HPLC-UV和HPLC-ELSD法測(cè)定蜜炙酸棗仁中酸棗仁皂苷A含量的比較

隋利強(qiáng)，黃禮書，陳喆明

（福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州　350108）

HPLC-UV和HPLC-ELSD法測(cè)定蜜炙酸棗仁中酸棗仁皂苷A含量的比較

隋利強(qiáng)，黃禮書，陳喆明

（福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州350108）

［目的］建立蜜炙酸棗仁中酸棗仁皂苷A的含量測(cè)定方法。［方法］采用反相高效液相色譜法，以WondaCract ODS-2 （250 mm×4.6 mm，5μm）為色譜柱，乙腈-水為流動(dòng)相，ELSD漂移管溫度為80℃，氣體流量為1.5 ml/min。紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為204 nm；流速為1 ml/min，柱溫為30℃。［結(jié)果］HPLC-ELSD法測(cè)定酸棗仁皂苷A的線性范圍為0.05～0.2 mg/ml，r=0.9952，平均回收率為102.97%，RSD=0.79%（n=6）。HPLC-UV法測(cè)定酸棗仁皂苷A的線性范圍為0.005～0.2 mg/ml，r=0.9990，平均回收率為98.64%，RSD=2.05%（n=6）。［結(jié)論］兩種檢測(cè)方法測(cè)定酸棗仁皂苷A的含量結(jié)果相近，但HPLC-ELSD法的穩(wěn)定性更好，HPLC-UV法由于吸收度低，峰面積相對(duì)較小，存在一定誤差。

HPLC-UV；HPLC-ELSD；蜜炙酸棗仁；酸棗仁皂苷A

酸棗仁為鼠李科植物酸棗Ziziphus Jujaba Mill.var.spinosa （Bunge）HU ex H.F.chou的種子，是臨床應(yīng)用較為廣泛的中藥，具有養(yǎng)肝、寧心安神、生津、斂汗的功效，臨床主要用于治療失眠、心脾氣血兩虛、脾不統(tǒng)血、陰虧內(nèi)熱、心神不寧等［1］。酸棗仁臨床常用生酸棗仁、炒酸棗仁，藥典也收載上述兩種飲片。除此之外，福州地區(qū)習(xí)慣用蜜炙酸棗仁，且用藥歷史悠久，該飲片收載于《福建省中藥飲片炮制規(guī)范》［2］。

現(xiàn)代研究表明酸棗仁含酸棗仁皂苷、三萜化合物等，具有鎮(zhèn)靜、催眠、安神的作用。酸棗仁皂苷A是2010年版藥典中酸棗仁質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)量控制成分，目前對(duì)該成分的檢測(cè)多采用HPLC-ELSD法，部分文獻(xiàn)報(bào)道采用HPLC-UV法。本研究參考有關(guān)文獻(xiàn)［3-5］，分別采用HPLC-UV和HPLC-ELSD法測(cè)定了蜜炙酸棗仁中酸棗仁皂苷A的含量，旨為建立蜜炙酸棗仁中酸棗仁皂苷A更好的質(zhì)量控制方法。

1　儀器與試藥

1.1儀器電子天平（梅特勒-托利多稱重設(shè)備有限公司，XS105型）；電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，京制00000246）；高效液相色譜儀（Agilent Technologies 1200 series，Alltech 3300 ELSD和二極管陣列檢測(cè)器）。

1.2試藥甲醇（批號(hào)為20141218，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙腈（批號(hào)為20140321，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；酸棗仁（批號(hào)為20141107，隴西聚堂中藥材實(shí)業(yè)有限公司）；酸棗仁皂苷A（含量為98.60%，MuST-14042311，中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所）。蜜炙酸棗仁由本課題組按《福建省中藥飲片炮制規(guī)范》蜜棗仁項(xiàng)下方法加工炮制。

2　HPLC-ELSD檢測(cè)方法

2.1對(duì)照品溶液的制備取酸棗仁皂苷A對(duì)照品10 mg，精密稱定，置于10 ml容量瓶中加甲醇制成每1 ml含1 mg的溶液，即得。

2.2供試品溶液的制備參考文獻(xiàn)［4-5］，取蜜棗仁樣品粉末（過4號(hào)篩）約1 g，精密稱定，置索式提取器中，加石油醚（60%～90%）適量，加熱回流4 h，棄去石油醚液，藥渣揮去溶劑，轉(zhuǎn)移至錐形瓶中，加入70%乙醇20 ml，加熱回流2 h，濾過，濾渣用70%乙醇5 ml洗滌，合并洗液與濾液，回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至5 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3色譜條件色譜柱:WondaCract ODS-2（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相:乙腈-水；ELSD漂移管溫度:80℃；氣體流量: 1.5 ml/min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng):204 nm；柱溫:30℃；流速:1 ml/min；進(jìn)樣量:10 μl；以乙腈為流動(dòng)相A，以水為流動(dòng)相B，梯度洗脫，洗脫條件見表1；理論板數(shù)按酸棗仁皂苷A峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。在此色譜條件下，分別精密吸取對(duì)照品、供試品溶液各10 μl進(jìn)樣測(cè)定，HPLC圖見圖1。

2.4線性關(guān)系考察精密吸取酸棗仁皂苷A對(duì)照品貯備液0.1 ml、0.15 ml、0.2 ml、0.3 ml、0.4 ml，分別置于2 ml容量瓶中，加甲醇定容，配成系列對(duì)照品溶液（0.05 mg/ml、0.075 mg/ml、0.1 mg/ml、0.15 mg/ml、0.2 mg/ml）。按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)得各濃度峰面積，以峰面積對(duì)數(shù)LogA為縱坐標(biāo)，濃度C為橫坐標(biāo)，得回歸曲線Y=7.9194X+1.8502，r=0.9952，結(jié)果顯示酸棗仁皂苷A在濃度0.05～0.2 mg/ml范圍內(nèi)有良好線性關(guān)系，結(jié)果見圖2。

表1　梯度洗脫條件

圖1　HPLC色譜圖

圖2　酸棗仁皂苷A標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5精密度試驗(yàn)精密量取對(duì)照品溶液（1 mg/ml）0.2 ml于2 ml容量瓶中，加甲醇定容，進(jìn)樣量為10 μl，分別連續(xù)進(jìn)樣5次，結(jié)果對(duì)照品峰面積的RSD=0.66%（n=6），結(jié)果見表2。

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)精密量取對(duì)照品溶液（1 mg/ml）0.2 ml 于2 ml容量瓶中，加甲醇定容，進(jìn)樣量為10 μl，分別于0 h、2 h、4 h、6 h和8 h進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果對(duì)照品峰面積的RSD= 0.61%（n=5），結(jié)果見表3。

2.7重復(fù)性試驗(yàn)取同一樣品5份，每份1 g，精密稱定，按供試品溶液制備方法制備溶液，分別進(jìn)樣，進(jìn)樣量為10 μl，分別測(cè)定峰面積，結(jié)果RSD為1.75%（n=5），見表4。

表2　精密度試驗(yàn)結(jié)果（mAU）

表3　穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（mAU）

表4　重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果（mAU）

2.8加樣回收試驗(yàn)精密量取已知含量（0.124 mg/ml）樣品溶液0.35 ml，加入0.3 ml對(duì)照品溶液（0.1 mg/ml），搖勻，進(jìn)樣10 μl進(jìn)行測(cè)定，平行測(cè)定6份。計(jì)算平均回收率，結(jié)果平均回收率為102.97%，RSD=0.79%（n=6）。說明該方法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確。具體結(jié)果見表5。

表5　加樣回收實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果?。╪＝6）

2.9樣品含量測(cè)定樣品按“2.2供試品溶液的制備”方法制備樣品溶液，精密吸取樣品溶液10 μl，依照“2.3”色譜條件進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，扣除含水量得結(jié)果見表6。

表6　樣品含量測(cè)定結(jié)果?。╪＝3）

3　HPLC-UV檢測(cè)方法

3.1色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)按“2.1”及“2.2”項(xiàng)方法制備對(duì)照品溶液及供試品溶液。檢測(cè)器為二極管陣列檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為204 nm。酸棗仁皂苷A對(duì)照品與供試品HPLC圖譜如圖2。

3.2線性關(guān)系考察實(shí)驗(yàn)方法同“2.4”項(xiàng)，結(jié)果得回歸方程為Y=33.62X-0.765，相關(guān)系數(shù)r=0.9990，表明酸棗仁皂苷A在0.005～0.2 mg/ml范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

3.3精密度試驗(yàn)精密吸取對(duì)照品溶液10 μl，分別連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果對(duì)照品溶液峰面積的RSD為3.68%（n=6）。

圖2　HPLC色譜圖

3.4穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取對(duì)照品溶液10 μl，分別于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h和12 h進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果對(duì)照品溶液峰面積的RSD為3.51%（n=6），表明12 h內(nèi)測(cè)定結(jié)果基本穩(wěn)定。

3.5重復(fù)性試驗(yàn)取同一樣品5份，每份1 g，精密稱定，按“2.2”項(xiàng)方法制備溶液，分別進(jìn)樣，進(jìn)樣量為10 μl，測(cè)定5個(gè)結(jié)果，平均含量為0.12 mg/ml，RSD為3.39%（n=5）。

3.6加樣回收試驗(yàn)精密量取已知含量樣品溶液0.8 ml，加入0.1 ml對(duì)照品溶液（1 mg/ml），搖勻，進(jìn)樣10 μl進(jìn)行測(cè)定，平行測(cè)定6份。計(jì)算平均回收率，結(jié)果平均回收率為98.64%，RSD=2.05%（n=6）。說明該方法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確。具體結(jié)果見表7。

表7　加樣回收實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

3.7樣品含量測(cè)定精密吸取樣品溶液10 μl，依照上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，扣除含水量得蜜棗仁中酸棗仁皂苷A的含量為0.063%。結(jié)果見表8。

4　小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)分別采用HPLC-UV和HPLC-ELSD法測(cè)定了福州特色飲片蜜炙酸棗仁中酸棗仁皂苷A的含量，結(jié)果顯示

表8　樣品含量測(cè)定結(jié)果?。╪＝3）

樣品在同一方法處理的情況下，兩種檢測(cè)方法測(cè)定酸棗仁皂苷A的含量結(jié)果相近。但HPLCELSD法的重復(fù)性和精密度等更好，而HPLC-UV法由于吸收度低，峰面積相對(duì)較小和相鄰色譜峰的干擾而存在一定誤差，如精密度、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)RSD稍大。因此，筆者建議首選HPLC-ELSD法測(cè)定蜜炙酸棗仁中酸棗仁皂苷A的含量，如需用HPLC-UV法，可將樣品液萃取后再進(jìn)行測(cè)量，避免干擾。本研究可為蜜炙酸棗仁的質(zhì)量控制提供參考。

［1］王茜，張艷強(qiáng)，楊艷婷，等.酸棗仁的化學(xué)成分及應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.黑龍江中醫(yī)藥，2015，28（2）:259-261.

［2］福建省衛(wèi)生廳.福建省中藥炮制規(guī)范［M］.福州:福建科學(xué)技術(shù)出版社，1988:498.

［3］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典［S］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:343-344.

［4］婁燕，賈英，何博賽，等.RP-HPLC雙波長(zhǎng)法同時(shí)測(cè)定酸棗仁湯中5種成分的含量［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，30 （7）:537-540.

［5］崔思嬌，羅潔，馬天成，等.酸棗仁的超高效液相色譜指紋圖譜［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，2013，48（7）:509-511.

（編輯陳明偉）

R284.1

A

2095-4441（2015）04-0068-04

2015-08-27

福建中醫(yī)藥大學(xué)校管重點(diǎn)學(xué)科專項(xiàng)課題（編號(hào):X2014106）

隋利強(qiáng)（1981-），男，福建福州市人，碩士，講師，研究方向:中藥炮制原理研究