聚吡咯氧化石墨烯修飾的神經(jīng)微電極陣列

王 力，蔣庭君，石文韜，宋軼琳，徐聲偉，蔡新霞

(1. 中國科學院電子學研究所傳感技術聯(lián)合國家重點實驗室(北方基地) 北京 海淀區(qū) 100190; 2. 中國科學院大學電子電氣與通信工程學院 北京 石景山區(qū) 100049)

·生物電子學·

聚吡咯氧化石墨烯修飾的神經(jīng)微電極陣列

王 力1,2，蔣庭君1,2，石文韜1，宋軼琳1，徐聲偉1，蔡新霞1,2

(1. 中國科學院電子學研究所傳感技術聯(lián)合國家重點實驗室(北方基地) 北京 海淀區(qū) 100190; 2. 中國科學院大學電子電氣與通信工程學院 北京 石景山區(qū) 100049)

利用電化學方法，在多通道神經(jīng)微電極陣列芯片上制備聚吡咯氧化石墨烯薄膜材料，并對該材料的電化學行為進行了分析。對神經(jīng)微電極陣列芯片采用計時電壓法探究，確定了定向修飾聚吡咯氧化石墨烯薄膜的最佳電沉積條件。微電極陣列芯片為多通道實時檢測神經(jīng)細胞的電生理和電化學信號提供了一種新的器件，但其檢測靈敏度、信噪比需進一步的提高。將聚吡咯氧化石墨烯的平面微電極阻抗值降低了92.1%，且提高了對多巴胺循環(huán)伏安響應的靈敏度，對神經(jīng)電生理信號和電化學信號的檢測具有重要意義。

電沉積; 阻抗; 神經(jīng)微電極陣列; 聚吡咯氧化石墨烯

神經(jīng)系統(tǒng)是由神經(jīng)組織構成的器官系統(tǒng)，是人體中最為復雜也最為重要的系統(tǒng)之一，其包括了數(shù)十億的神經(jīng)元和多種感官信息傳遞機制。單個神經(jīng)元的信息傳遞是由電信號和遞質(zhì)信號共同完成的，這兩類信號在神經(jīng)系統(tǒng)中起著重要的作用[1-4]。因此研究神經(jīng)電生理信號和遞質(zhì)電化學信號的同步檢測，對于神經(jīng)系統(tǒng)的進一步研究具有重要的意義[5]。

碳纖維電極、玻璃微電極等是人們檢測神經(jīng)細胞電生理信號的常用器件，但使用這些工具電極定位困難，操作繁瑣，且容易造成細胞損傷，使得無法長期監(jiān)測[6-10]。近年來，隨著微機電系統(tǒng)(microelectromechanical systems，MEMS)加工技術的發(fā)展，微電極陣列芯片使得在體或離體條件下對神經(jīng)細胞的長期無損監(jiān)測提供了可能，如德國Multichannel公司開發(fā)的MEA芯片，密歇根大學研發(fā)的密歇根電極等[7,11-12]。這些電極可實現(xiàn)群體神經(jīng)細胞電生理活動的同步檢測，然而之前使用的微電極陣列沒有集成電化學檢測神經(jīng)遞質(zhì)的功能，且獲得信號的信噪比較低，這是因為裸電極或者修飾的材料靈敏度不高，檢測限低，與離體組織不易接觸。

石墨烯目前是世界上電阻率最小的材料，電阻率只約為10?6??cm，還兼有高熱導性和高機械強度的優(yōu)良性質(zhì)，但石墨烯的強疏水、易團聚的特性限制了其應用，而氧化石墨烯(graphene oxide，GO)因含有大量的含氧官能團能解決了以上不足[13-14]，因而GO能在電子、材料、信息等領域有廣闊的應用前景。吡咯單體在氧化劑的存在下能較迅速地氧化成聚吡咯(polypyrrole, PPy)，PPy與其他高分子相比具有電導率高、易成膜、柔軟、生物相容性好的優(yōu)點，且吡咯易于和其他材料復合，所以PPy在電極修飾、離子檢測方面廣泛地被應用[15]。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

氧化石墨烯(純度>99%，南京先豐納米材料科技有限公司)；吡咯單體(純度>99%，sigma)實驗用水為去離子水；電化學工作站CHI660D (上海辰華儀器有限公司)；S4800型掃描電鏡(日本日立公司)；超聲分散儀(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)。

1.2 神經(jīng)微電極陣列芯片的制備

利用微機電系統(tǒng)加工工藝(MEMS)，實驗室自制了60通道的神經(jīng)微電極陣列芯片。芯片在玻璃基底上集成了便于神經(jīng)檢測的絕緣基底、焊盤、引線、微電極陣列、參考電極、對電極、復合敏感膜材料以及絕緣層，其中微電極的直徑為20 μm，電極間距150 μm，線寬10 μm；包括兩次光刻過程。在光刻之前對玻璃基底依次經(jīng)過丙酮、乙醇、去離子水的清洗以確保基底表面潔凈，第一次光刻步驟為：旋涂一層AZ1500正性光刻膠，隨后進行前烘、曝光、顯影、后烘的操作；隨后，濺射一層厚度約為250 nm的鈦、鉑(Pt/Ti)金屬層；剝離多余的金屬，僅剩下焊盤、引線、微電極陣列、參考電極、對電極；并利用等離子體增強化學氣相沉積法(PECVD)沉積厚度約為400 nm的Si3N4。第二次光刻即為套刻，操作步驟與初次光刻一致。操作完成后，對芯片進行深刻蝕，本芯片制作采用干法刻蝕。干法刻蝕就是通過氣體和等離子體能量對光刻膠暴露區(qū)域進行化學反應，使微電極暴露出來[10,16]。

1.3 聚吡咯氧化石墨烯(PPy/GO)的電化學聚合

計時電壓法和計時電流法是常用的電化學電鍍方法。本文采用計時電壓法探究PPy/GO合成的條件。電化學聚合分如下步驟：1) 取1 mL的GO懸濁液(1 mg/mL)超聲分散25 min，期間不停通入N2；2) 量取3.47 μL的吡咯滴入GO中，并繼續(xù)超聲分散15 min；3) 將此混合液在磁力攪拌器中攪拌2 min；4) 電鍍實驗采用計時電壓法在三電極體系中進行，對不同的微電極點選擇不同的電量密度，分別為0.08、0.2、0.3、0.5、0.8 C/cm2。

1.4 PPy/GO電化學行為

完成上述電聚合實驗后，首先，將神經(jīng)微電極陣列浸入已配制好的50 μM多巴胺溶液(DA)中，采用三電極體系在?0.3～0.7 V的電位范圍內(nèi)進行循環(huán)伏安掃描10次，其中掃描速度為0.05 V/s。其次，將微電極浸入1 mL 0.9%NaCl溶液中，測試最佳電聚合沉積的微電極和裸Pt電極的阻抗譜圖，其中電壓設置為0.5 V，掃描頻率范圍為0.1 Hz～100 kHz。

2 結果與討論

2.1 器件制備及PPy/GO的修飾

圖1所示為神經(jīng)微電極陣列芯片的整體效果圖和電極中心放大圖。由圖可知，遵循此流程制作出的電極陣列芯片引線清晰均勻，電極陣列表面無浮渣，選擇比較好。這種直徑20 μm、間距150 μm的60通道神經(jīng)微電極為高通量，長期無損檢測神經(jīng)網(wǎng)絡、單細胞的神經(jīng)電生理和遞質(zhì)電化學檢測提供了可能[5, 17-20]。

圖1 神經(jīng)微電極陣列芯片

在60通道的神經(jīng)微電極陣列上，選擇5個神經(jīng)微電極，使用不同電量密度，均成功地定向聚合生成PPy/GO，如圖2所示。圖2a為在0.3 C/cm2條件下的電鏡掃描圖，在氧化石墨烯的片層結構及表面的聚吡咯顆粒(球狀納米顆粒)均清晰可見。

圖2 在平面微電極陣列上制備的聚吡咯氧化石墨烯

2.2 PPy/GO的阻抗特性

神經(jīng)微電極阻抗的大小對于神經(jīng)電生理檢測有重要的意義，尤其是1 kHz處的阻抗越小，越能夠獲得信噪比高的動作電位。這是因為神經(jīng)信號動作電位的發(fā)放是毫秒級的，若在1 kHz左右的阻抗值很大，會導致有效的動作電位淹沒在噪聲中[11]。如圖3所示的數(shù)據(jù)表明，在使用0.3 C/cm2作為電聚合條件的神經(jīng)微電極阻抗值(1 kHz)明顯小于裸Pt電極。阻抗值從100 kΩ下降至7.94 kΩ，降幅達92.1%，對神經(jīng)電生理信號和電化學信號的檢測都具有重要的意義。

圖3 裸鉑電極和PPy/GO修飾的電極阻抗譜圖

2.3 PPy/GO對多巴胺的循環(huán)伏安響應

不同電量密度電聚合成的PPy/GO有不同的電化學性質(zhì)。圖4a為修飾有PPy/GO的神經(jīng)微電極在50 μM DA溶液中的伏安響應，其中包括裸Pt電極，使用0.3 C/cm2和0.8 C/cm2電量密度修飾的神經(jīng)微電極的循環(huán)伏安曲線(CV曲線)，Bare Pt—(■)，0.3 C/cm2—(○)，0.8 C/cm2—(△) ，分別為PPy/GO的電沉積條件。圖4b為不同電沉積條件下的復合材料的電荷容量。對于采用循環(huán)伏安法獲得的CV曲線的電荷容量為：

式中，v為掃描速率；?為電位。由式(1)可知，CV曲線所圍面積即為電荷容量。圖4b表明隨著使用電量密度的增加，聚合成的PPy/GO的電荷容量在不斷增加。即隨著電量密度的增加，沉積的PPy/GO使神經(jīng)微電極表面粗糙度不斷增加，即比表面積不斷加大[10]，對于神經(jīng)信號檢測中提高信噪比和信號的靈敏度有很大的幫助。

由圖4a可看出，對50 μM DA響應電流最高的是0.8 C/cm2，裸Pt電極響應很低。超微電極(直徑微米級)表面的物質(zhì)擴散由一維擴散轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗑S擴散，所得的電流在短時間內(nèi)即能達到穩(wěn)態(tài)，而且具有很大的電流密度。因此，超微電極的CV曲線為經(jīng)典的Z形，無明顯的氧化峰與還原峰[17,21]。0.8 C/cm2的聚合物氧化電流拐點出現(xiàn)在0.45 V，而0.3 C/cm2的PPy/GO薄膜氧化電流拐點出現(xiàn)在0.38 V。氧化電壓越小，能排除其他物質(zhì)的干擾[8]，則說明在0.3 C/cm2條件下生成的PPy/GO對DA的選擇性好。此外，0.3 C/cm2的PPy/GO靈敏度相對于裸Pt電極也很高，綜上所述，選擇0.3 C/cm2為最佳的電聚合條件。

圖4 最佳電沉積條件

3 結 束 語

本文采用MEMS工藝制作了60通道神經(jīng)微電極陣列芯片，利用計時電壓法在多通道神經(jīng)微電極陣列上定向電聚合成PPy/GO復合材料，并通過循環(huán)伏安掃描法確定了最佳的電鍍條件。在該條件下的微電極對DA響應靈敏度高，并擁有較低的阻抗值。本文提出的聚吡咯氧化石墨烯修飾的多通道神經(jīng)微電極陣列，有望在神經(jīng)雙模信號(神經(jīng)電化學信號和神經(jīng)電生理信號)的檢測中得到應用。

[1] KAREN C C, PHILIPPE R, Flexible polyimide microelectrode array for in vivo recordings and current source density analysis[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2007, 22: 1783-1790.

[2] WINDHORST U. 現(xiàn)代神經(jīng)科學研究技術[M]. 趙志奇,陳軍 譯. 北京: 科學出版社, 2006. WINDHORST U. Modern neurological research techniques [M]. Translated by ZHAO Zhi-qi, CHEN Jun. Beijing: Science Press, 2006.

[3] STRONG T D, CANTOR H C, BROWN R B. A microelectrode array for real-time neurochemical and neuroelectrical recording in vitro[J]. Sensors and Actuators A, 2001, 91: 357-362.

[4] SOKOLOFF P, GIROS B, MARTRES M P, et al. Molecular cloning and characterization of a novel dopamine receptor (D3) as a target for neuroleptics[J]. Nature, 1990, 347(13): 146-151.

[5] SONG Yi-lin, LIN Nan-sen, LIU Chun-xiu, et al. A novel dual mode microelectrode array for neuroelectrical and neurochemical recording in vitro[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2012, 38(1): 416-420.

[6] JUDITH T C, AMADIO V, MART S. A novel method for monitoring surface membrane trafficking on hippocampal acute slice preparation[J]. Journal of Neuroscience Methods, 2003,125: 159-166.

[7] BERGEN A V, PAPANIKOLAOU T. Long-term stimulation of mouse hippocampal slice culture on microelectrode array [J]. Brain Research Protocols, 2003, 11: 123-133.

[8] KUMAR M, SWAMY B E K, SATHISH REDDY, et al. Synthesis of ZnO and its surfactant based electrode for the simultaneous detection of dopamine and ascorbic acid[J]. Anal Methods, 2013, 5(1): 735-740.

[9] SATISH K, HARIT D, MOHAN S S, et al. Polymer communication fibers from polypropylene/nano carbon fiber composites[J]. Polymer, 2002, 43(5): 1701-1703.

[10] RODGER C, FONG A J, LI W, et al. Flexibleparylene based multielectrode array technology for high-density neural stimulation and recording[J]. Sens Actuators B: Chem, 2008, 132(1): 449-460.

[11] COGAN S F. Neural stimulation and recording electrodes[J]. Annu Rev Biomed, 2008, 10(56): 275-309.

[12] GEIM A K. Graphene: Status and prospects[J]. Science, 2009, 324(5934): 1530-1534.

[13] NOVOSELOV K S, GEIM A K, MOROZOV S V, et al. Two-dimensional gas of massless Dirac fermions in graphene[J]. Nature, 438: 197-200.

[14] ZHOU Xiao-ming, LIAO Yu-hui, XING Da. Sensitive monitoring of RNA transcription levels using a graphene oxide fluorescence switch[J]. Chinese Science Bulletin, 2013, 58 (21): 2634-2639.

[15] PROUT J O, DUPIN D, ARMES S P. Synthesis and characterization of polypyrrolecoated poly(methyl methacrylate) latex particles[J]. Journal Article J Mater Chem, 2009, 19: 1433-1442.

[16] JIANG T, LIU C, XU S, et al. A novel planar microelectrode array fabricated for brain slice eleetrophysiology[C]//8th Annual IEEE International Conference on Nao/Micro Engineered and Molecular systems. [S.l.]: IEEE, 2013.

[17] SYED B, LIU Xin, MATHAI J C, et al. Automated targeting of cells to electrochemical electrodes using a surface chemistry approach for the measurement of quantal exocytosis[J]. ACS Chemical Neuroscience, 2010, 1: 590-597.

[18] YUAN Fang, GAO Xiao-hui, SANJU G, et al. Magnetron sputtered diamond-like carbon microelectrodes for on-chip measurement of quantal catecholamine release from cells[J]. Biomed Microdevices, 2008, 10: 623-629.

[19] CHRISTER S, ARTO H, JENNY A, et al. On-chip determination of dopamine exocytosis using mercaptopropionic acid modified microelectrodes[J]. Electroanalysis, 2007, 19(2-3): 263-271.

[20] CHRISTER S, ARTO H, SIMON P, et al. Fully automated microchip system for the detection of quantal exocytosis from single and small ensembles of cells[J]. Lab Chip, 2008, 8: 323-329.

[21] 張祖訓. 超微電極電化學[M]. 北京: 科學出版社, 1998. ZHANG Zu-xun. Ultra microelectrode electrochemistry [M]. Beijing: Science Press, 1998.

編輯黃 莘

A Planar Microelectrode Array Electrodeposited by Polypyrrole Graphene Oxide

WANG Li1,2, JIANG Ting-jun1,2, SHI Wen-tao1, SONG Yi-lin1, XU Sheng-wei1, and CAI Xin-xia1,2
(1. State Key Laboratory of Transducer Technology, Institute of Electronics, Chinese Academy of Sciences Haidian Beijing 100190; 2. School of Electronic, Electrical and Communication Engineering, University of Chinese Academy of Sciences Shijingshan Beijing 100049)

An efficient and reliable electrochemical method for preparing Polypyrrole Graphene oxide (PPy/GO) nanocomposites by electrodeposition on a planar microelectrode array (MEA) is reported. The electrodeposition process is carried out by chronopotentimetry measurement and the optimal condition is found. MEA is a practical tool for real-time electrophysiological evaluation of cultures and isolated tissues, especially suitable for stable long-term recording. Although MEA has these advantages, the low sensitivity and low signal-to-noise ratio still exist. The MEA electrodeposited by PPy/GO can reduce the electrochemical impedance by 92.1% and the increased response to dopamine has been observed, which is very significant for the neuro detection of electrophysiology and electrochemistry.

electrodeposition; impedance; microelectrode array; polypyrrole graphene oxide

TP212.3

A doi:10.3969/j.issn.1001-0548.2015.04.025

2013 ? 12 ? 11；

2014 ? 06 ? 06

國家973計劃(2011CB933202)；國家自然科學基金(61125105, 61027001, 61002037)

王力 (1988 ? )，男，博士生，主要從事微型生物傳感器及其檢測系統(tǒng)方面的研究.