蒲黃、蒲黃炭與五靈脂配伍對血瘀模型大鼠血小板參數(shù)的影響△

沈旭楠，劉晨，陳佩東，丁安偉

(南京中醫(yī)藥大學(xué) 江蘇省方劑高技術(shù)研究重點實驗室，江蘇 南京 210023)

蒲黃、蒲黃炭與五靈脂配伍對血瘀模型大鼠血小板參數(shù)的影響△

沈旭楠，劉晨，陳佩東，丁安偉*

(南京中醫(yī)藥大學(xué) 江蘇省方劑高技術(shù)研究重點實驗室，江蘇 南京 210023)

目的：考察蒲黃、蒲黃炭分別與五靈脂配伍對血瘀模型大鼠血小板參數(shù)的影響。方法：以云南白藥為陽性藥，空白組與模型組灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液，云南白藥組與生品復(fù)方、炭品復(fù)方高(7.2 g·kg-1)、中(3.6 g·kg-1)、低(1.8 g·kg-1)劑量組灌胃相應(yīng)的藥物，連續(xù)給藥7 d，第7天給藥后皮下注射腎上腺素加冰水浸泡，復(fù)制大鼠急性血瘀模型，采用Born比濁法測定鹽酸腎上腺素(ADP)誘導(dǎo)的血小板聚集率，采用ELISA法測定血淤模型大鼠血漿中TXB2、6-keto-PGF1α水平。結(jié)果：與空白組比較，模型組大鼠血小板聚集率顯著提高(P<0.01)，TXB2顯著增加(P<0.01)，6-keto-PGF1α顯著減少(P<0.01)。與模型組比較，陽性藥可顯著抑制血瘀模型大鼠血小板聚集率(P<0.01)，使TXB2顯著減少(P<0.01)，6-keto-PGF1α顯著增加(P<0.01)；生品復(fù)方高、中、低劑量組可顯著抑制血瘀模型大鼠血小板聚集率(P<0.01，P<0.05)；炭品復(fù)方高劑量組可顯著促進血瘀模型大鼠血小板聚集率(P<0.01)；生品復(fù)方高、中、低劑量組，炭品復(fù)方中、低劑量組均能使血瘀模型大鼠TXB2顯著減少，6-keto-PGF1α顯著增加(P<0.01，P<0.05)。與相同劑量下蒲黃炭品復(fù)方比較，蒲黃生品復(fù)方使血瘀模型大鼠TXB2顯著減少，6-keto-PGF1α顯著增加(P<0.01，P<0.05)。結(jié)論：蒲黃生品復(fù)方高、中、低劑量組，炭品復(fù)方低劑量組均可抑制血瘀模型大鼠的血小板聚集率，改善血漿中TXB2、6-keto-PGF1水平，從而表現(xiàn)出一定的活血作用，且相同劑量下生品復(fù)方作用優(yōu)于炭品復(fù)方。炭品復(fù)方中、高劑量組可提高血瘀模型大鼠的血小板聚集率，這與蒲黃生品行血，炒炭后活血作用減弱的傳統(tǒng)炮制理論相符合，為蒲黃在臨床上的生熟異用提供了一定的參考。

蒲黃生品復(fù)方；蒲黃炭品復(fù)方；血小板聚集率；血栓素B2；6-酮-前列腺素

蒲黃為香蒲科植物水燭香蒲TyphaangustifoliaL.，東方香蒲TyphaorientalisPresl或同屬植物的干燥花粉。古代文獻研究表明[1]，在臨床應(yīng)用中蒲黃多是針對血證、瘀證，其生品能行血、破血，炒制后具有補血、止血功能。復(fù)方是中藥用藥的基礎(chǔ)，研究生熟飲片異用可將單味藥納入復(fù)方、生熟飲片互換，進行配伍作用研究。本實驗選取了臨床較常用的復(fù)方失笑散，其為中醫(yī)經(jīng)典名方，始載于《證類本草》卷二十二引《近效方》，按蒲黃和五靈脂等量組成，具有活血化瘀、散結(jié)止痛之功效[2-3]。本實驗用蒲黃炭替換失笑散中的蒲黃，比較二者在復(fù)方中的藥效學(xué)差異，為蒲黃在臨床上的生熟異用提供一定的參考。

1 材料

1.1 動物

SD大鼠(雌雄各半)，SPF級，體重(200±20) g，由南通大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號SCXK(蘇)2008-0010。

1.2 藥品與試劑

蒲黃采自內(nèi)蒙古巴彥淖爾市五原縣境內(nèi)；五靈脂(批號：20111106)購于山西，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)吳啟南教授鑒定為香蒲科植物水燭香蒲TyphaangustifoliaL.的干燥花粉和鼯鼠科動物復(fù)齒鼯鼠TrogopterusxanthipesMilne-Edwards的干燥糞便；云南白藥(云南白藥集團股份有限公司，批號：ZI11023)；鹽酸腎上腺素注射液(上海禾豐制藥有限公司，批號：H31021062)；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、枸櫞酸鈉、乙二胺四乙酸(EDTA)(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號分別為：F20101222，F(xiàn)20110506，T20090224)水合氯醛(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號：20080329)。ADP試劑盒(北京中勤世帝科學(xué)儀器公司)；血栓素B2(TXB2，批號：20121021)、6-酮-前列腺素(6-keto-PGF1α，批號：20121018)均購于北京華英生物技術(shù)研究所。

1.3 儀器

離心機(上海安壽科學(xué)儀器廠)；LG-PABER血小板聚集凝血因子分析儀(北京世帝科學(xué)儀器公司)；r-911全自動放免計數(shù)儀(中國科技大學(xué)實業(yè)總公司)。

1.4 供試品溶液的制備

按照《中華人民共和國藥典》2010版一部中的炮制方法制備蒲黃炭。取蒲黃、五靈脂各150 g，加10倍量水，煎煮3次，每次1 h，合并濾液濃縮，即成生品復(fù)方。用蒲黃炭替換蒲黃，同樣方法制成炭品復(fù)方。實驗前用0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液將云南白藥、復(fù)方生品、復(fù)方炭品濃縮液稀釋至所需濃度。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

取SD大鼠72只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機將其分為9組，每組8只，即空白組、模型組、云南白藥組(0.36 g·kg-1)、生品復(fù)方高(7.2 g·kg-1)、中(3.6 g·kg-1)、低(1.8 g·kg-1)劑量組、炭品復(fù)方高(7.2 g·kg-1)、中(3.6 g·kg-1)、低(1.8 g·kg-1)劑量組。空白組與模型組灌胃0.5% CMC-Na溶液；云南白藥組與生品復(fù)方高、中、低劑量組，炭品復(fù)方高、中、低劑量組灌胃等體積的相應(yīng)藥物，每日1次，連續(xù)7 d。

參照文獻[4]方法復(fù)制急性血瘀大鼠模型。第7天給藥后，空白組大鼠皮下注射等量0.9%氯化納溶液，其余各組大鼠皮下注射鹽酸腎上腺素 1 mL·kg-1，共2次，中間間隔4 h，并在第1次注射2 h后將大鼠浸入0～2 ℃冰水中5 min。最后一次注射鹽酸腎上腺素后大鼠禁食不禁水。

2.2 血小板聚集率及血漿中TXB2、6-keto-PGF1α含量測定

第8天給藥40 min后，將各組大鼠以10%水合氯醛麻醉，頸總動脈取血，3.8%枸櫞酸鈉(1∶9)抗凝，一部分全血以800 r·min-1離心10 min，取其上清液即為富血小板血漿(PRP)；余下部分以3 500 r·min-1離心10 min，取其上清液即為貧血小板血漿(PPP )[5]。按Born比濁法[6]測定血小板最大聚集率，采用ELISA法分別測定大鼠血漿中TXB2、6-keto-PGF1α含量。

2.3 統(tǒng)計學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 蒲黃生品復(fù)方、炭品復(fù)方對血瘀模型大鼠血小板聚集率的影響

與空白組比較，模型組大鼠血小板聚集率顯著提高(P<0.01)，說明造模成功。與模型組比較，云南白藥可顯著抑制鹽酸腎上腺素(ADP)誘導(dǎo)的大鼠血小板聚集率(P<0.01)；生品復(fù)方高、中、低劑量組，炭品復(fù)方低劑量組可顯著抑制ADP誘導(dǎo)的大鼠血小板聚集率(P<0.01，P<0.05)；炭品復(fù)方高劑量組可顯著促進ADP誘導(dǎo)的大鼠血小板聚集率(P<0.01)。與等劑量炭品復(fù)方比較，蒲黃生品復(fù)方可顯著抑制ADP誘導(dǎo)的大鼠血小板聚集率(P<0.01，P<0.05)。結(jié)果見表1。

表1 蒲黃生品、炭品復(fù)方對血瘀模型大鼠血小板聚集率的影響

注：與空白組比較1)P<0.01；與模型組比較2)P<0.05，3)P<0.01；生品復(fù)方與等劑量的炭品復(fù)方組比較4)P<0.05，5)P<0.01。下同。

3.2 蒲黃生品復(fù)方、炭品復(fù)方對血瘀模型大鼠TXB2、6-keto-PGF1α含量的影響

與空白組比較，模型組大鼠TXB2顯著增加(P<0.01)，6-keto-PGF1α顯著減少(P<0.01)，表明造模成功。與模型組比較，云南白藥可使血瘀模型大鼠血漿中TXB2顯著減少(P<0.01)，6-keto-PGF1α顯著增加(P<0.01)；生品復(fù)方高、中、低劑量組，炭品復(fù)方中、低劑量組均能使血瘀模型大鼠TXB2顯著減少，6-keto-PGF1α顯著增加(P<0.01，P<0.05)。與等劑量炭品復(fù)方比較，蒲黃生品復(fù)方使血瘀模型大鼠血漿中TXB2顯著減少，6-keto-PGF1α顯著增加(P<0.01，P<0.05)。結(jié)果見表2。

表2 蒲黃生品、炭品復(fù)方對血瘀模型大鼠TXB2、6-keto-PGF1α含量的影響

4 討論

血小板聚集在血液流動、止血、血栓形成過程中起重要作用。ADP是血小板聚集誘導(dǎo)劑，其誘導(dǎo)的血小板聚集率是反映血小板功能的重要指標(biāo)，當(dāng)聚集率降低時，可抑制血栓形成或使已形成的血栓溶解。蒲黃生品復(fù)方高、中、低劑量組，炭品復(fù)方低劑量組均能抑制血小板聚集，表現(xiàn)出一定的活血作用，且相同劑量下比較，生品復(fù)方效果優(yōu)于炭品復(fù)方。炭品復(fù)方中、高劑量組可促進血小板聚集，未表現(xiàn)出活血作用。

在正常生理狀態(tài)下，血栓素A2(TXA2)和前列環(huán)素(PGI2)的產(chǎn)生與釋放處于動態(tài)平衡，維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。TXA2具有強烈的促血管收縮和血小板聚集作用，而PGI2具有抗血小板聚集和舒張血管的功能[7]。由于TXA2與PGI2不穩(wěn)定，因而大多數(shù)情況下以測定其代謝產(chǎn)物TXB2及6-keto-PGF1α的含量來反映體內(nèi)TXA2和PGI2的水平[8]。大鼠造模后，血漿中TXB2含量升高，6-keto-PGF1α含量降低，出現(xiàn)瘀血傾向，蒲黃生品復(fù)方、炭品復(fù)方均能調(diào)節(jié)血瘀模型大鼠血漿中TXB2及6-keto-PGF1α的含量，使其趨于正常。與等劑量炭品復(fù)方比較，生品復(fù)方效果更優(yōu)，表現(xiàn)出顯著的活血化瘀作用。這與蒲黃生品行血，炭炒后活血作用減弱的傳統(tǒng)炮制理論相符合，為蒲黃在臨床上的生熟異用提供了一定的參考。

失笑散方中蒲黃的有效成分為香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷和異鼠李素等黃酮類成分[9-10]，五靈脂的有效成分為穗花杉雙黃酮和扁柏雙黃酮等[11-12]。本實驗前期用蒲黃炭代替蒲黃與五靈脂配伍后，發(fā)現(xiàn)香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷及穗花杉雙黃酮的溶出率較生品復(fù)方均有所降低。生品復(fù)方與炭品復(fù)方表現(xiàn)出的上述藥理作用的差異可能與化學(xué)成分的變化有關(guān)，其機理有待進一步研究。

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EffectsofTyphaeePollenandCharredTyphaeePollenwithcompatibilityofFaecesTrogopterprionHematoblasticinRatModelswithBloodStasis

SHEN Xunan，LIUChen，CHENPeidong,DINGAnwei*

(NanjingUniversityofChineseMedicine,JiangsuKeyLaboratoryforHighTechnologResearchofTraditionalChineseMedicineFomulae,JiangsuNanjing210023,China)

Objective：To observe the effect of Typhaee Pollen and Charred Typhaee Pollen with compatibility of Faeces Trogopterpri on hematoblastic in rat models with blood stasis.Methods：With the Yunnan Baiyao as positive control，the blank group and the model group wereigadministrated with 0.5% CMC-Na，the high dose(7.2 g·kg-1)，middle dose(7.2 g·kg-1)，and low dose(1.8 g·kg-1)group of Yunnan Baiyao group，the raw products and processed products of puhuang wereigadministrated for seven days.After the seventh day administration，the rats were subcutaneous injected adrenalin and doused in ice water to copy acute model with blood stasis.Born turbidimetry was used to determine ADP induced platelet aggregation rate，and TXB2、6-keto-PGF1αlevel of rat plasma were measured by ELISA.Results：Compared with the blank control group，the platelet aggregation rate of model group was significantly improved(P<0.01)，TXB2was increased significantly(P<0.01)，6-keto-PGF1αwas reduced significantly(P<0.01).Comparing with the model group，positive control drug significantly inhibited the platelet aggregation rate of rats with blood stasis(P<0.01)，and significantly reduced TXB2(P<0.01)，6-keto-PGF1αincreased significantly(P<0.01).The high dose，middle dose and low dose groups of raw products of puhuang could significantly inhibited the platelet aggregation rate of rats with blood stasis(P<0.01，P<0.05).The high dose group of processed products of puhuang significantly promoted the platelet aggregation rate of rats with blood stasis(P<0.01).The high dose，middle dose and low dose groups of raw products of puhuang and the middle dose，low dose groups of processed products of puhuang significantly reduced TXB2of rats model with blood stasis and 6-keto-PGF1αwas increased significantly(P<0.01，P<0.05).Compareing with the same dose group of processed products of puhuang，raw products of puhuang reduced TXB2of rats model with blood stasis and increased 6-keto-PGF1αsignificantly(P<0.01，P<0.05).Conclusion：The high dose，middle dose and low dose groups of raw products of puhuang and low dose group of processed products of puhuang can inhibit the platelet aggregation rate of rats model with blood stasis，improve the level of TXB2、6-keto-PGF1in plasma，and show activating blood circulation effect.In the same dose，the raw products of puhuang are better than processed products of puhuang.The middle and low group of processed products of puhuang can increase the platelet aggregation rate of rats model with blood stasis，which is coincide with the tradition processing theory that Typhaee Pollen can invigorate the circulation of blood and the effect of charred Typhaee Pollen attenuated.This research provides reference to different usage of pollen Typhaeee in clinic uses.

raw products of puhuang；processed products of Puhuang；platelet aggregation rate；TXB2；6-keto-PGF1α

2014-09-09)

國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(201107007)

*

丁安偉，博士生導(dǎo)師；Tel：(025)85811523，E-mail：awding105@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.1.003