鴉膽子藥材及其混偽品的 ITS2 序列分子鑒定研究△

馬雙姣，楊培，周紅，孫偉，姚輝*，李永華

(1.中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 藥用植物研究所，北京 100193；2.中國中醫(yī)科學院 中藥研究所，北京 100700；3.廣西中醫(yī)藥大學 藥學院，廣西 南寧 530001)

·專題·

鴉膽子藥材及其混偽品的 ITS2 序列分子鑒定研究△

馬雙姣1，楊培1，周紅1，孫偉2，姚輝1*，李永華3*

(1.中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 藥用植物研究所，北京 100193；2.中國中醫(yī)科學院 中藥研究所，北京 100700；3.廣西中醫(yī)藥大學 藥學院，廣西 南寧 530001)

目的：通過分析鴉膽子及其混偽品的ITS2序列，探究鑒定鴉膽子藥材及其混偽品的新方法。方法：采用改良的CTAB法提取鴉膽子及其混偽品的基因組DNA，PCR擴增ITS2片段。對其進行雙向測序，應(yīng)用MEGA 6.0軟件進行序列分析，計算種內(nèi)、種間遺傳距離，構(gòu)建鄰接樹。結(jié)果：鴉膽子藥材ITS2序列長度為230 bp，種內(nèi)最大K2P遺傳距離為0.018，小于其與混偽品的種間平均K2P遺傳距離0.493。NJ樹結(jié)果表明鴉膽子序列和柔毛鴉膽子序列聚為一支，與其他混偽品可明顯區(qū)分。鴉膽子與柔毛鴉膽子在35位點處有一變異位點，利用此位點能將鴉膽子與柔毛鴉膽子區(qū)別開來。結(jié)論：ITS2可作為鴉膽子藥材及其混偽品鑒定的DNA條形碼序列，為保障臨床用藥安全提供了新的技術(shù)手段。

鴉膽子；ITS2；鑒定；DNA條形碼；混偽品

中藥材鴉膽子(Bruceae Fructus)為苦木科植物鴉膽子Bruceajavanica(L.)Merr.的干燥成熟果實，產(chǎn)于我國南方地區(qū)。鴉膽子性味苦，寒，有小毒，具有清熱解毒，截瘧，止痢的功效?？捎糜诹〖?，瘧疾，外治贅疣，雞眼[1]。鴉膽子含生物堿、糖苷、酚性成分和鴉膽子酸，具有誘導(dǎo)癌細胞凋亡及影響相關(guān)基因表達、提高機體免疫功能、抗瘧、抗腫瘤、抗阿米巴、驅(qū)腸蟲等多種生物活性，研究表明鴉膽子油靜脈乳油滴和癌細胞親和力較大，有直接殺傷作用，并能保護正常骨髓，提高白細胞的數(shù)量，其作用完全符合其腐蝕贅擾的功效，具有重要的藥用價值[2-6]。然而工作中常有偽品苦木科柔毛鴉膽子BruceamollisWall.、交讓木科植物牛耳楓DaphniphyllumcalycinumBenth.、木犀科植物女貞LigustrumlucidumAit.、黃楊科植物小葉黃楊BuxusmicrophyllaSieb.et Zucc.、楝科植物灰毛漿果楝Cipadessacinerascens(Pell.)H.-M.的干燥果實以及豆科植物苦參SophoraflavescensAit.的種子相混之[7-10]。由于它們功效相差甚遠，混用亂用不僅耽誤病情，還嚴重影響了臨床用藥安全，因此對其進行準確鑒定顯得尤為重要。

近年來，已有多位學者對鴉膽子及其混偽品從藥材性狀、顯微特征等方面進行鑒別[7-10]。而從DNA條形碼的角度對鴉膽子及其混偽品的鑒定研究甚少，僅李美妮等[11]在對女貞子及其混偽品的研究中將鴉膽子作為女貞子的混偽品之一進行了ITS2序列分析。

DNA條形碼是Hebert等[12]于2003年首次提出的，是利用基因組中一段公認的、相對較短的DNA序列來進行物種鑒定的一種分子生物學技術(shù)，是傳統(tǒng)形態(tài)鑒別方法的有效補充，成為近年來生物分類和物種鑒定的研究熱點[13-16]。Chen等[17]通過對6000余份藥用植物樣本進行DNA條形碼序列篩選，發(fā)現(xiàn)ITS2序列的物種水平鑒定能力達92.7%，并首次提出以ITS2為核心，psbA-trnH為補充序列的藥用植物DNA條形碼鑒定體系。隨后Yao等[18]提出了ITS2序列可作為植物物種鑒定通用條形碼。ITS2序列作為DNA條形碼的準確性和穩(wěn)定性在紅景天[19]、重樓屬[20]、川芎[21]、蛇床[22]、羌活[23]、北豆根[24]、金銀花[25]等中藥材鑒定中得到驗證。目前，中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導(dǎo)原則已納入《中華人民共和國藥典》2010版第三增補本[1]。

為確保鴉膽子藥材的正確用藥和安全用藥，本研究應(yīng)用DNA條形碼序列ITS2對鴉膽子藥材及其易混品進行鑒定研究，為鴉膽子的準確鑒定提供依據(jù)。

1 植物材料

本研究涉及鴉膽子及其混偽品共9個物種41個研究對象，包含實驗樣本33份，GenBank下載序列8條。其中鴉膽子樣本22份(包括基原植物樣本、藥材樣本、復(fù)核樣本和對照藥材樣本)，相關(guān)信息詳見表1。樣品均經(jīng)中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所林余霖研究員鑒定。復(fù)核樣本由中國中醫(yī)科學院中藥研究所進行復(fù)核，對照藥材(編號FDC321)來自中國食品藥品檢定研究院。

表1 材料來源

2 方法

2.1 DNA提取、PCR擴增和測序

將鴉膽子及其混偽品用75%酒精棉擦拭干凈后，切碎，果實樣品取果皮約30 mg，葉片樣品取變色硅膠干燥葉片約20 mg，用研磨儀(Retsch MM400，Germany)研磨2 min(30次/秒)后用植物DNA提取試劑盒(Tiangen Biotech Co.，China)提取總DNA，56 ℃水浴過夜(葉片樣本65 ℃水浴1 h)，其余步驟按照試劑盒說明書進行。ITS2通用引物S2F：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′和S3R：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′。反應(yīng)條件為94 ℃，5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，40 循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR反應(yīng)體系為2×Taq Mix Master 12.5 μL、正反向引物(2.5 μM)各1.0 μL、總DNA 2 μL(～30 ng)，其余用ddH2O補至25 μL。電泳查看PCR擴增情況，進行雙向測序。

2.2 數(shù)據(jù)處理

將所有的序列用軟件MEGA 6.0(Molecular Evolutionary Genetics Analysis)分析[26]，并基于K2P模型進行遺傳距離等分析，用鄰接(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹，利用Bootstrap(1000 次重復(fù))檢驗各分支的支持率。

3 結(jié)果與分析

3.1 鴉膽子及其混偽品ITS2序列特征

本研究比較了22條鴉膽子ITS2序列，所得序列比對后長度為230 bp，變異位點為4個，簡約信息位點3個(簡約信息位點是指在兩個及以上分類單元的序列中存在差異，且其中至少有兩種變異類型在該位點出現(xiàn)兩次及以上)，有4個單倍型，各單倍型變異位點及序列條數(shù)見表2。鴉膽子與各混偽品種間序列進行比對后長度為266 bp，鴉膽子平均GC含量64.2%，混偽品中GC含量最高的是小葉黃楊，為71.7%，GC含量最低的是女貞，為53.8%。應(yīng)用MEGA 6.0進行分析，以Kimura 2-parameter(K2P)計算遺傳距離。鴉膽子的種內(nèi)K2P距離為0～0.018，平均K2P距離為0.005。與其混偽品柔毛鴉膽子、牛耳楓、女貞、小葉黃楊、苦參以及灰毛漿果楝平均K2P距離分別為0.014、0.769、0.594、0.657、0.646以及0.280，除柔毛鴉膽子外，鴉膽子與其它混偽品的種間最小K2P距離大于種內(nèi)最大K2P距離(見表3)。ITS2序列間存在的變異位點多達192個。通過分析發(fā)現(xiàn)，鴉膽子22份樣品的ITS2序列在35位點處均為C，柔毛鴉膽子為T，可通過此位點對鴉膽子和柔毛鴉膽子進行區(qū)分，但尚需收集柔毛鴉膽子樣品對此變異位點的穩(wěn)定性進行進一步驗證。

3.2 鴉膽子及其混偽品的聚類分析

通過基于ITS2序列(單倍型)構(gòu)建的鴉膽子及其混偽品的NJ系統(tǒng)聚類樹可以看出(如圖1)，鴉膽子序列與柔毛鴉膽子序列聚為一支，混偽品牛耳楓、女貞、小葉黃楊、苦參以及灰毛漿果楝各自聚為一支，能夠與鴉膽子明顯區(qū)分開。因此，ITS2序列作為條形碼可準確鑒別鴉膽子藥材及其混偽品牛耳楓、女貞、小葉黃楊、苦參以及灰毛漿果楝。

表2 鴉膽子ITS2序列變異位點

注：*表示與第一行堿基相同。

表3 種內(nèi)種間K2P距離計算結(jié)果

圖1 基于ITS2序列構(gòu)建的鴉膽子與其混偽品的NJ樹(拉丁名后為單倍型編號Bootstrap 1000次重復(fù)，支上數(shù)值僅顯示自展支持率≥50%)

4 討論

我國中藥資源種類繁多，蘊藏量大，但人均分布少，且近年來隨著人們生活水平和保健意識的提高，中藥的需求量也越來越大，致使市場上以假亂真的現(xiàn)象頻繁出現(xiàn)，中藥基原鑒定的準確性對資源的可持續(xù)利用以及中藥的臨床療效至關(guān)重要。傳統(tǒng)的中藥材鑒定方法，如性狀、顯微、和化學定性分析法、色譜法等，在中藥材鑒定和質(zhì)量評價中雖然發(fā)揮了重要作用，但是這些傳統(tǒng)的鑒定方法各有優(yōu)劣：藥材形態(tài)鑒定難以區(qū)分性狀相似的近緣種，而且植物形態(tài)易受地理環(huán)境、生長期、貯存條件諸多因素的影響，從而影響鑒定的準確性；化學分析方法會因中藥活性成分的含量受到其生理條件、采收時間、貯藏等因素的影響，同時對化學成分相似的物種也較難以區(qū)分。生藥鑒定學的發(fā)展面臨巨大的挑戰(zhàn)，傳統(tǒng)生藥鑒定方法難以滿足現(xiàn)代物種鑒定的需求[27]。DNA條形碼鑒定技術(shù)只需選用一個或少數(shù)幾個基因片段即可對某個屬、科甚至幾十個科的絕大部分物種進行準確鑒定，且鑒定過程更加快速，重復(fù)性和穩(wěn)定性高，不受藥材性狀的影響，直接從基因水平提供鑒定依據(jù)，即使是沒有任何鑒別經(jīng)驗的人員通過DNA條形碼標準化流程都能夠準確區(qū)分藥材的正品及混偽品。DNA條形碼的研究將日臻完善，為植物的分類鑒定及新物種的發(fā)現(xiàn)提供快捷、準確的信息，成為植物分類學家有益的輔助工具，并能有效鑒定中藥材基原植物。

本文測定了鴉膽子及其混偽品的ITS2條形碼序列，結(jié)果表明除柔毛鴉膽子外，鴉膽子與其混偽品的ITS2序列比對后發(fā)現(xiàn)變異位點較多，鴉膽子種內(nèi)最大遺傳距離(0.018)小于其與除柔毛鴉膽子以外的混偽品種間最小遺傳距離(0.269)?；贗TS2序列建立的NJ樹可以很明顯地把不同來源的鴉膽子與其混偽品牛耳楓、女貞、小葉黃楊、苦參以及灰毛漿果楝鑒別開來；鴉膽子與柔毛鴉膽子在35位點處有一變異位點，但由于柔毛鴉膽子樣本量偏少，還需要收集柔毛鴉膽子樣品對此位點進行進一步驗證。本研究中鴉膽子與其混偽品女貞子ITS2序列的K2P距離及NJ樹聚類結(jié)果均與李美妮等基于ITS2序列的女貞子原植物及其混偽品的分子鑒定[11]的研究結(jié)果一致，說明采用DNA條形碼技術(shù)鑒定藥材具有很好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。由此可見，采用DNA條形碼技術(shù)能夠更加快速、準確的完成中藥材鑒定工作，在今后的藥材流通和市場管理等實際應(yīng)用中具有極大的價值。

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MolecularIdentificationofBruceajavanicaandItsAdulterantsBasedonITS2Sequence

MAShuangjiao1，YANGPei1，ZHOUHong1，SUNWei2，YAOHui1*，LIYonghua3*

(1.InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege，Beijing100193，China；2.InstituteofChineseMateriaMedica，ChinaAcademyofChineseMedicalScience，Beijing100700，China；3.CollegeofPharmacy，GuangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Nanning530001，China)

Objective：To explore a new method to identifyBruceajavanica(L.)Merr.from its adulterants by the ITS2 regions.Methods：Genomic DNA ofB.javanicaand its adulterants were extracted by modified CTAB method and then the ITS2 sequences were obtained by PCR amplification and sequenced bidirectionally.All of the 41 ITS2 sequences were aligned through Clustal-W and the genetic distances were computed using MEGA 6.0 in accordance with the Kimura 2-parameter(K2P)model.Results：The sequence lengths of ITS2 regions ofB.javanicawere 230bp.The intra-specific genetic distances were smaller than the average inter-specific ones in ITS2 regions ofB.javanicaand its adulterants.The NJ tree showed thatB.javanicaand its adulterants could be easily differentiated according to their monophyly exceptB.mollis.The ITS2 sequences ofB.javanicaandB.mollishad a variation point at thirty-fifth site，soB.javanicaandB.molliswere able to be identified by this site.Conclusion：ITS2 can be used to identifyB.javanicaand its adulterants，which provide a new technique to ensure its clinical safety.

Bruceajavanica；ITS2；Identify；DNA barcoding；Adulterants

2015-04-08)

國家科技支撐計劃(2011BAI07B08)；廣西自然科學基金項目(2013GXNSFAA019120)

*

姚輝，副研究員，研究方向：中藥資源，Tel：(010)57833194，E-mail：scauyaoh@sina.com； 李永華，教授，研究方向：中藥資源，E-mail：liyonghua185@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.10.003