基于代謝組學的隔藥灸臍法治療原發(fā)性痛經(jīng)的機理研究

楊星月,馬玉俠,杜冬青,高樹中

(1.山東中醫(yī)藥大學,濟南 250014;2.濟南市中醫(yī)醫(yī)院,濟南 250012)

原發(fā)性痛經(jīng)(primary dysmenorrhea,PD)是指婦女在經(jīng)期或行經(jīng)前后出現(xiàn)周期性的下腹疼痛且無器質性病變[1]。PD是婦科常見疾病,在年輕婦女中患病率高達 20%～90%,嚴重者占 15%[2],影響患者正常的工作和學習。

西醫(yī)多采用非甾體類抗炎藥治療,但存在消化系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等方面的副反應[3-4]。課題組前期的研究表明[5-7],隔藥灸臍法可顯著改善 PD患者的痛經(jīng)癥狀,但具體機制不清。本研究基于LC-MS聯(lián)用的代謝組學方法探究隔藥灸臍法治療PD的機制,現(xiàn)報道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料

20例受試者均來自于山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院和山東大學齊魯醫(yī)院的門診,簽署知情同意書后納入試驗。采用完全隨機設計,按照1:1的比例設立隔藥灸臍組和艾條灸臍組,每組10例。首先按就診先后順序編號,臨床醫(yī)師根據(jù)患者的編號向隨機方案保管人員索取隨機號及該患者所納入的組別編號,然后按照各組治療方案進行臨床試驗。在干預和隨訪過程中隔藥灸臍組和艾條灸臍組各脫落2例。各組一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),具有可比性。詳見表1。

表1 兩組患者年齡、病程及篩選期VAS讀數(shù)比較 (x±s)

1.2 診斷標準

參照加拿大婦產(chǎn)科學會2005年《原發(fā)性痛經(jīng)臨床指南》制定的PD診斷標準擬定[8]。經(jīng)期或者經(jīng)行前后出現(xiàn)下腹部疼痛且經(jīng)婦科檢查無器質性病變。每個月經(jīng)周期癥狀相似,主要為下腹部痙攣性疼痛,可向腰骶、會陰及大腿內(nèi)側放射,可伴隨腹瀉、惡心、嘔吐、疲勞和頭暈等癥狀。

1.3 納入標準

①符合PD的診斷標準;②年齡在16～35歲;③月經(jīng)周期規(guī)律[(28±7)d]超過 6個月;④視覺模擬評分(VAS)≥40 mm;⑤接受本療法之前1個月經(jīng)周期未接受其他治療;⑥自愿參與并與研究者合作,簽署書面知情同意書。

1.4 排除標準

①經(jīng)婦科及B超檢查,屬繼發(fā)性痛經(jīng)者;②月經(jīng)周期不規(guī)律者;③妊娠期和哺乳期以及有懷孕意向的患者;④有胃腸道疾病(慢性腹痛、慢性腸炎等)、婦科疾病(子宮內(nèi)膜異位癥、卵巢囊腫等)、內(nèi)分泌疾病(腦下垂體瘤等)、精神疾病以及做過腹部或盆腔手術的患者。

1.5 剔除和脫落標準

①因療效不佳等原因自行退出者;②無治療記錄或資料不全影響療效判斷者;③治療期間接受其他療法者;④治療期間出現(xiàn)嚴重不良事件的受試者或在研究過程中出現(xiàn)其他嚴重的并發(fā)疾病或病情惡化者;⑤依從性差,未按時復診,不能完成全程治療者。

2 治療方法

試驗過程中,實行研究者、操作者、統(tǒng)計者3者分離,由不知分組情況的第3者進行療效評價,資料總結階段采用盲法統(tǒng)計分析。

2.1 隔藥灸臍組

2.1.1 方藥組成

吳茱萸、生白芍、乳香、沒藥、醋元胡、冰片、生五靈脂等,將藥物超微粉碎混合,密封備用。

2.1.2 操作方法

溫開水調(diào)面粉成圓柱狀備用(高約2 cm,底面直徑約 8 cm),在其底面垂直于橫切面鑿一小孔,其孔大小與患者臍大小相同,并在其上部周邊捏起高約1 cm的邊緣部分;令患者仰臥位,充分暴露臍部,用 75%乙醇在臍局部常規(guī)消毒后,將面圈放置臍上，其中央小孔正對臍孔,取上述藥末適量(約8～10 g)填滿面圈中央小孔,將艾炷(直徑約1.5 cm,高約2.0 cm)置于藥末上,連續(xù)施灸10壯,約2 h。灸后用醫(yī)用膠布固封臍中藥末,1 d后自行揭下。

2.1.3 治療時間

每次月經(jīng)來潮前7 d開始治療,臍療每3天1次(每個月經(jīng)周期約2～3次),直至月經(jīng)來潮。3個月經(jīng)周期為1個療程,1個療程后觀察療效,并隨訪1個月。

2.2 艾條灸臍組

2.2.1 艾條

選用蘇州市艾絨廠生產(chǎn)的清艾條,每支25 g。

2.2.2 操作方法

患者取仰臥位,暴露臍部,將艾條的一端點燃對準神闕穴施灸,使患者局部有溫熱感而無灼痛為宜,每次灸2 h。

2.2.3 治療時間

同隔藥灸臍組。

試驗期間,患者若不能忍受疼痛者(VAS≥80)可加服阿司匹林泡騰片 0.5 g,由試驗中心統(tǒng)一發(fā)放,記錄服藥患者例數(shù)及其服用劑量。

3 治療效果

3.1 樣本采集和指標檢測

3.1.1 腹痛程度評分標準

采用國際常用的VAS評定痛經(jīng)患者的腹痛程度。

3.1.2 血漿中的代謝產(chǎn)物測定

3.1.2.1 樣本采集

20例受試者均在治療前空白等待1個月經(jīng)周期,在空白等待經(jīng)期的 1～2 d內(nèi)及治療1個療程后第 1個經(jīng)期的1～2 d內(nèi)各采集一次血液樣本。血液加入到抗凝管中,5000 rpm離心5 min,取血漿,﹣20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

3.1.2.2 樣本代謝組學分析

血漿樣本于測定前取出,4℃下解凍,加入一定量乙腈沉淀蛋白,15000 rpm離心5 min,取上清液備測。

3.1.2.3 樣本處理液相條件

配有Agilent Poroshell-120 EC-C18反相柱(粒徑2.7 μm,3.0 mm×50 mm),流速 0.4 mL/min,進樣室溫度為4℃,柱溫為35℃,進樣量為5 μL。

3.1.2.4 樣本處理質譜條件

電噴霧離子源(ESI源),質量掃描范圍為50～1100 Da,毛細管電壓3500 V,四極桿溫度100℃,Fragmentor175 V,霧化壓力 35 psig,干燥氣溫度350℃,干燥氣流量10 L/min。

3.2 數(shù)據(jù)處理

原始的LC-MS檢測數(shù)據(jù)不能直接用于模式識別分析,經(jīng)過預處理(去噪音、除內(nèi)標、峰判別、峰對齊、歸一化)后,采用 Masshunter數(shù)據(jù)定量分析軟件提取數(shù)據(jù)的分子峰特征,再經(jīng)處理導入到Simca-P 11.5軟件,進行主成分分析(PCA)和偏最小二乘法—判別分析(PLS-DA),利用 VIP(very important in the projection)數(shù)值變化尋找有貢獻的代謝物組分。相關代謝通路信息主要來自HMDB、KEGG數(shù)據(jù)庫。

3.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件進行分析,計量資料以均數(shù)±標準差表示,采用t檢驗;計數(shù)資料采用卡方檢驗。P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

3.4 治療結果

3.4.1 兩組各周期VAS讀數(shù)比較

圖1示,兩組各周期VAS值隨治療周期逐漸降低(P＜0.05),隔藥灸臍組VAS讀數(shù)的下降幅度大于艾條灸臍組,兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

圖1 兩組各周期VAS讀數(shù)比較

3.4.2 兩組治療后代謝組學檢測結果

兩組血漿代謝組學原始譜圖和數(shù)據(jù)見圖 2-7。比較圖2與圖3,圖4與圖5,兩組治療后的總離子流圖有明顯的區(qū)別,且兩組在治療前后 PCA分析散點得分圖上區(qū)分明顯,說明二者的代謝產(chǎn)物變化在治療前后有明顯不同。

圖2 隔藥灸臍組治療后血漿總離子流圖

圖3 艾條灸臍組治療后血漿總離子流圖

圖4 隔藥灸臍組治療前后血漿PCA分析散點得分圖

圖5 艾條灸臍組治療前后血漿PCA分析散點得分圖

圖6 隔藥灸臍組治療前后血漿PLS得分圖中VIP值變化

圖7 艾條灸臍組治療前后血漿PLS得分圖中VIP值變化

圖6 和圖7分別表示隔藥灸臍組和艾條灸臍組治療前后代謝產(chǎn)物的變化趨勢,從左至右依次降低。以VIP＞1為標準,隔藥灸臍組共找到5442種離子信息,鑒別出 4種可能的代謝物質及途徑,艾條灸臍組共找到2718種離子信息,鑒別出1種可能的代謝物質及途徑。詳見表2。

表2 兩組對分類有重要貢獻的血漿代謝產(chǎn)物推斷結果

4 討論

目前認為,原發(fā)性痛經(jīng)的主要機制為前列腺素(prostaglandin,PG)分泌過多導致痛覺過敏和炎癥性疼痛[9]。痛經(jīng)患者子宮內(nèi)膜和月經(jīng)血中 PGE2和 PGF2α含量均較正常婦女明顯升高,PGF2α含量增高可引起子宮平滑肌過強收縮,血管痙攣,造成子宮缺血缺氧狀態(tài)而出現(xiàn)痛經(jīng),且經(jīng)血 PGF2α水平與痛經(jīng)程度成正比[10]。雌孕激素的水平異常也是導致原發(fā)性痛經(jīng)的主要病因[11-12],雌激素含量升高促進PG的合成與釋放,導致血管平滑肌痙攣,此作用可被孕激素所拮抗,孕激素含量升高則緩解子宮肌痙攣,促進微循環(huán)及鎮(zhèn)痛物質的合成釋放[13]。由本研究可以看出,隔藥灸臍組患者經(jīng)治療后血漿中20α-二氫黃體酮、孕烯醇酮、PGE2、γ-氨基丁酸的含量升高,雌酮、PGH2的含量降低,可調(diào)節(jié)關鍵代謝產(chǎn)物如孕激素、雌激素以及前列腺素的含量,調(diào)節(jié)范圍相對較廣,并與課題組前期運用生物化學方法[14]探究隔藥灸臍對 PD患者生殖內(nèi)分泌激素影響的結果大致相同。γ-氨基丁酸在中樞神經(jīng)系統(tǒng)參與鎮(zhèn)痛作用,可提高痛閾,因此,γ-氨基丁酸含量的升高也可改善患者的痛經(jīng)癥狀。艾條灸臍法可降低5’-磷酸吡哆醛的含量,可能是通過參與神經(jīng)遞質的代謝,并影響下丘腦-垂體-性腺軸。由于代謝組學研究方法并不能完全反應體內(nèi)物質的代謝情況,因此,此試驗研究結果只是初步探究了隔藥灸臍法治療PD的有效作用靶點。

綜上,隔藥灸臍和艾條灸臍均可改善PD患者的腹痛癥狀,但是隔藥灸臍法治療PD的療效優(yōu)于艾條灸臍法,其可能是通過調(diào)節(jié)雌酮、孕酮以及前列腺素等激素水平從而發(fā)揮治療痛經(jīng)的作用。但由于本研究屬基礎研究,納入受試者較少,臨床統(tǒng)計和代謝組學檢測結果數(shù)據(jù)離散度較大,同時由于代謝組學研究方法的不完善,今后尚需在目前研究的基礎上,進一步擴大樣本量,并結合分子生物學、影像學等研究方法對隔藥灸臍法治療PD的機制進行深入研究。

[1] Tu CH, Niddam DM, Chao HT, et al. Brain morphological changes associated with cyclic menstrual pain[J]. Pain, 2010,150(3):462-468.

[2] French L. Dysmenorrhea[J]. Am Fam Physician, 2005,71(2):285-291.

[3] Malmstrom K, Kotey P, Cichanowitz N, et al. Analgesic efficacy of etoricoxib in primary dysmenorrhea: results of a randomized,controlled trial[J]. Gynecol Obstet Invest, 2003,56(2):65-69.

[4] Davis AR, Westhoff CL. Primary dysmenorrhea in adolescent girls and treatment with oral contraceptives[J]. J Pediatr Adolesc Gynecol,2001,14(1):3-8.

[5] 劉曉嵐,董薛,馬玉俠.臍療對原發(fā)性痛經(jīng)患者綜合癥狀的影響[J].上海針灸雜志,2013,32(2):85-88.

[6] 范楠楠,馬玉俠,易敏,等.隔藥灸臍法對重度原發(fā)性痛經(jīng)患者癥狀影響的觀察[J].遼寧中醫(yī)雜志,2014,41(4):788-790.

[7] 杜冬青,尹翠菊,馬玉俠,等.隔藥灸臍法治療原發(fā)性痛經(jīng)臨床研究[J].上海針灸雜志,2011,30(8):514-516.

[8] Lefebvre G, Pinsonneault O, Antao V, et al. Primary dysmenorrhea consensus guideline[J]. J Obstet Gynaecol Can, 2005,27(12):1117-1146.

[9] Harel Z. A contemporary approach to dysmenorrhea in adolescentss[J].Paediatr Drugs, 2002,4(12):797-805.

[10] Dingfelder JR. Primary dysmenorrhea treatment with prostaglandin inhibitors: a review[J]. Am J Obstet Gynecol, 1981,140(8):874-879.

[11] Song ZM, Qu CQ, Zhang Y, et al. Effects of Tongjingning granule on estrogen receptor and progesterone receptor of uterus in dysmenorrhea model rats[J]. Chin J Trad Chin Med Pharm, 2006,21(1):35-38.

[12] Levin JH, Stanczyk FZ, Lobo RA. Estradiol stimulates the secretion of prostacyclin and thromboxane from endometrial stromal cells in culture[J]. Fertil Steril, 1992,58(3):530-536.

[13] 苗芙蕊,廖愛妮,許富,等.隔藥灸命門穴對痛經(jīng)模型大鼠血清雌激素和孕激素水平的影響[J].時珍國醫(yī)國藥,2013,24(11):2814-2816.

[14] 薛哲,劉存志,高樹中,等.隔藥灸治療原發(fā)性痛經(jīng)及對患者生殖內(nèi)分泌的影響[J].中國針灸,2014,34(3):209-212.