不同配比凍存液對(duì)兔脂肪干細(xì)胞液氮凍存效果的研究

姚永明，張　帆，張澤敏，閻　賀，吳彩鳳，胡　飛，牛常英，楊彪炳（.濰坊醫(yī)學(xué)院山東濰坊6053；.費(fèi)縣人民醫(yī)院山東臨沂73400）

·基礎(chǔ)研究·

不同配比凍存液對(duì)兔脂肪干細(xì)胞液氮凍存效果的研究

姚永明1，張帆2，張澤敏1，閻賀1，吳彩鳳1，胡飛1，牛常英1，楊彪炳1
（1.濰坊醫(yī)學(xué)院山東濰坊261053；2.費(fèi)縣人民醫(yī)院山東臨沂273400）

目的：探究不同濃度配比凍存液對(duì)脂肪干細(xì)胞（Adipose-derived Stem Cells，ADSCs）凍存復(fù)蘇后存活率及增殖活性的影響。方法：無(wú)菌條件下取新西蘭大白兔的脂肪組織，體外分離、培養(yǎng)ADSCs并傳代至第3代，行免疫細(xì)胞化學(xué)染色對(duì)其表面標(biāo)志物進(jìn)行鑒定，同時(shí)對(duì)其行成軟骨及成表皮細(xì)胞誘導(dǎo)以證實(shí)其多項(xiàng)分化能力。將第3代ADSCs置于液氮（-196℃）中凍存，根據(jù)凍存液中培養(yǎng)基（DMEM）、胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）及二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）的配比不同分為8組：①含不同濃度FBS配比分組：A組（70%DMEM+20%FBS+10%DMSO）、B組（60%DMEM+30%FBS+10%DMSO）、C組（50%DMEM+40%FBS+10%DMSO）、D組（含有40%DMEM+50%FBS+10%DMSO）；②含不同濃度DMSO配比分組：E組（55%DMEM+40%FBS+5%DMSO）、F組（50%DMEM+40%FBS+10%DMSO）、G組（45%DMEM+40%FBS+15%DMSO）、H組（40%DMEM+40%FBS+20%DMSO）。細(xì)胞凍存三個(gè)月后，對(duì)其進(jìn)行復(fù)蘇并觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)計(jì)算細(xì)胞存活率；采用MTT法繪制復(fù)蘇后細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，以測(cè)定其生長(zhǎng)增殖情況。結(jié)果：細(xì)胞復(fù)蘇后，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)計(jì)算結(jié)果顯示C、D組存活率明顯高于A、B組（P＜0.05），E、F、G、H四組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；MTT法結(jié)果顯示C、D、F組的增殖曲線與未凍存組無(wú)明顯差異（P＞0.05）。結(jié)論：從兔脂肪組織中成功分離出了ADSCs，并且能在體外培養(yǎng)過(guò)程中穩(wěn)定生長(zhǎng)，快速增殖；ADSCs凍存液比例選擇以DMEM：FBS：DMSO=5：4∶1的凍存效果最好。

脂肪來(lái)源干細(xì)胞；凍存液；液氮

ADSCs是從脂肪組織中提取的干細(xì)胞，具有取材方便，來(lái)源豐富，體外增殖能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在組織個(gè)過(guò)程中得到廣泛應(yīng)用。然而在體外培養(yǎng)過(guò)程中，隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞的生物學(xué)特性會(huì)發(fā)生變化，從而在一定程度上影響了ADSCs的生物活性。對(duì)于采用液氮（-196℃）進(jìn)行細(xì)胞凍存，理論上是沒(méi)有時(shí)間限制的，但實(shí)際上細(xì)胞凍存的時(shí)間越長(zhǎng)，復(fù)蘇后存活率會(huì)越低。因此，我們需要找到一種有效減少細(xì)胞凍存凋亡的方法，使其活性最大程度的接近正常水平。本實(shí)驗(yàn)以DMEM作為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，加入保護(hù)劑DMSO以及FBS作為凍存液，調(diào)整凍存液中三者配比比例，對(duì)不同配比凍存液復(fù)蘇后ADSCs的生物學(xué)特性進(jìn)行觀察，進(jìn)而篩選出適合ADSCs的最佳配比凍存液，對(duì)今后ADSCs不管在科研領(lǐng)域還是在臨床應(yīng)用方面起到一定的指導(dǎo)性作用。

1　材料和方法

1.1材料

2～3個(gè)月齡新西蘭大白兔（購(gòu)自濰坊醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心），體重2.5～3.0kg，DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)HyClone有限公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），DMSO液（上海生工生物工程公司），MTT液（北京Solarbio公司），臺(tái)盼藍(lán)染料（北京Solarbio科技有限公司）

1.2方法

1.2.1 ADSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定：無(wú)菌條件下取新西蘭大白兔的新鮮脂肪，在盛有PBS緩沖液的無(wú)菌盤(pán)中反復(fù)沖洗，用眼科剪剪碎至糊狀，1 200r/min離心5min，加入Ⅰ型膠原酶后置于1 900r/min，37℃搖床消化50min，經(jīng)200目篩網(wǎng)過(guò)濾后，加入DMEM培養(yǎng)液終止消化、離心，棄上清，留貼壁細(xì)胞；用DMEM培養(yǎng)液重懸并接種培養(yǎng)瓶中，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)特征。用免疫熒光法檢測(cè)ADSCs表面特異性標(biāo)記物CD34、CD44、CD29及CDl06的表達(dá)情況。通過(guò)軟骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)其向軟骨方向分化，利用甲苯胺藍(lán)染色法檢測(cè)結(jié)果，對(duì)其行表皮細(xì)胞誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，行免疫熒光檢測(cè)其CK19的表達(dá)。

1.2.2 ADSCs的分組與凍存方法：①含不同濃度FBS配比分組：A組（70%DMEM+20%FBS+10%DMSO）、B組（60%DMEM+30%FBS+10%DMSO）、C組（50%DMEM+40% FBS+10%DMSO）、D組（含有40%DMEM培養(yǎng)基+50%FBS+ 10%DMSO）；②含不同濃度DMSO配比分組：E組（55% DMEM+40%FBS+5%DMSO）、F組（50%DMEM+40%FBS+10% DMSO）、G組（45%DMEM+40%FBS+15%DMSO）、H組（40% DMEM+40%FBS+20%DMSO）。取第3代的ADSCs，用0.25%胰酶對(duì)其進(jìn)行消化，離心后，收集細(xì)胞，向其中加入不同比例組成的凍存液，細(xì)胞密度約為5× 106/ml，吹打混勻后分裝入凍存管內(nèi)，每管1ml。先在4℃冰箱中放置30min；然后放入-20℃的冰箱中冷凍60min；接著在-80℃超低溫冰箱中過(guò)夜冷凍；之后轉(zhuǎn)入液氮中保存。

1.2.3 ADSCs的復(fù)蘇：凍存3個(gè)月后，從液氮中取出凍存的細(xì)胞，迅速放入37℃水浴箱內(nèi)，輕輕振蕩，使凍存管中的固體快速融化。在超凈工作臺(tái)中用滴管將細(xì)胞移到離心管中，1 200r/min離心10min，去除凍存液，加入L-DMEM完全培養(yǎng)液（DMEM中加入10%胎牛血清，1ml谷氨酰胺，0.05g/L L-抗壞血酸，1%青鏈霉素混合液），放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.4復(fù)蘇后ADSCs的測(cè)定

1.2.4.1形態(tài)學(xué)觀察：倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖情況及細(xì)胞形態(tài)學(xué)的特征并且進(jìn)行拍照記錄。

1.2.4.2細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞存活率的統(tǒng)計(jì)：ADSCs懸液與0.4%的臺(tái)盼藍(lán)染液按4:1的比例混勻，室溫條件下靜置約3 min，采用計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)細(xì)胞的密度和細(xì)胞的存活率，其中被染成藍(lán)色的為死細(xì)胞，而活細(xì)胞不被染色。

磨河水庫(kù)工程水土保持防治工程實(shí)施的投資為242.86萬(wàn)元，較水土保持方案減少42.07萬(wàn)元，其中工程措施投資減少35.93萬(wàn)元，植物措施投資減少757萬(wàn)元，臨時(shí)工程投資減少1.57萬(wàn)元。

細(xì)胞的密度（細(xì)胞個(gè)數(shù)/ml）=（四個(gè)大格的細(xì)胞的總的數(shù)目/4）×104×細(xì)胞被稀釋的倍數(shù)

細(xì)胞的存活率（%）=［（細(xì)胞總的數(shù)目-死亡的細(xì)胞的數(shù)目）/細(xì)胞的總的數(shù)目］×100%

1.2.4.3 MTT生長(zhǎng)曲線的測(cè)定：取復(fù)蘇后的細(xì)胞加入L-DMEM中培養(yǎng)，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104個(gè)/ml后分別接種在96孔培養(yǎng)板中，每孔細(xì)胞懸液量為100μl，總共接種7個(gè)培養(yǎng)板。每塊培養(yǎng)板分十組：1組～8組分別為不同比例凍存液凍存的實(shí)驗(yàn)組；第9組為未凍存過(guò)的對(duì)照組；第10組為單純加培養(yǎng)液不加細(xì)胞的空白組。另外每組增設(shè)3個(gè)復(fù)孔，邊緣孔用無(wú)菌的PBS緩沖液填充。放入培養(yǎng)箱中靜置并且培養(yǎng)。從次日起每天同一時(shí)間取出一塊培養(yǎng)板測(cè)OD值。具體方法為：向每個(gè)含有細(xì)胞的孔內(nèi)加入20μl的濃度為5mg/ml的MTT，置于培養(yǎng)箱之中孵育4h后，吸出孔內(nèi)液體，終止培養(yǎng)。然后每孔加入150μl的DMSO之后，將其置搖床上振蕩10min，使結(jié)晶物充分的溶解之后放置到酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀之上，選在OD值為490nm處測(cè)量各個(gè)孔的吸光值。1.2.4.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）的形式表示，采用SPSS17.0軟件對(duì)ADSCs的存活率的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（One-Way-ANOVA），P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1　倒置顯微鏡下觀察ADSCs形態(tài)

圖2　顯微鏡下觀察第3代ADSCs

圖3　細(xì)胞免疫熒光染色觀察（400×）

圖4　第3代ADSCs分化能力鑒定

2　結(jié)果

2.1脂肪干細(xì)胞的鑒定

2.1.1倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)：剛消化分離的的原代ADSCs細(xì)胞呈透亮圓形，與少量殘留的紅細(xì)胞、結(jié)締組織碎片等共同漂浮于培養(yǎng)液中。4h后逐漸沉降貼壁，細(xì)胞體積逐漸增大，呈短梭形或小多角形，24h后存活的細(xì)胞基本貼壁，3～4d細(xì)胞開(kāi)始充分的伸展，形成魚(yú)群樣聚集。7d左右細(xì)胞鋪滿瓶底（見(jiàn)圖1）。傳至第3代，HE染色顯示細(xì)胞形態(tài)均勻，呈長(zhǎng)梭形（見(jiàn)圖2）。

2.1.2細(xì)胞免疫熒光表面抗原及多向分化能力鑒定：用免疫熒光法檢測(cè)的結(jié)果是，ADSCs細(xì)胞表面的抗原CD29以及CD44呈現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)，而CD34以及CD106呈現(xiàn)陰性表達(dá)（見(jiàn)圖3）；ADSCs經(jīng)EGF向表皮細(xì)胞誘導(dǎo)，檢測(cè)有CK19呈陽(yáng)性表達(dá)；經(jīng)軟骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)ADSCs，顯示胞內(nèi)基質(zhì)均勻藍(lán)染（見(jiàn)圖4）。

2.2凍存后復(fù)蘇ADSCs的檢測(cè)

2.2.1復(fù)蘇后ADSCs細(xì)胞形態(tài)學(xué)及生長(zhǎng)狀況：顯微鏡下觀察：凍存細(xì)胞復(fù)蘇后呈圓形懸浮于培養(yǎng)液中，接種2h后開(kāi)始有少量細(xì)胞貼壁，24h后大部分細(xì)胞均已貼壁。細(xì)胞形態(tài)由圓形逐漸向梭形、多角形轉(zhuǎn)化。未凍存細(xì)胞在接種10min開(kāi)始貼壁，2h后逐漸伸展呈梭形，多角形。

表1　不同比例凍存液下復(fù)蘇后的兔ADSCs復(fù)蘇率的比較（±s，%）

表1　不同比例凍存液下復(fù)蘇后的兔ADSCs復(fù)蘇率的比較（±s，%）

組別不同比例凍存液復(fù)蘇率A組70%DMEM+20%FBS+10%DMSO35.00±0.02 B組60%DMEM+30%FBS+10%DMSO40.39±0.02 C組50%DMEM+40%FBS+10%DMSO73.34±0.07 D組40%DMEM+50%FBS+10%DMSO71.82±0.15 E組55%DMEM+40%FBS+5%DMSO18.35±0.06 F組50%DMEM+40%FBS+10%DMSO75.03±0.11 G組45%DMEM+40%FBS+15%DMSO56.68±0.06 H組40%DMEM+40%FBS+20%DMSO38.35±0.08

2.2.3生長(zhǎng)曲線測(cè)定：復(fù)蘇后，脂肪干細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖大致呈S形，在第1～2天細(xì)胞均處于停滯期，但均比未凍存組的開(kāi)始值低，從第3天開(kāi)始細(xì)胞進(jìn)入迅速生長(zhǎng)期，第5天可達(dá)到增殖頂峰。實(shí)驗(yàn)結(jié)果均與以往研究相一致［1］。其中凍存組C、D、F組的增殖曲線與未凍存組無(wú)明顯差異，F(xiàn)組更加接近未凍存組，而G組的增殖曲線與未凍存組相比稍低。而其他的組別的增殖曲線與未凍存組相比較低（見(jiàn)圖5）。

圖5　復(fù)蘇后ADSCs生長(zhǎng)曲線

3　討論

ADSCs來(lái)源于胚胎期的中胚層，具有向中胚層的組織和神經(jīng)外胚層的組織等分化的潛力?？梢栽谔囟l件下分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、血管內(nèi)皮、神經(jīng)前體細(xì)胞及表皮細(xì)胞等多種組織細(xì)胞［2-3］。由于體外需要ADSCs的量較大，所以我們需要進(jìn)行體外分離純化并進(jìn)行大量的增殖。但是ADSCs在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)的過(guò)程中生物學(xué)特性容易發(fā)生改變，從而失去其多分化的潛能。因此及時(shí)進(jìn)行ADSCs的凍存不僅可以減少這種情況還可以節(jié)省時(shí)間和減少材料的消耗。細(xì)胞的凍存復(fù)蘇后的效果、成活率以及生長(zhǎng)狀態(tài)直接影響后續(xù)各項(xiàng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。而細(xì)胞的來(lái)源、凍存前細(xì)胞的活力、凍存時(shí)細(xì)胞的代數(shù)、凍存的密度、保護(hù)劑的選擇和濃度、凍存液中FBS的濃度、降溫以及復(fù)溫的程序都會(huì)直接影響到凍存效果［4］。所以凍存成功的關(guān)鍵是選擇合適的凍存保護(hù)劑、方法、合適的凍存溫度以及凍存時(shí)細(xì)胞的濃度等［5-6］。

經(jīng)研究表明凍存液對(duì)各類(lèi)細(xì)胞都存在破壞作用。細(xì)胞在凍存的過(guò)程中要經(jīng)歷液相固化以及水分子通過(guò)細(xì)胞膜的滲透，在這個(gè)過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生融合熱以及溶液的冰晶，這些東西會(huì)直接導(dǎo)致細(xì)胞的大量死亡［7］。而凍存時(shí)細(xì)胞的生長(zhǎng)、防凍劑的細(xì)胞的毒性損害和高滲透壓性也將會(huì)對(duì)細(xì)胞造成到傷害［8］。鑒于降溫速度太快，細(xì)胞內(nèi)外同時(shí)形成冰晶，將導(dǎo)致細(xì)胞損傷，甚至是死亡；而復(fù)溫速率太慢，細(xì)胞內(nèi)容易形成冰晶，導(dǎo)致細(xì)胞的損傷，甚至是死亡，我們選擇慢凍快溶作為凍存復(fù)蘇的方式，這一做法明顯地降低了凍存劑對(duì)細(xì)胞的損害作用。

冷凍保護(hù)劑是一類(lèi)可以通過(guò)稀釋溶液中溶質(zhì)的濃度，減少冷凍和解凍過(guò)程中對(duì)細(xì)胞造成損傷的化合物［9］，發(fā)揮作用的機(jī)制為在降溫過(guò)程中，保護(hù)劑透過(guò)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，進(jìn)而降低細(xì)胞皺縮的程度［10］。DMSO是一種分子質(zhì)量小，溶解度大，具有強(qiáng)穿透細(xì)胞膜能力的非電解質(zhì)，并能降低冰點(diǎn)，從而減少其對(duì)細(xì)胞的毒性作用。研究表明DMSO本身是一種有毒化學(xué)試劑，高濃度時(shí)對(duì)細(xì)胞具有一定的毒性［11］。但提前將DMSO4℃冰箱中預(yù)冷，可降低其對(duì)細(xì)胞的毒性［12］。所以在本實(shí)驗(yàn)采用低溫條件下加入DMSO作為保護(hù)劑的方法。

從本研究中可以分析得出，當(dāng)DMSO濃度較低（5%）時(shí)，不能有效阻止細(xì)胞內(nèi)形成冰晶，從而在凍存過(guò)程中對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生了極大的損傷。當(dāng)DMSO濃度增到20%甚至以上時(shí)，不利于細(xì)胞復(fù)蘇后的成活以及細(xì)胞活性的恢復(fù)。所以應(yīng)該嚴(yán)格控制DMSO的凍存濃度。本研究結(jié)果表明濃度為10%DMSO凍存液對(duì)ADSCs的保護(hù)效果較好。FBS本身對(duì)細(xì)胞就具有保護(hù)作用，可以用來(lái)中和DMSO對(duì)細(xì)胞的毒性，所以適當(dāng)提高其濃度對(duì)凍存細(xì)胞有保護(hù)作用。研究表明：凍存劑中FBS濃度是40%、50%時(shí)，ADSCs的凍存復(fù)蘇效率最高，均顯著高于FBS含量較低的實(shí)驗(yàn)組，表現(xiàn)為：當(dāng)FBS含量低于40%時(shí)，F(xiàn)BS濃度越高，細(xì)胞復(fù)蘇率也越高。當(dāng)FBS濃度高于40%時(shí)，F(xiàn)BS濃度的變化對(duì)ADSCs復(fù)蘇效果的無(wú)明顯影響。因此，使用含有40%FBS的凍存液即可滿足對(duì)ADSCs凍存復(fù)蘇的要求。而選擇40%FBS的另外一個(gè)原因是考慮到雖然降溫凍存過(guò)程使細(xì)胞處于低代謝狀態(tài)，但仍不能完全避免在降溫和復(fù)蘇開(kāi)始階段時(shí)，會(huì)有部分干細(xì)胞因血清等成分的存在而自主分化，從而失去多能性［13］。所以ADSCs的凍存選擇含40%FBS的凍存液較好。

本實(shí)驗(yàn)從經(jīng)濟(jì)、合理性考慮，建立了一種較為適合ADSCs短期凍存方法，為解決ADSCs的儲(chǔ)備、材料和時(shí)間的節(jié)省提供了有效的方法。而對(duì)于更長(zhǎng)時(shí)間的凍存復(fù)蘇率以及對(duì)于細(xì)胞活力的影響還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

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編輯/張惠娟

Effects of different combinations cryopreservation of rabbit adipose stem cells were frozen in liquid nitrogen effects

YAO Yong-ming1，ZHANG Fan2，ZAHNG Ze-min1，YAN He1，WU Cai-feng1，HU Fei1，NIU Chang-ying1，YANG Biao-bing1
（1.WeiFang Medical Uniwersity，Weifang 261053，Shandong，China 2.Feixian People's Hospital，Linyi 273400，Shandong，China）

Objective To investigate the ability to maintain the proliferation of Adipose-derived Stem Cells（ADSCs）in different concentration ratio of frozen liquid.MethodsFat isolated from healthy rabbits was isolated，cultured and then generated in vitro for 3 passage into the ADSCs，P3 ADSCs were identified by detecting of adipose stem cell surface markers expression.The third passage cells were preserved in liquid nitrogen for 3 months，ADSCs were divided into eight group in order to cryopreservation:groupA:70%DMEM+20%FBS+10%DMSO，groupB:60%DMEM+30%FBS+10%DMSO，groupC:50%DMEM+40%FBS+10%DMSO，groupD:40%DMEM+50%FBS+10%DMSO，groupE:55% DMEM+40%FBS+5%DMSO，groupF:50%DMEM+40%FBS+10%DMSO，groupG:45%DMEM+40%FBS+ 15%DMSO，groupH:40%DMEM+40%FBS+20%DMSO.After cryopreservation three months，observed the cells after recovering，and compared with the group not frozen.The growth curves of the cryopreserved cells were analyzed by MTT assay.Results The results of immunocytochemistryshowed ADSCs were negative for CD34，CD106 and positive for CD29，CD44.Trypan blue staining and microscopic counting of results showed that Group C and Group D had higher cell survival rate than Group A and Group B with significant difference（P＜0.05）.There was significant difference between group E，F(xiàn)，G，H（P＜0.01）.The growth curve showed that there was no significant difference in growth rate of ADSCs between Group C，D，F(xiàn) and control group（P＞0.05）.ConclusionAn experiment successfully separated from the fat rabbit adipose tissue stem cells cultured in vitro with a stable growth process.Adipose stem cells cryopreserved in vitro，frozen liquid ratio selected to DMEM:FBS: DMSO=5:4:1 freezing with the best results.

adipose-derived stem cells；Cryoprotectants；liquid nitrogen

Q813.1

A

1008-6455（2015）09-0029-05

濰坊醫(yī)學(xué)院科技創(chuàng)新研究基金資助項(xiàng)目（K11TSl006）

楊彪炳，濰坊醫(yī)學(xué)院整形研究所副所長(zhǎng)，教授，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，美國(guó)加州大學(xué)交流學(xué)者，中華醫(yī)學(xué)會(huì)濰坊整形美容學(xué)會(huì)副主任

2015-03-21

2015-05-13