[12-20]，還與環(huán)境中的現(xiàn)有污染物發(fā)生相互作用，對(duì)現(xiàn)有污染物的遷移、轉(zhuǎn)化、歸趨以及相應(yīng)的生物和生態(tài)效應(yīng)產(chǎn)生影響[12, 20-22]。例如，Zhu等[21]發(fā)現(xiàn)2 mg·L-1的nTiO2可以使三丁基錫(TBT)對(duì)九孔鮑(Haliotis diversicolor supertexta)胚胎的毒性增加20倍。Tian等[22]也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象，即nTiO2的存在可使毛蚶(Scapharca subcrenata)對(duì)菲(Phe)的累積相比Phe單獨(dú)存在時(shí)增加1.7倍，表明nTiO2作為載體促進(jìn)了雙殼類動(dòng)物對(duì)Phe的吸收。在Zhang等[23]的研究中，nTiO2對(duì)重金屬Cd有很強(qiáng)的吸附性，且nTiO2能使鯉魚(Carp)對(duì)Cd的累積較Cd單獨(dú)存在時(shí)增加146%。但是上述研究更多的關(guān)注單一納米材料濃度(特別是無(wú)明顯生物效應(yīng))下對(duì)現(xiàn)有污染物毒性效應(yīng)的影響[13, 24-26]，未考慮到實(shí)際環(huán)境中MNMs與現(xiàn)有污染物之間復(fù)雜多變的濃度比例及相互作用模式。為進(jìn)一步探索MNMs與環(huán)境中現(xiàn)有污染物的相互作用及其生物效應(yīng)，本文選取典型MNMs(nTiO2)和有機(jī)污染物雙酚A(BPA，一種常見(jiàn)的環(huán)境類雌激素)，采用三種經(jīng)典的聯(lián)合毒性評(píng)價(jià)方法(毒性單位法、相加指數(shù)法、混合毒性指數(shù)法)[27-32]，考察不同毒性比(濃度比)下兩者共存時(shí)對(duì)模式生物斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)的聯(lián)合毒性效應(yīng)。研究結(jié)果為深入理解MNMs的潛在環(huán)境效應(yīng)和健康風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)一步提高M(jìn)NMs的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)管理提供基礎(chǔ)。

1　材料與方法(Materials and methods)

1.1實(shí)驗(yàn)材料及儲(chǔ)備液

nTiO2白色粉末購(gòu)自南京埃普瑞納米材料有限公司，平均粒徑為15 nm，銳鈦礦型，純度大于99.5%。BPA購(gòu)自BIO Basic Inc(Canada)，純度為99.0%。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)優(yōu)級(jí)純或分析純，純度均高于99.0%。玻璃儀器在使用前均用10%濃硝酸浸泡48 h，并用去離子水沖洗干凈，高溫高壓(121 ℃,15 min)滅菌后待用。

取1 g nTiO2溶于100 mL OECD 201藻類培養(yǎng)基[33]中，超聲10 min后靜置5 min，反復(fù)3次，配成10 g·L-1的nTiO2母液備用。稱取5 g BPA溶解至50 mL二甲基亞砜(DMSO)中，配成100 g·L-1的BPA儲(chǔ)備液。實(shí)驗(yàn)前用OECD 201藻類培養(yǎng)基逐級(jí)稀釋各儲(chǔ)備液以獲得所需的實(shí)驗(yàn)液。

1.2nTiO2的透射電鏡(transmission electron microscope，TEM)檢測(cè)

分別用OECD 201藻類培養(yǎng)基稀釋nTiO2與BPA儲(chǔ)備液，使兩者混合后的濃度分別為50 mg·L-1與2 mg·L-1。將該混合樣品，置于搖床上(SHIPING SPH-310A, Shanghai)，轉(zhuǎn)速為150 r·min-1。分別于0 h及72 h，用移液器移去1 mL樣品至含碳膜銅網(wǎng)上，并放置于40 ℃烘箱內(nèi)干燥，干燥后，用透射電鏡(TEM，F(xiàn)EI Tecnai G2 F30，美國(guó))觀察nTiO2的團(tuán)聚狀態(tài)、粒徑、晶型、形貌等特征。

1.3受試生物及其培養(yǎng)

受試生物選用模式生物斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)。S. obliquus由南開大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院環(huán)境生物研究室提供，并參照OECD 201標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為26 ℃，光照強(qiáng)度約為4 000±200 lux，光暗比為14:10。為與毒性實(shí)驗(yàn)保持一致，S. obliquus的培養(yǎng)在搖床(SHIPING SPH-310A, Shanghai)上進(jìn)行，轉(zhuǎn)速為150 r·min-1。

1.4nTiO2與BPA的單獨(dú)毒性實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)方法參照朱小山等[34]的研究。首先配制藻試驗(yàn)液：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期長(zhǎng)勢(shì)旺盛的藻，用新鮮無(wú)菌OECD 201培養(yǎng)基稀釋至2×104cell·mL-1，待用。然后配制nTiO2/BPA試驗(yàn)液：同樣用新鮮無(wú)菌OECD 201培養(yǎng)基逐級(jí)稀釋nTiO2/BPA母液，得到一系列不同濃度的試驗(yàn)液，使其濃度為實(shí)驗(yàn)濃度的2倍。將藻試驗(yàn)液與一系列nTiO2/BPA試驗(yàn)液等體積混合，配成系列nTiO2/BPA測(cè)試液(終體積100 mL)，其中S. obliquus的初始濃度為1×104cell·mL-1。在nTiO2測(cè)試液中，nTiO2濃度分別為0(對(duì)照)，0.5，1，2.5，5，10，50，100 mg·L-1。在BPA測(cè)試液中，BPA的濃度為0(對(duì)照)，0.2，0.5，1,5，10，25 mg·L-1。BPA測(cè)試液中含有體積比最高為0.01%的DMSO助溶劑。預(yù)實(shí)驗(yàn)表明，該濃度DMSO對(duì)S. obliquus的生長(zhǎng)沒(méi)有顯著影響。

測(cè)試液培養(yǎng)條件與文獻(xiàn)[34]類似。為避免不同光照的影響，每隔2 h調(diào)整錐形瓶的位置以確保受光均勻。實(shí)驗(yàn)期間，每隔24 h于超凈工作臺(tái)取一定量藻液按血球計(jì)數(shù)法測(cè)定藻細(xì)胞濃度。實(shí)驗(yàn)持續(xù)72 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，依據(jù)OECD標(biāo)準(zhǔn)方法[33]計(jì)算不同處理中藻類的生長(zhǎng)抑制率，并計(jì)算72 h EC50。

1.5nTiO2與BPA的聯(lián)合毒性實(shí)驗(yàn)

Bliss[27]最早提出了聯(lián)合作用理論，他將聯(lián)合毒性作用分為了相加聯(lián)合作用、獨(dú)立聯(lián)合作用、協(xié)同作用以及拮抗作用。聯(lián)合毒性模式又被學(xué)者相繼補(bǔ)充和完善。目前，常用的聯(lián)合毒性作用類型分為：簡(jiǎn)單相加、協(xié)同作用、部分相加、單獨(dú)作用、拮抗作用[27-28]。本文主要采用毒性單位法(TU)、相加指數(shù)法(AI)、混合毒性指數(shù)法(MTI)3種常見(jiàn)的聯(lián)合毒性評(píng)價(jià)方法考察不同毒性比下nTiO2與BPA對(duì)S. obliquus的聯(lián)合毒性效應(yīng)。上述3種方法均規(guī)定污染物各自的EC50為1個(gè)毒性單位(即1 TU)，則對(duì)濃度為C的污染物而言，其在實(shí)驗(yàn)中的毒性單位為C/EC50。在本實(shí)驗(yàn)中，為考察不同毒性比下BPA與nTiO2的聯(lián)合毒性作用，設(shè)置BPA與nTiO2的毒性比由大到小依次為4:1，3:1，2:1，1:1，1:2和1:3。在每一種毒性比內(nèi)，依據(jù)污染物濃度的高低，分別設(shè)置7個(gè)濃度組合(表1)，考察各濃度組合對(duì)S. obliquus的生長(zhǎng)抑制情況，計(jì)算在該毒性比下的EC50。得到不同毒性比下的EC50后，根據(jù)文獻(xiàn)方法(見(jiàn)下文)，評(píng)價(jià)BPA與nTiO2的聯(lián)合毒性效應(yīng)。

聯(lián)合毒性實(shí)驗(yàn)中，不同毒性比中不同濃度組合nTiO2與BPA混合對(duì)S. obliquus的生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)過(guò)程與1.4類似。只是，提前用OECD 201藻類培養(yǎng)基配好不同濃度組合nTiO2與BPA(濃度加倍)的混合液，然后與藻試驗(yàn)液等體積再混合，得到nTiO2與BPA聯(lián)合測(cè)試液。測(cè)試液培養(yǎng)條件與EC50計(jì)算同1.4。

1.6聯(lián)合毒性評(píng)價(jià)方法

幾種聯(lián)合毒性評(píng)價(jià)方法簡(jiǎn)述如下：

1)毒性單位法(TU)[29-30]

TUi=Ci/EC50i

TU=∑TUi

TU0=TU/max(TUi)

Ci為化合物i的濃度；EC50i為化合物i半抑制濃度。運(yùn)用此公式對(duì)混合物的聯(lián)合作用判斷標(biāo)準(zhǔn)為：若TU=1，那么化學(xué)物之間呈相加作用；若TU>TU0，化學(xué)物之間呈拮抗作用；若TU<1，化合物呈協(xié)同作用；若TU=TU0，化合物之間為獨(dú)立作用；若TU0>TU>1,化合物呈現(xiàn)部分加和作用。

表1　納米二氧化鈦(nTiO2)與雙酚A(BPA)在不同毒性比下的濃度組合

2)相加指數(shù)法(AI)[32]

TUi=Ci/EC50iTU=∑TUi

當(dāng)AI大于零為大于相加作用，而小于零表示小于相加作用，等于零等于相加作用。

3)混合毒性指數(shù)法(MTI)[31]

TUi=Ci/EC50i

TU=∑TUi

TU0=TU/max(TUi)MTI=1-logTU/logTU0

若MTI<0，化合物之間呈拮抗作用；若MTI=0，化合物之間呈現(xiàn)獨(dú)立作用；若01,化合物之間發(fā)生超加和作用或者協(xié)同作用。

1.7數(shù)據(jù)分析

采用OECD 201標(biāo)準(zhǔn)方法計(jì)算72 h EC50。采用SPSS 20.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析(one way ANOVA)及Turkey’s test分析，P<0.05表示有顯著性差異。采用Origin進(jìn)行相應(yīng)圖片的繪制。

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果(Results)

2.1nTiO2的TEM檢測(cè)

通過(guò)TEM觀察，發(fā)現(xiàn)nTiO2進(jìn)入S. obliquus培養(yǎng)基后，發(fā)生團(tuán)聚，形成較大的聚集體(圖1A)，其水力半徑在微米級(jí)別以上。但是仍然可以發(fā)現(xiàn)很多依然以納米尺寸存在的粒子(圖1C)。不僅如此，nTiO2雖然發(fā)生團(tuán)聚，但其團(tuán)聚體呈現(xiàn)松散狀態(tài)，團(tuán)聚體的邊緣呈現(xiàn)不規(guī)則的形狀，邊緣依舊存在納米尺寸粒子(圖1A、B)，依舊可以表現(xiàn)出納米尺寸效應(yīng)。

2.2nTiO2對(duì)S. obliquus的單獨(dú)毒性

在考察nTiO2與BPA的聯(lián)合毒性前，應(yīng)首先明確nTiO2與BPA各自對(duì)S. obliquus的毒性效應(yīng)。nTiO2單獨(dú)暴露對(duì)S. obliquus的生長(zhǎng)抑制具有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系(圖2，3)。低濃度(0.5，1，2.5，5 mg·L-1)處理組中S. obliquus的生長(zhǎng)與對(duì)照相比，沒(méi)有顯著差異；在1 mg·L-1和2.5 mg·L-1處理組中甚至觀察到藻細(xì)胞的濃度較對(duì)照組有一定程度的增加。這與我們的前期研究結(jié)果類似，可能與藻類對(duì)污染物的“毒性興奮”效應(yīng)有關(guān)[35]。但是在高濃度(10，50，100 mg·L-1)處理組，nTiO2顯著抑制了S. obliquus的生長(zhǎng)速率，且隨著濃度的增加，抑制效應(yīng)越明顯。根據(jù)OECD標(biāo)準(zhǔn)方法[33]，進(jìn)一步將實(shí)驗(yàn)濃度的對(duì)數(shù)與抑制百分?jǐn)?shù)進(jìn)行一元線性回歸，可得到nTiO2對(duì)S.obliquus生長(zhǎng)的劑量-效應(yīng)方程和EC50值(表2)。經(jīng)計(jì)算，nTiO2對(duì)S. obliquus的72 h EC50為28.7 mg·L-1，該數(shù)值略高于Sadia等[36]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(72 h EC50為21.2 mg·L-1)，但兩者都在已報(bào)道的nTiO2對(duì)藻類毒性范圍之內(nèi)[37]。此外，根據(jù)文獻(xiàn)[38]的方法，計(jì)算得出nTiO2對(duì)S. obliquus生長(zhǎng)的72 h最低效應(yīng)濃度(LOEC)為10 mg·L-1。

圖1　TEM檢測(cè)nTiO2進(jìn)入S. obliquus培養(yǎng)基后的團(tuán)聚狀態(tài)Fig. 1　Aggregation of nTiO2 suspended in S. obliquus culture medium observed by TEM

圖2　不同濃度nTiO2隨不同時(shí)間對(duì)S. obliquus細(xì)胞數(shù)目的影響Fig. 2　Effect of different concentrations of nTiO2 on S. obliquus cells number as exposure time changes

圖3　不同濃度nTiO2對(duì)S. obliquus的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)注：A表示S. obliquus 72 h生長(zhǎng)曲線下所包圍的面積。Fig. 3　The inhibition effects of nTiO2 on the growth of S. obliquus Note： A, The area under the growth curve.

2.3BPA對(duì)S. obliquus的單獨(dú)毒性

不同濃度BPA對(duì)S. obliquus生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)見(jiàn)圖4，5。與nTiO2的毒性類似，隨著濃度增大，BPA對(duì)S. obliquus的生長(zhǎng)抑制作用逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)明顯的劑量—效應(yīng)關(guān)系。暴露72 h后，在實(shí)驗(yàn)的最低濃度(0.2 mg·L-1)暴露組，盡管BPA對(duì)藻的生長(zhǎng)無(wú)顯著抑制作用，但仍然觀測(cè)到藻平均豐度的明顯降低；而高濃度(25 mg·L-1)BPA甚至已完全抑制了S. obliquus的生長(zhǎng)。按照標(biāo)準(zhǔn)方法，計(jì)算得到BPA濃度與S. obliquus生長(zhǎng)抑制率之間的關(guān)系方程以及EC50值(表2)。BPA對(duì)S. obliquus的72 h EC50為1.81 mg·L-1，與已報(bào)道的BPA對(duì)綠藻的96 h EC50(1.0～3.1 mg·L-1)[39]保持一致。

表2　各實(shí)驗(yàn)組對(duì)S. obliquus生長(zhǎng)抑制的劑量-效應(yīng)相關(guān)關(guān)系及半效應(yīng)濃度

注：y表示S. obliquus受抑制的百分率，single nTiO2組中的x表示nTiO2水溶液的對(duì)數(shù)濃度lgC，其余各組均以水溶液中BPA的濃度的對(duì)數(shù)值表示。-- 表示沒(méi)有進(jìn)行該項(xiàng)檢測(cè)。

Note:y indicates the inhibition percent of Scenedesmus obliquus; x in the group of nTiO2only indicate the lgC of nTiO2suspensions and x in the other groups indicate the lgC of BPA. -indicates there is no detection.

圖4　不同濃度BPA隨不同時(shí)間對(duì)S. obliquus細(xì)胞數(shù)目的影響Fig. 4　Effect of different concentrations of BPA on S. obliquus cells number as exposure time changes

2.4nTiO2與BPA對(duì)S. obliquus的聯(lián)合毒性效應(yīng)

本文從實(shí)際情況出發(fā)，考慮到環(huán)境中存在納米材料與環(huán)境污染物的不同濃度比例，考察不同毒性比下不同濃度組合BPA與nTiO2對(duì)S. obliquus的生長(zhǎng)抑制作用，并采用毒性單位法、相加指數(shù)法、混合毒性指數(shù)法3種方法評(píng)價(jià)了BPA與nTiO2的聯(lián)合毒性效應(yīng)。不同毒性比下，各濃度組對(duì)S. obliquus的毒性效應(yīng)如圖6所示。結(jié)果顯示，不同毒性比下的EC50(以BPA表示，表2)各不相同，最高值和最低值間，相差將近12倍。最高值出現(xiàn)在毒性比4:1實(shí)驗(yàn)組，EC50=2.198 mg·L-1，明顯大于單獨(dú)BPA時(shí)的EC50；而最低值(EC50=0.189 mg·L-1)出現(xiàn)在毒性比1:3組，顯著小于單獨(dú)BPA時(shí)的EC50。不同毒性比下以nTiO2表示的EC50同樣各不相同(表2)，最高值出現(xiàn)在毒性比1:2實(shí)驗(yàn)組，EC50= 9.70 mg·L-1，而最低值出現(xiàn)在毒性比1:1組，EC50=6.79 mg·L-1。實(shí)驗(yàn)中以nTiO2表示的所有EC50，均明顯小于單獨(dú)nTiO2時(shí)的EC50。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同毒性比下混合物的毒性差異較大。根據(jù)聯(lián)合毒性評(píng)價(jià)方法，當(dāng)BPA與nTiO2毒性比為4:1和3:1時(shí)，兩者對(duì)S. obliquus的聯(lián)合毒性作用為拮抗；但是當(dāng)兩者的毒性比為2:1，1:1，1:2，1:3時(shí)，聯(lián)合毒性作用卻呈現(xiàn)為協(xié)同作用(表3，圖7)。納米材料和現(xiàn)有污染物聯(lián)合作用后發(fā)生的種種變化，無(wú)疑給現(xiàn)有環(huán)境監(jiān)測(cè)理念和技術(shù)及設(shè)備產(chǎn)生挑戰(zhàn)，也對(duì)納米材料的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估帶來(lái)新的亟需解決的問(wèn)題。

圖5　不同濃度BPA對(duì)S. obliquus生長(zhǎng)抑制效應(yīng)注： A表示S. obliquus 72 h生長(zhǎng)曲線下所包圍的面積。Fig. 5　The inhibition effects of BPA on the growth of S. obliquus Note： A: The area under the growth curve.

表3　不同毒性比下BPA與nTiO2對(duì)S. obliquus的聯(lián)合毒性評(píng)價(jià)結(jié)果及相關(guān)參數(shù)

圖6　不同毒性比下不同濃度組合(BPA+nTiO2)對(duì)S. obliquus生長(zhǎng)抑制效應(yīng) 注：A表示S. obliquus 72 h生長(zhǎng)曲線下所包圍的面積；A～F分別表示BPA與nTiO2毒性比分別為4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3時(shí)的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)。Fig. 6　The inhibition effect of BPA (nTiO2) on the growth of S. obliquus at different toxic ratiosNote： A, The area under the growth curve; the toxic ratios of BPA to nTiO2 was 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3 respectively from A to F.

圖7　TU、TU0、AI、MTI值隨不同毒性比的變化Fig. 7　Changes of TU，TU0，AI and MTI values with the different toxic ratios

3　討論(Discussions)

MNMs與環(huán)境中現(xiàn)有污染物的相互作用及其聯(lián)合毒性效應(yīng)，日益受到關(guān)注。大量研究表明，MNMs的存在能影響污染物在水生生物體內(nèi)的富集及其相應(yīng)的生物毒性[21,40-44]。例如，碳納米材料富勒烯能影響有機(jī)污染物，如阿特拉津、甲基對(duì)硫磷、多氯聯(lián)苯和菲在生物體內(nèi)的累積和毒性效應(yīng)[40-41]；nTiO2和nFe3O4能加重重金屬Cd 對(duì)細(xì)胞的DNA 單鏈損傷[42-43]，nTiO2還強(qiáng)化Cd 和As 在鯉魚體內(nèi)的生物累積[23, 45], 增強(qiáng)阿特拉津和氟甲礬霉素對(duì)蛋白核小球藻的毒性[44]。我們的前期研究結(jié)果顯示，nTiO2能吸附海水中的三丁基錫(TBT)、多環(huán)芳烴菲(Phe)和多溴聯(lián)苯醚(PBDEs)等污染物，增加它們?cè)诘讞镏械母患?，并?qiáng)化TBT的毒性效應(yīng)[21, 46-47]。但是，并非所有的研究都呈現(xiàn)MNMs對(duì)其他污染物的毒性“強(qiáng)化”；相反，亦有研究指出，MNMs的存在導(dǎo)致了其他污染物的毒性“弱化”。例如，nTiO2的存在降低了Cd對(duì)羊角月牙藻(Pseudokirchneriella subcapitata)[13]，銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)和萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)[24]的毒性，也部分降低了Cr(VI)對(duì)斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)的毒害作用[48]。還有研究發(fā)現(xiàn)，nTiO2先提高了Zn2+對(duì)藍(lán)藻(Anabaena sp.)的毒性，但是隨著實(shí)驗(yàn)體系內(nèi)nTiO2濃度的增加，Zn2+對(duì)Anabaena sp.的毒性逐漸降低并最終恢復(fù)正常[49]。上述研究當(dāng)中，幾乎每個(gè)研究人員都認(rèn)為MNMs對(duì)其他污染物的吸附作用是其影響污染物生物效應(yīng)的原因。但是，不同的甚至相反的研究結(jié)果，喻示除吸附作用外可能存在其他的影響因素。實(shí)際上，已有的研究往往關(guān)注單一或少數(shù)納米材料濃度(特別是無(wú)明顯生物效應(yīng))下對(duì)現(xiàn)有污染物毒性效應(yīng)的影響[13, 24-26]，未考慮到實(shí)際環(huán)境中MNMs與現(xiàn)有污染物之間復(fù)雜多變的濃度比例及其相互作用模式。本實(shí)驗(yàn)中，我們采用毒性單位法、相加指數(shù)法和混合毒性指數(shù)法嘗試評(píng)價(jià)了不同毒性比下不同濃度組合的BPA與nTiO2的聯(lián)合毒性效應(yīng)。結(jié)果顯示，nTiO2與BPA的聯(lián)合毒性與兩者的毒性比(濃度比)之間存在緊密的聯(lián)系：在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，隨著毒性比由大到小(4:1到1:3)，nTiO2相對(duì)含量增大，兩者的聯(lián)合毒性作用由拮抗作用轉(zhuǎn)變?yōu)椴糠窒嗉樱俎D(zhuǎn)為協(xié)同作用。即nTiO2對(duì)BPA的影響由毒性弱化逐步過(guò)渡到毒性強(qiáng)化。例如，當(dāng)BPA的濃度為0.2 mg·L-1時(shí)，其單獨(dú)對(duì)S. obliquus的抑制率約為19%，加入nTiO2后，隨著毒性比由大到小(4:1到1:3)，即nTiO2相對(duì)含量增大，BPA對(duì)S. obliquus的抑制率由7%(弱化)上升到64%(強(qiáng)化)，毒性增加超過(guò)9倍?？梢?jiàn)BPA與nTiO2共存時(shí)濃度的比值在很大程度上決定著兩者的聯(lián)合毒性效應(yīng)。

圖8　nTiO2吸附在藻細(xì)胞的兩端(左)；nTiO2團(tuán)聚在藻細(xì)胞周圍(中)；右圖由中圖放大得到。顯微鏡放大倍數(shù)為：400×。紅箭頭標(biāo)注為nTiO2，圓圈包圍的是藻細(xì)胞。Fig. 8　nTiO2 absorbed on the both ends of S. obliquus (left); nTiO2 got together and surrounded the algae cells (middle)；The middle picture zoomed to the right. Microscopic magnification: 400×. The red arrows point to the nTiO2and the red circle surround the algae cells.

上述現(xiàn)象可能與不同毒性比(濃度比)下，nTiO2、BPA與S. obliquus三者之間的相互作用有關(guān)。溶液中如果僅有BPA時(shí)，BPA的濃度決定其生物毒性的大小。當(dāng)溶液中加入少量的nTiO2時(shí)，由于其對(duì)BPA的吸附，導(dǎo)致溶液中BPA的含量減少，由BPA引起的毒性作用降低，而此時(shí)溶液中nTiO2含量較低，不足以引起對(duì)S. obliquus的毒性，因此，整體的聯(lián)合毒性作用模式表現(xiàn)為拮抗。研究表明，nTiO2對(duì)BPA的吸附作用很快，5 min即可吸附40%，60 min內(nèi)即可吸附平衡[7]。nTiO2對(duì)BPA之間的吸附作用，此時(shí)可能主要起到“消減”作用。繼續(xù)加入nTiO2，溶液中BPA的含量進(jìn)一步降低，由BPA導(dǎo)致的毒性作用進(jìn)一步降低，但同時(shí)，溶液中nTiO2的含量增加，與藻細(xì)胞發(fā)生相互作用，有部分吸附在藻細(xì)胞的表面，如圖8所示，導(dǎo)致S. obliquus的局部BPA濃度過(guò)高，增強(qiáng)了對(duì)S. obliquus的毒性，因此，此時(shí)的聯(lián)合毒性作用表現(xiàn)為相加或部分相加作用。若向體系中進(jìn)一步加入nTiO2，溶液中的BPA含量可能降至很低，其對(duì)S. obliquus的毒性作用進(jìn)一步下降，但是此時(shí)nTiO2含量較高，可能發(fā)生(1)吸附有大量BPA的nTiO2團(tuán)聚在的表面，吸附態(tài)BPA可導(dǎo)致細(xì)胞表面局部BPA濃度過(guò)高，高濃度BPA的毒性作用顯著增強(qiáng)，呈現(xiàn)協(xié)同作用；(2)生物體細(xì)胞膜孔徑、核膜孔徑以及離子通道大都處于納米級(jí)[50]，小粒徑的nTiO2會(huì)通過(guò)這些通道直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，吸附有BPA的nTiO2可能通過(guò)被動(dòng)或主動(dòng)運(yùn)輸作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)[51-53]，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)BPA和nTiO2的含量增高，此時(shí)nTiO2對(duì)BPA的吸附主要起到“富集”作用。由于BPA和nTiO2都會(huì)引發(fā)細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激[54-56]，其聯(lián)合毒性作用呈現(xiàn)協(xié)同作用；(3)雙酚A能脅迫藻細(xì)胞產(chǎn)生活性氧自由基[55]，破壞細(xì)胞膜，改變細(xì)胞膜通透性，從而導(dǎo)致藻細(xì)胞易于受到污染物的損傷。nTiO2附著在藻體表面后本身也可能破壞細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)、造成氧化脅迫等[56]。因此，吸附有BPA的nTiO2團(tuán)聚在S. obliquus的表面后，可能發(fā)生BPA和nTiO2并肩作戰(zhàn)，相互促進(jìn)對(duì)藻的毒性，呈現(xiàn)協(xié)同作用；(4)上述幾種聯(lián)合作用機(jī)制可能同時(shí)發(fā)生，交互作用，最終導(dǎo)致協(xié)同作用的發(fā)生。

為評(píng)價(jià)BPA和nTiO2的聯(lián)合毒性效應(yīng)，考慮到實(shí)際環(huán)境中多變的污染物濃度比例，本研究采用毒性單位法、相加指數(shù)法、混合毒性指數(shù)法三種聯(lián)合毒性評(píng)價(jià)方法考察了BPA和nTiO2在不同毒性比不同濃度組合對(duì)S. obliquus的聯(lián)合毒性效應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與已有研究?jī)H是強(qiáng)調(diào)毒性強(qiáng)化或僅是強(qiáng)調(diào)弱化不同，本實(shí)驗(yàn)同時(shí)出現(xiàn)MNMs對(duì)其他污染物毒性的強(qiáng)化與弱化作用。在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，隨著毒性比由大到小(4:1到1:3，以BPA計(jì)，nTiO2相對(duì)含量逐漸增大)，兩者的聯(lián)合毒性作用由拮抗作用轉(zhuǎn)變?yōu)椴糠窒嗉樱俎D(zhuǎn)為協(xié)同作用。由于不同的毒性比對(duì)應(yīng)著兩者的不同的濃度比，表明濃度比可能是MNMs與其他污染物聯(lián)合毒性作用效應(yīng)的決定因素之一。不同濃度比下，MNMs與其他污染物的聯(lián)合作用機(jī)制，可能與MNMs、污染物以及毒作用受體三者之間的相互作用有關(guān)，其復(fù)雜的內(nèi)部毒理作用機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

目前環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)多是對(duì)環(huán)境中單一污染物的含量提出限制，并未考慮到環(huán)境中日益增多的MNMs的潛在環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MNMs與環(huán)境污染物之間具有復(fù)雜的聯(lián)合毒性作用，MNMs的環(huán)境暴露既可能導(dǎo)致對(duì)其他污染物的“濃度富集”和“毒性強(qiáng)化”，也可能起到“濃度消減”和“毒性弱化”。因此，有必要加強(qiáng)MNMs生態(tài)毒理學(xué)的研究，弄清其毒性機(jī)制，同時(shí)應(yīng)探索MNMs與環(huán)境污染物的聯(lián)合毒性作用及其機(jī)理，結(jié)合實(shí)際環(huán)境狀態(tài)，建立健全更加完善合理的環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)。

通訊作者簡(jiǎn)介：朱小山(1977-)，男，環(huán)境科學(xué)博士，副研究員，主要研究方向?yàn)榄h(huán)境科學(xué)與生態(tài)毒理學(xué)，發(fā)表論文60余篇。

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The Combined Toxic Effect of Nanoscale Titanium Dioxide (nTiO2) and Bisphenol A (BPA) onScenedesmusobliquus

Zhao Lihong1,2, Zhu Xiaoshan1,2,*, Wang Yixiang1,2, Jin Hui2,3, Wang Jiangxin4, Wang Chao5, Lao Yongmin2, Jiang Yuelu2, Tao Yi6, Zhou Jin2, Cai Zhonghua2

1. School of Environment, Tsinghua University, Beijing 100084, China 2. Division of Marine Science and Technology, Graduate School at Shenzhen, Tsinghua University, Shenzhen 518055, China 3. School of Life Science, Tsinghua University, Beijing 100084, China 4. School of Life Science, Shenzhen University, Shenzhen 518060, China 5. The Technological and Higher Education Institute of Hong Kong，Hong Kong, China 6. Division of Energy and Environment, Graduate School at Shenzhen, Tsinghua University, Shenzhen 518055, China

28 March 2015accepted 21 May 2015

Nanoscale titanium dioxide (nTiO2) has been widely used in industries such as electronics, optics, and material sciences. However, increasing concerns have been raised in regards to its ecotoxicity and toxicity on the aquatic environment as well as to humans. In order to better understand the interactive effects of nTiO2and the existing pollutants in the environment, the combined toxic experiments between nTiO2and bisphenol A (BPA, a typical estrogen in aquatic environment) were carried out according to three joint toxicity evaluation methods (toxic unit, additive index and mixture toxic index), using green algae Scenedesmus obliquus as an experimental model. The results showed that the separate 72 h EC50of nTiO2and BPA for S. obliquus was 28.7 mg·L-1and 1.81 mg·L-1, respectively. When nanoparticles coexist with BPA, the 72 h EC50(showed by BPA) values in different toxic ratios (4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2 and 1:3) were 2.198，1.58，1.153，0.428，0.306 and 0.189 mg·L-1, respectively. The results tell us the combined toxic effect was not simply one-step additive. Instead, it depends on the various toxic ratios pattern, the observed toxic effects turned from antagonism to additive effect and then to synergism process. These results indicated that the toxic ratios (concentration ratios) between nTiO2and the existing pollutants in the environment would play a key role for determining their combined toxic effects.

nTiO2; BPA; Scenedesmus obliquus; combined toxicity

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21107058；41373089)，環(huán)境污染過(guò)程與基準(zhǔn)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(南開大學(xué))開放基金資助項(xiàng)目(KL-PPEC-2013-01)

趙麗紅(1989-)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)榄h(huán)境生物技術(shù)及生態(tài)毒理學(xué)，Email：lihongzhaonju@163.com；

Corresponding author)， E-mail: zhu.xiaoshan@sz.tsinghua.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20150328005

2015-3-28 錄用日期：2015-5-21

1673-5897(2015)6-110-11

X171.5

A

趙麗紅, 朱小山, 王一翔, 等. 納米二氧化鈦(nTiO2)與雙酚A對(duì)斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)的聯(lián)合毒性效應(yīng)[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2015, 10(6): 110-120

Zhao L H, Zhu X S, Wang Y X, et al. The combined toxic effect of nanoscale titanium dioxide (nTiO2) and bisphenol A (BPA) on Scenedesmus obliquus [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(6): 110-120 (in Chinese)