四倍體金銀花藥材體外抗菌抗病毒實驗研究△

胡璇，李衛(wèi)東，賈翎，張碩峰，吳珺，邱澤計，曾郁敏

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院 熱帶作物品種資源研究所/農(nóng)業(yè)部華南作物基因資源與種質創(chuàng)制重點實驗室，海南 儋州 571737； 2.北京中醫(yī)藥大學 中藥學院，北京 100102； 3.北京中醫(yī)藥大學 中藥材規(guī)范化生產(chǎn)教育部工程研究中心，北京 100102； 4.北京中醫(yī)藥大學 基礎醫(yī)學院，北京 100029)

·基礎研究·

四倍體金銀花藥材體外抗菌抗病毒實驗研究△

胡璇1，李衛(wèi)東2，3*，賈翎4*，張碩峰2，吳珺4，邱澤計4，曾郁敏4

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院 熱帶作物品種資源研究所/農(nóng)業(yè)部華南作物基因資源與種質創(chuàng)制重點實驗室，海南 儋州 571737； 2.北京中醫(yī)藥大學 中藥學院，北京 100102； 3.北京中醫(yī)藥大學 中藥材規(guī)范化生產(chǎn)教育部工程研究中心，北京 100102； 4.北京中醫(yī)藥大學 基礎醫(yī)學院，北京 100029)

目的：研究四倍體金銀花的體外抗菌和抗病毒作用。方法：以二倍體金銀花為對照，用最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度法(MBC)測定四倍體金銀花水提物對金黃色葡萄球菌、乙型鏈球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、白色念球菌、肺炎克雷伯菌的抗菌和殺菌作用。采用細胞病變效應法(CPE)觀察四倍體金銀花水提物對狗腎傳代細胞(MDCK)的最大無毒濃度(TC0)和半數(shù)中毒濃度(TC50)。將100TCID50的甲型流感病毒FM1加入MDCK細胞培養(yǎng)板中，吸附1 h后棄病毒液于MDCK細胞培養(yǎng)板中加入四倍體金銀花水提液的最大無毒濃度稀釋液，通過CPE法觀察提取物對病毒致細胞病變作用的影響。結果：四倍體金銀花水提物對金黃色葡萄球菌、乙型鏈球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、白色念球菌、肺炎克雷伯菌均具有抑菌和殺菌作用，其中對金黃色葡萄球菌的抑菌和殺菌作用最為明顯，四倍體對乙型鏈球菌抑菌強度高于二倍體，對肺炎克雷伯菌的殺菌強度高于二倍體。四倍體金銀花水提物在濃度為0.030 5 mg·mL-1對甲型流感病毒FM1所致的細胞病變作用顯示抑制作用，而其對照藥材二倍體金銀花水提物在濃度為0.488 0、0.244 0 mg·mL-1對流感病毒所致的細胞病變作用顯示抑制作用。結論：四倍體金銀花具有體外抗菌及抗流感病毒的作用。

四倍體金銀花；抗菌作用；甲型流感病毒FM1；抗病毒作用

金銀花(Lonicerae Japonicae Flos)為忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或帶初開的花，其味甘、性寒[1]，具有清熱解毒、涼散風熱的功能。金銀花是清熱解毒的傳統(tǒng)藥物，用藥歷史悠久，臨床上廣泛應用于急性熱病及外科感染性疾病，如上呼吸道感染、急性扁桃體炎、咽炎、乳腺炎、痢疾癤瘡痛腫等[2]。金銀花為常用大宗藥材，尤其是我國出現(xiàn)的非典型肺炎曾一度讓金銀花藥材供不應求。

針對目前金銀花優(yōu)良品種少、產(chǎn)量低等問題，筆者課題組以二倍體忍冬為親本，采用秋水仙素誘導培育而成了四倍體忍冬品種——“九豐一號”，該品種金銀花具有有效成分含量高[3]、產(chǎn)量高、采摘省工、抗逆性強[4-5]等特點，迅速在全國大面積推廣種植，所產(chǎn)藥材也已銷往全國各地。目前藥用植物多倍體研究多集中在多倍體誘導及其化學成分或營養(yǎng)成分上，如百合[6]、連翹[7]、桔梗[8]、天山雪蓮[9]、枸杞[10]等，而關于染色體加倍后的多倍體藥材藥效變化的研究較少。本研究選擇四倍體金銀花為試材，以二倍體金銀花為對照，對四倍體金銀花的體外抗菌作用和抗病毒作用進行了評價，研究結果為四倍體金銀花的臨床應用提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材

以四倍體金銀花“九豐一號”品種為試驗材料，二倍體金銀花“大毛花”品種為對照，兩個品種均在山東省平邑縣九間棚農(nóng)業(yè)科技園有限公司金銀花基地種植，栽培管理相同，同期分別采集兩個品種的第一茬二白期鮮花蕾，兩者均采用滾筒殺青烘干加工方法干燥[3]，樣品由北京中醫(yī)藥大學李衛(wèi)東副研究員鑒定，均為忍冬科植物忍冬L.japonicaThunb.的干燥花蕾。

1.2 菌毒株

金黃色葡萄球菌(26076)、乙型鏈球菌(32204)、大腸桿菌(44103)、綠膿桿菌(ATCC27853)、白色念球菌(CMCC(F)98001)(北京中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院中醫(yī)藥抗病毒實驗室)；肺炎克雷伯菌(46108)(中國食品藥品檢定研究院)；流感病毒H1N1型(北京中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院中醫(yī)藥抗病毒實驗室)；狗腎傳代細胞(MDCK)(北京中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院中醫(yī)藥抗病毒實驗室傳代培養(yǎng)并保存?zhèn)溆?；雞胚(SPF級，北京維里亞維通公司)。

1.3 藥品與試劑

瓊脂營養(yǎng)培養(yǎng)基、沙氏培養(yǎng)基以及血瓊脂培養(yǎng)基、胎牛血清(北京中醫(yī)藥大學免疫學重點實驗室)；利巴韋林注射液(山東新華制藥股份有限公司，批號：0909017，100 mg·mL-1)；DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清2%；pH 7.4的磷酸鹽緩沖液；0.25%胰蛋白酶-EDTA(Solarbio公司)。

1.4 儀器

恒溫恒濕培養(yǎng)箱(上海精宏實驗設備有限公司)；萬分之一天平(Sartorius analytic)；超凈工作臺(蘇州智凈凈化設備有限公司)；高壓滅菌鍋(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)；細胞用培養(yǎng)瓶和96孔板(Sigma)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(北京北方華粵貿易有限公司)；倒置顯微鏡(COIC)。

2 方法

2.1 樣品制備

取四倍體金銀花藥材25 g，精密稱定，加12倍量蒸餾水浸泡40 min，煮沸30 min，煎液過濾(4層醫(yī)用紗布)，藥渣繼續(xù)加8倍量蒸餾水煎煮30 min，煎液過濾，合并兩次的濾液，煎液減壓濃縮至每100 mL相當于原生藥50 g，經(jīng)高壓滅菌后置于冰箱4 ℃?zhèn)溆?。對照藥材二倍體金銀花溶液制備方法與樣品藥材溶液的制備方法相同制得。體外抗菌和體外抗病毒用同一濃度樣品制備液。

2.2 體外抗菌實驗

2.2.1 菌液的制備 供試菌種經(jīng)傳代純培養(yǎng)后，從培養(yǎng)基上挑出受試菌株的菌落，分別取接種環(huán)接種金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯菌的新鮮培養(yǎng)物至瓊脂培養(yǎng)基上，乙型鏈球菌至血瓊脂培養(yǎng)基，白色念球菌至沙氏培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。采用比濁法將各待測菌用0.9%無菌氯化鈉溶液制成濃度為105CFU·mL-1的菌懸液備用。

2.2.2 最低抑菌濃度(MIC)的測定 將配制好的菌液吸取1 mL滴入到無菌的24孔板中，然后將四倍體金銀花提取物500 mg·mL-1用移液槍吸取1 mL滴入到24孔板中第一孔與菌液均勻混合。以第一孔的濃度250 mg·mL-1為起始濃度采用對倍稀釋法稀釋成各種濃度[11]，僅留一孔加培養(yǎng)基和菌液作為對照。同樣在另一塊板中加入菌液和二倍體金銀花水提物，同樣做對倍濃度稀釋。試驗完畢后置37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。拿出來在黑色背景下觀察，有細菌生長呈現(xiàn)渾濁，沒有出現(xiàn)渾濁則為無菌生長，即為水提物的MIC。

2.2.3最小殺菌濃度(MBC)的測定 取2.2.2觀察的四倍體和二倍體金銀花的MIC陰性管中的培養(yǎng)液轉種于平板培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h取出，觀察是否有細菌生長，無菌生長的最低濃度即為四倍體和二倍體金銀花水提物的MBC。

2.3 體外抗病毒實驗

2.3.1 水提物對細胞的毒性實驗 將四倍體和二倍體水提物分別用維持液按倍比法系列稀釋成250、125、62.5、31.25 mg·mL-1……共12個濃度，分別接種到已長成單層MDCK細胞的96孔培養(yǎng)板中，0.1 mL/孔，每個濃度縱向重復4孔，同時設置4孔細胞對照和利巴韋林陽性對照，置于37 ℃，5 % CO2孵箱中培養(yǎng)48 h，每日于倒置顯微鏡下觀察細胞病變情況，以無明顯細胞病變(CPE)的最低稀釋濃度為藥物最大無毒濃度(TC0)，按Reed-Muench法計算半數(shù)中毒濃度(TC50)[12]。

2.3.2 水提物對病毒致細胞病變作用的影響 在96孔細胞培養(yǎng)板的MDCK細胞上加入100 TCID50的甲型流感病毒FM1液，100 μL/孔，置于37 ℃，5% CO2孵箱中孵育1h后棄去含有病毒的維持液，將四倍體和二倍體金銀花水提物從最大無毒濃度開始用維持液對倍稀釋4個濃度，加入到病毒感染的細胞中，每孔200 μL，縱向重復4孔，同時設置利巴韋林陽性對照組、細胞對照組和病毒對照組，將各組置于37 ℃，5% CO2孵箱中培養(yǎng)，逐日倒置顯微鏡下觀察CPE情況，當病毒對照組細胞病變?yōu)?+++時記錄實驗結果，細胞病變等級表示為：0%～25%(+)，25%～50%(++)，50%～75%(+++)，75%～100%(++++)。

3 結果

3.1 MIC和MBC測定結果

不同濃度的四倍體和二倍體金銀花水提物對金黃色葡萄球菌、乙型鏈球菌、肺炎克雷伯菌、大腸桿菌、綠膿桿菌以及白色念珠菌的最低抑菌濃度和最低殺菌濃度見表1。

3.2 體外抗病毒實驗結果

3.2.1 水提物對細胞的毒性測定 加入藥液的MDCK細胞48 h后于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，陰性對照組的正常細胞是貼壁生長的上皮樣細胞，細胞呈梭形，細胞輪廓清晰，藥物毒性致細胞病變的使MDCK細胞變圓、聚集、壞死、脫落，排列不規(guī)則(圖1)。四倍體和二倍體金銀花水提物細胞毒性試驗CPE觀察結果見表2。結果顯示，四倍體金銀花水提物TC0為0.244 mg生藥·mL-1，TC50為1.665 mg生藥·mL-1；二倍體金銀花水提物TC0為0.488 mg生藥·mL-1，TC50為2.718 mg生藥·mL-1；利巴韋林TC0為0.391 mg·mL-1，TC50為2.663 mg生藥·mL-1。

表2 四倍體和二倍體金銀花水提物對MDCK細胞的毒性實驗結果

注：CPE列的每一個數(shù)字代表每一孔細胞病變等級，“-”代表無細胞病變。

3.2.2 水提物對流感病毒致細胞病變抑制作用 在顯微鏡下觀察四倍體和二倍體水提物對甲型流感病毒FM1的CPE結果(圖1)，四倍體和二倍體金銀花水提物抗流感病毒作用的觀察結果見表3。結果顯示，與病毒對照組比較，四倍體和二倍體金銀花水提物對流感病毒致細胞病變顯示出一定的抑制作用。四倍體金銀花水提物在質量濃度為0.030 5 mg生藥·mL-1(1∶16 384)時對流感病毒致MDCK細胞病變有一定的抑制作用。而二倍體金銀花水提物在質量濃度為0.488 mg生藥·mL-1(1∶1024)、0.244 mg生藥·mL-1(1∶2048)時對流感病毒致MDCK細胞病變有一定的抑制作用。

注：A.病毒陽性對照組；B.MDCK細胞對照組；C.0.030 5mg·mL-1的四倍體金銀花組；D.0.244 0 mg·mL-1的二倍體金銀花組。圖1 金銀花四倍體和二倍體水提物抑制甲型流感病毒FM1致細胞病變顯微圖(×40)

4 討論

染色體加倍后的多倍體藥材，如丹參[13]、菘藍[14]以及蒲公英[15]等，研究報道都具有一定藥效作用，但是四倍體金銀花的抗菌、抗病毒以及其他相關藥效作用還未見報道。本文體外抗菌實驗測定結果表明，四倍體和二倍體金銀花對金黃色葡萄球菌、乙型鏈球菌、肺炎克雷伯菌、大腸桿菌、綠膿

表3 金銀花四倍體和二倍體水提物對甲型流感病毒FM1致細胞病變的影響

注：CPE列的每一個數(shù)字代表每一孔細胞病變等級，“-”代表無細胞病變。

桿菌、白色念球菌均有不同程度抑菌或殺菌作用，抗菌譜比較廣泛，涉及了革蘭陽性菌、革蘭陰性菌以及真菌。在革蘭陽性菌中，四倍體金銀花對乙型鏈球菌抑菌強度高于二倍體金銀花，對肺炎克雷伯菌的殺菌強度高于二倍體；在革蘭陰性菌中，二倍體金銀花對大腸桿菌和綠膿桿菌的殺菌強度高于四倍體金銀花，尤其對金黃色葡萄球菌比其他菌種表現(xiàn)更為敏感。

體外抗病毒實驗結果顯示，四倍體金銀花的毒性比二倍體金銀花要高一些，與甲型流感病毒FM1對照組相比較，四倍體金銀花在低質量濃度0.030 5 mg生藥·mL-1(1∶16 384)時對流感病毒致MDCK細胞病變有一定抑制作用，而在無毒濃度以下的較高濃度下細胞CPE相對較為嚴重，這一結果可能是因為金銀花的水提物對細胞具有一定的保全作用，中藥和病毒液以及細胞達到一個較為和諧的共存環(huán)境，四倍體金銀花和二倍體金銀花對甲型流感病毒FM1株都有一定的抑制作用，但抑制作用并不是很顯著，這可能與中藥的提取方式以及有效物質成分基礎有關，尚有待深入探討研究。四倍體金銀花的抗菌、抗病毒作用得到了初步的驗證，這將為其進一步的藥效研究提供一定的藥理依據(jù)。

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ExperimentalStudyonAntimicrobialandAntiviralActivitiesofTetraploidLoniceraeJaponicaeFlosinvitro

HUXuan1，LIWeidong2，3*，JIALing4*，ZHANGShuofeng2，WUJun4，QIUZeji4，ZENGYumin4

(1.TropicalCropsGeneticResourcesInstitute，ChineseAcademyofTropicalAgriculturalSciences/KeyLaboratoryofCroPGeneResourcesandGermplasmEnhancementinSouthernChina，Danzhou571737，China； 2.SchoolofChineseMateriaMedica，BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100102，China； 3.EngineeringResearchCenterofGoodAgriculturalPracticeforChineseCrudeDrugsofEducationMinistry，BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100102，China； 4.SchoolofBasicMedicalSciences，BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100029，China)

Objective：To study the antimicrobial and antiviral activities of the tetraploid Lonicerae Japonicae Flosinvitro.Methods：Compared with the diploid Lonicerae Japonicae Flos，the minimum inhibitory concentration (MIC) and the minimum bactericidal concentration (MBC) were used to evaluate the antimicrobial effects of the aqueous extract of the tetraploid Lonicerae Japonicae Flos againstStaphylococcusaureus，Betahemolyticstreptococcus，Escherichiacoli，Pseudomonasaeruginosa，CandidaalbicansandKlebsiellapneumonia.The maximum non-toxic concentration (TC0) and median toxic concentration (TC50) of the aqueous extract of the tetraploid on Madin-Dar by Canine Kidney (MDCK) cell were detected by cytopathic effect (CPE).Adding 100TCID50of influenza A virus FM1 into cell microtiter plates，then getting rid of the all the virus solutions after adsorbed in the plates for 1 hour，adding the maximal non-toxic concentration dilution.The influences of the aqueous extract on the CPE of FM1 were observed by using CPE method.Results：The aqueous extract of the tetraploid Lonicerae Japonicae Flos had inhibitory effect and bactericidal action againstS.aureus，B.streptococcus，E.coli，P.aeruginosa，C.albicansandK.pneumonia.It had strong inhibitory effect and bactericidal action againstS.aureusamong the six strains.The aqueous extract of the tetraploid had stronger inhibitory effect againstB.streptococcusand stronger bactericidal action againstK.pneumoniathan that of the diploid.The aqueous extract from the tetraploid showed inhibitory effect on the CPE induced by FM1when the concentration of the aqueous extract was 0.0305 mg·mL-1.While its reference herb，the diploid Lonicerae Japonicae Flos，showed inhibitory effect on the CPE when the concentration of the aqueous extract was 0.488 0 and 0.244 0 mg·mL-1.Conclusion：The tetraploid Lonicerae Japonicae Flos had the antimicrobial and antibacterial activityinvitro.

Tetraploid Lonicerae Japonicae Flos；antibacterial activity；influenza A virus FM1；antiviral activity

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.11.011

2015-03-09)

國家自然科學基金(31370360)

*

李衛(wèi)東，研究員，研究方向：道地藥材資源評價與品種創(chuàng)新，E-mail：liweidong2005@126.com； 賈翎，講師，研究方向：抗感染與免疫調節(jié)，E-mail：stella01157@sina.com