農(nóng)用抗生素XBP-03-A的分離及結(jié)構(gòu)鑒定

張 婷，周金燕，譚 紅

（1. 山東職業(yè)學(xué)院生物工程系，山東 濟(jì)南 250104；2. 中國科學(xué)院成都生物研究所，四川 成都 610041）

抗生素XBP-03-A 是從我國西部地區(qū)采集的土樣中分離得到的鏈霉菌XBP-03 菌株所產(chǎn)生的次級代謝物質(zhì)，在篩選中發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)生的代謝物質(zhì)對多種病原菌具有抗菌活性[1]。經(jīng)對該抗生物質(zhì)的分離純化和鑒定分析，發(fā)現(xiàn)其中活性組分XBP-03-A 為谷氏菌素。本文報道抗生素XBP-03-A 的制備、分離、純化及結(jié)構(gòu)分析等工作，以期為分析鏈霉菌XBP-03 發(fā)酵液中的其他活性成分提供研究思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

鏈霉菌XBP-03 的發(fā)酵液由中國科學(xué)院成都生物研究所應(yīng)用與環(huán)境微生物研究中心提供。抑菌測定指示菌為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus Ym1004），由中國科學(xué)院成都生物研究所應(yīng)用與環(huán)境微生物研究中心提供。抑菌活性測定培養(yǎng)基：蛋白胨0.15%，磷酸氫二鈉0.005%，牛肉膏0.15%，瓊脂1.8%，pH 值7.8～8.0，培養(yǎng)基需經(jīng)0.1 MPa，121℃滅菌30 m in。

儀器設(shè)備及試劑：YJ-875 型醫(yī)用凈化工作臺、LRH-250A 型生化培養(yǎng)箱、BüCHI R-114 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、GL-20G-Ⅱ型離心機(jī)、876-2 型真空干燥箱；玻璃層析柱；美國Perkin Elmer Lambda 35 型紫外可見分光光度計；SHIMADZU（島津） 液相色譜儀系統(tǒng)；LC-10AT 型輸液泵，SPD-10A 紫外檢測器，7725i 進(jìn)樣閥；N3000 色譜工作站（浙江大學(xué)智能信息研究所）；HC-C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，安捷倫公司）、Bouns-RP 柱（4.6 mm×250 mm，安捷倫公司）；GF-254層析板；培養(yǎng)皿；試管；試劑瓶等；超純水（18.2 MΩ）、甲醇、丙酮、冰乙酸、正丁醇、乙醇（均為國產(chǎn)分析純）、進(jìn)口色譜純甲醇、進(jìn)口色譜純乙腈、四環(huán)素（sigma 公司進(jìn)口分裝）、正相硅膠載體（青島海洋化工）

1.2 試驗方法

1.2.1 上柱樣品的制備 鏈霉菌XBP-03 通過深層發(fā)酵培養(yǎng)50 h 后，發(fā)酵培養(yǎng)液以6 000 r/m in 的條件離心15 min，取上清液，備用，記為發(fā)酵液。此發(fā)酵液采用D101 大孔樹脂進(jìn)行動態(tài)脫色處理后[2]，再利用3 倍體積無水乙醇沉淀，取上清液。此上清液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在45℃濃縮到少量體積，再用20 倍體積無水乙醇沉淀，收集沉淀，放在真空干燥箱里40℃干燥12 h，得到黃色粉末粗品。用少量水溶解此粗品后，按照粗品∶硅膠=1∶1.5（w/w）拌料，此物料為上柱樣品。

1.2.2 硅膠柱層析分離 以乙醇-水作為流動相，柱層析硅膠（100～200 目）為固定相[3]，采用濕法裝柱，使流速控制在2 m L/m in。利用梯度洗脫的方法，即乙醇∶水=8∶1、乙醇∶水=4∶1，每250 m L 收集一瓶，每一梯度洗5個柱體積，柱層析結(jié)果利用薄層層析方法檢測分析，展層效果相近的洗脫液合并濃縮，各流份用管碟法進(jìn)行活性跟蹤檢測，活性樣品繼續(xù)采用硅膠柱分離。

1.2.3 洗脫液檢測 （1）生物活性跟蹤:各流份用管碟法進(jìn)行活性跟蹤檢測，使用管蝶法[4]分別測定其對蠟樣芽孢桿菌的抑菌效果。（2）TLC 檢測：將生物檢測得有抗細(xì)菌活性的洗脫液，于GF-254 層析板上點樣，以乙醇-氨水-水為展開劑，采用紫外燈254 nm 照射和5%茚三酮丙酮溶液染色相結(jié)合的方法顯色。檢測后將斑點一致的收集液合并起來，減壓濃縮后測抑菌活性，活性樣品繼續(xù)采用硅膠柱分離第二次，方法同1.2.2。

1.2.4 HPLC 制備XBP-03-A 經(jīng)過上述步驟的分離純化過程，能夠得到單一組分含量較高的樣品，還需使用高相液相色譜法（HPLC）法制備[5]兩次，進(jìn)一步達(dá)到核磁純度，從而可以鑒定其結(jié)構(gòu)。

HPLC 一次制備條件：Bouns-RP 柱，流動相乙腈-水（6∶4），流速0.5 m L/m in，檢測波長265 nm，柱溫40℃；HPLC 二次制備條件：HC-C18 柱，流動相甲醇-水（5∶95，含0.05%冰乙酸），流速0.5 m L/m in，檢測波長265 nm，柱溫40℃。

分別收集目標(biāo)峰，利用HPLC 進(jìn)行純度分析后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干后，得到XBP-03-A 白色粉末，用此樣品進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析及活性檢測。

1.2.5 XBP-03-A 的抑茵活性檢測 制備時取少量在HPLC 圖譜峰尖時流出的溶液，將其濃縮干燥后，用無菌水溶解，使用濾紙片法測其抑菌活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 硅膠層析結(jié)果

利用梯度洗脫硅膠柱層析的方法，每250 m L 收集一瓶，經(jīng)薄層層析檢測，將展層效果相近的洗脫液合并，相應(yīng)地將發(fā)酵液粗提物分為8個流份，并對以上8個流份進(jìn)行管碟法抑菌活性檢驗。結(jié)果顯示，1 至6 流份無活性，7、8 流份具有抑菌活性（圖1）。

圖1 硅膠柱層析流份的活性

將有活性的7、8 流份再經(jīng)過反復(fù)正相硅膠柱層析分離純化，分別得到純度較好，薄層層析為單一斑點的組分，用于進(jìn)一步制備。

2.2 XBP-03-A 的HPLC 制備

2.1 中有活性的7、8 流份經(jīng)過反復(fù)硅膠柱層析進(jìn)行分離純化，得到的純度較好的組份，進(jìn)一步通過高效液相色譜制備兩次，得到XBP-03-A。XBP-03-A 的液相譜圖如圖2。

圖2 XBP-03-A 的HPLC 圖

2.3 XBP-03-A 的活性測定

活性測定結(jié)果表明，XBP-03-A 的抑菌活性較強(qiáng)（圖3）。

圖3 XBP-03-A 的抑菌活性

2.4 XBP-03-A 的結(jié)構(gòu)鑒定

采用紫外光譜、質(zhì)譜、核磁共振譜（13C-NMR 和1H-NMR）等分析方法對XBP-03-A 結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

XBP-03-A 化合物的紫外特征譜圖如圖4，與典型的胞嘧啶堿基核苷類化合物的紫外特性一致[6]，其水溶液在265 nm 處有中等強(qiáng)度吸收峰，遠(yuǎn)紫外區(qū)存在最大吸收，其0.1 mol/L HCl 溶液吸收峰發(fā)生紅移（向長波方向移動），且伴隨摩爾吸光系數(shù)顯著增加。

經(jīng)HR-ESI-MS 分析測定，XBP-03-A 的分子離子峰為m/z 444.1817 [M+H]+，二倍分子離子峰為m/z 887.3601[2M+H]+，如圖5，推測分子量為443。

13C -NMR（D2O）：δC171.8，171.7，167.0，166.1，157.8，141.7，97.2，83.2，75.9，73.5，71.3，61.3，59.7，55.7，53.4，33.0；1H-NMR（D2O）：δH7.74（d），6.05（d），5.67（d），4.49（s），4.12（m），4.03（m），3.87（m），3.80（m），3.78（m），2.69（s）。結(jié)合氫譜、碳譜及元素分析初步定出XBP-03-A 的分子式為C16H25N7O8。對照Dolak[7]和Murao[8]發(fā)表的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)XBP-03-A 與兩者文章中g(shù)ougerotin 的C 和H化學(xué)位移值相近度很高，確定XBP-03-A 結(jié)構(gòu)式與gougerotin[9]的結(jié)構(gòu)式相同，結(jié)構(gòu)見圖6。

圖4 XBP-03-A 的紫外特征

圖5 XBP-03-A 的ESI-MS

圖6 XBP-03-A 的化學(xué)結(jié)構(gòu)

XBP-03-A 與gougerotin 的核磁波譜數(shù)據(jù)對比，結(jié)果見表1。

另外，在鏈霉菌XBP-03 發(fā)酵液中還分離到一種單體化合物，經(jīng)鑒定其結(jié)構(gòu)與胞嘧啶葡萄糖醛酸[10]相同，見圖7。由于核苷肽類抗生素的生物合成機(jī)理具有相似性[11]，均先形成核苷，再經(jīng)酶催化，在核苷上連接不同的氨基酸，最終形成不同的核苷肽抗生素。因此，推測胞嘧啶葡萄糖醛酸是谷氏菌素生物合成的中間體。

谷氏菌素是一種核苷肽類抗生素，分子構(gòu)成包括3個部分，即胞嘧啶、氨基已糖和肌氨酞絲氨酸二肽，具有抗細(xì)菌、支原體及抗病毒和腫瘤等活性[12]。早期，Murao 等在一株鏈霉菌發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)一種植物生長抑制劑，命名為谷氏菌素。胡繼蘭等[13]從采自云南土樣中分離的一株鏈霉菌發(fā)酵液中提取分離得到一個具有抗腫瘤活性的物質(zhì)，命名為云谷霉素，經(jīng)鑒別該物質(zhì)與谷氏菌素相同。M igawa 等[14]采用固相合成法實現(xiàn)了谷氏菌素的全合成，進(jìn)一步推動了谷氏菌素的應(yīng)用。

表1 抗生素XBP-03-A 與谷氏菌素的13C 和1H化學(xué)位移數(shù)據(jù)對比

圖7 胞嘧啶葡萄糖醛酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)

本文報道的從鏈霉菌XBP-03 發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)的抗菌物質(zhì)XBP-03-A，結(jié)構(gòu)與谷氏菌素相同，不僅為分離純化鏈霉菌XBP-03 發(fā)酵液中的其他活性成分奠定了試驗基礎(chǔ)，而且為分離不解離的極性物質(zhì)提供了思路。同時還分離得到了構(gòu)成XBP-03-A 的結(jié)構(gòu)單元胞嘧啶葡萄糖醛酸，可為研究鏈霉菌XBP-03 次級代謝產(chǎn)物的生物合成途徑提供線索。

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