不同粉體二妙丸HPLC指紋圖譜對(duì)比研究△

肖娟，蔡萍，萬丹，張水寒

(湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南省中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410006)

·中藥工業(yè)·

不同粉體二妙丸HPLC指紋圖譜對(duì)比研究△

肖娟，蔡萍，萬丹，張水寒*

(湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南省中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙410006)

目的：分別建立超微粉和細(xì)粉二妙丸的HPLC指紋圖譜，并對(duì)其進(jìn)行對(duì)比研究。方法：采用HPLC對(duì)不同粉體形態(tài)制備的二妙丸建立指紋圖譜，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件”建立標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，對(duì)不同粉體二妙丸的指紋圖譜進(jìn)行相似度分析。結(jié)果：方法的精密度、重復(fù)性及穩(wěn)定性良好。兩種不同粉體形態(tài)制備的二妙丸指紋圖譜的相似度均大于0.91，兩者在共有峰上沒明顯差別，而峰面積差別明顯。結(jié)論：該方法穩(wěn)定準(zhǔn)確，建立的HPLC指紋圖譜能從整體上反映出二妙丸的化學(xué)成分信息，為建立二妙丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

二妙丸；HPLC指紋圖譜；超微粉

二妙丸是《中華人民共和國藥典》2010版收載的經(jīng)典名方，由蒼術(shù)和黃柏兩味藥組成。蒼術(shù)辛溫發(fā)散、苦燥除濕；黃柏苦寒、清熱燥濕，兩者相使配伍使用，具有較強(qiáng)的清熱燥濕功能。臨床上主要用于足膝紅腫熱痛、下肢丹毒、白帶、陰囊濕癢等病癥[1-2]。近年來超微粉碎技術(shù)在中藥制劑領(lǐng)域應(yīng)用越來越廣泛，與傳統(tǒng)粉碎技術(shù)相比，其可將中藥材粉碎成微米級(jí)甚至納米級(jí)。顯著提高藥材細(xì)胞壁的破碎率，藥粉顆粒大小分布更均勻，比表面積高，球性度及均質(zhì)度更好，能更快地促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)有效成分的溶出、釋放和吸收[3-5]，提高了中藥成分的利用效率，減少浪費(fèi)。有文獻(xiàn)報(bào)道[6]，超微粉碎技術(shù)制備的二妙丸功能顯著優(yōu)于普通細(xì)粉二妙丸。中藥指紋圖譜是一種綜合的、可量化的鑒別手段，通過指紋特征相似程度的比較來判斷真?zhèn)?、評(píng)價(jià)優(yōu)劣、考察穩(wěn)定性和一致性。目前中藥指紋圖譜已經(jīng)成功用于中成藥生產(chǎn)過程中，可對(duì)中成藥的質(zhì)量進(jìn)行控制，是符合中藥特色的質(zhì)量控制模式之一[7]。本研究通過分別建立超微粉和細(xì)粉二妙丸HPLC指紋圖譜，對(duì)其進(jìn)行對(duì)比研究，以探索HPLC指紋圖譜能否全面反映出其化學(xué)成分信息以及兩者的差異，為二妙丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器

BFM-T6BI“貝利”微粉機(jī)(濟(jì)南貝利粉碎技術(shù)工程有限公司)；Winner3001干粉激光粒徑儀(濟(jì)南微納儀器有限公司)；柴田式粉碎機(jī)(天津市渤海鑫茂制藥設(shè)備有限公司)；可傾式多功能制丸機(jī)(DZ-20，溫嶺市林大機(jī)械有限公司)；高效液相色譜儀(SHIMADZ-LC-20A，日本島津)；T-214電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。

1.2試藥

鹽酸小檗堿對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110713-200208)；甲醇(分析純)；甲醇(色譜級(jí))；醋酸(色譜級(jí))；怡寶蒸餾水；其他試劑均為分析級(jí)。

1.3材料

蒼術(shù)、黃柏藥材經(jīng)湖南中醫(yī)藥研究院中藥鑒定室鑒定為正品，按《中華人民共和國藥典》2010版定性定量檢測，符合規(guī)定；細(xì)粉、超微二妙丸均為實(shí)驗(yàn)室自制，經(jīng)檢測符合中華人民共和國藥典要求。

細(xì)粉二妙丸制劑工藝：取處方比例的蒼術(shù)和黃柏混合，采用柴田式粉碎機(jī)粉碎，過5號(hào)篩，得藥材細(xì)粉，混勻，在可傾式多功能制丸機(jī)中用水泛丸，70℃干燥，滅菌即得。

超微粉二妙丸最佳制劑工藝：取處方比例的蒼術(shù)和黃柏混合，采用貝利粉碎機(jī)粉碎，藥材干燥至水分5%以下，介質(zhì)填充率60%～70%，振幅為5mm，粉碎溫度為1～15℃，粉碎時(shí)間為20min。采用Winner3001干粉激光粒徑儀測得粉體粒徑的D90<75μm(90%粒徑值)，得超微粉，混勻，在可傾式多功能制丸機(jī)中用水泛丸，70℃干燥，滅菌即得。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱：InertsilODS-2(GLSciencesInc，250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：1%的醋酸水溶液(A)，1%的醋酸甲醇溶液(B)，梯度洗脫，0～10min15%～25%B，10～30min25%～55%B，30～50min55%～85%B，50～60min85%～100%B；檢測波長：305nm；柱溫：35℃；流速：1.0mL·min-1；進(jìn)樣量：10μL。

2.2對(duì)照品溶液的制備

取鹽酸小檗堿適量，精密稱定，置于10mL的量瓶中，加甲醇制成質(zhì)量濃度為0.1mg·mL-1的對(duì)照品溶液，用0.45μm的微孔濾膜濾過，備用。

2.3供試品的制備

2.3.1細(xì)粉二妙丸供試品的制備 取10批細(xì)粉二妙丸適量，研細(xì)，取粉末6.0g，精密稱定，置于索氏提取器中。精密加入乙醚100mL，35℃水浴回流2.5h，棄去乙醚液，殘?jiān)鼡]去乙醚，加95%乙醇60mL，加熱回流提取1h，過濾。殘?jiān)?0%乙醇60mL，回流提取兩次，過濾，合并提取液，濃縮至20mL，用60%乙醇定容至25mL，搖勻，作為供試液。進(jìn)樣前用0.45μm微孔濾膜濾過，得細(xì)粉二妙丸供試品。

2.3.2超微粉二妙丸供試品的制備 取10批超微粉二妙丸適量，研細(xì)，取粉末6.0g，精密稱定，余下處理與2.3.1項(xiàng)下相同，得超微粉二妙丸供試品。

2.4方法學(xué)考察

2.4.1精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄指紋圖譜。以參照峰為對(duì)照峰計(jì)算主要色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果RSD<2.0%，相似度均大于0.96，符合指紋圖譜要求，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液10μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別在0、2、4、6、8h測定，記錄指紋圖譜。以參照峰為對(duì)照峰計(jì)算主要色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果RSD<2.0%，相似度均大于0.95，符合指紋圖譜要求，表明8h內(nèi)樣品穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次超微粉妙丸5份，按2.3.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，記錄指紋圖譜。以參照峰為對(duì)照峰計(jì)算主要色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果RSD<2.0%，相似度均大于0.95，符合指紋圖譜要求，表明方法重復(fù)性良好。

2.5指紋圖譜的建立及分析

2.5.1參照峰的選擇 鹽酸小檗堿是黃柏中的活性成分，含量較高且保留時(shí)間恰當(dāng)，也是黃柏質(zhì)量控制的指標(biāo)成分，故選用鹽酸小檗堿作為指紋圖譜的參照峰。按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10μL，記錄色譜圖，見圖1。

圖1 鹽酸小檗堿對(duì)照品液相圖

2.5.2 指紋圖譜數(shù)據(jù)的采集 分別取不同粉體二妙丸的供試品，按照2.1項(xiàng)下的色譜條件得到細(xì)粉和超微粉二妙丸的指紋圖譜。以鹽酸小檗堿為參照峰，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A版)”分別對(duì)他們的共有色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2.5.3 共有峰的標(biāo)定 對(duì)10批樣品的圖譜進(jìn)行分析比較，計(jì)算不同批次各妙丸供試品色譜圖中共有峰占總面積的百分比。結(jié)果表明，共有峰面積占總面積平均為90%以上，符合指紋圖譜的要求。

2.5.4 指紋圖譜共有模式的建立及相似度評(píng)價(jià) 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A版)”

分別對(duì)各妙丸進(jìn)行相似度分析。以細(xì)粉二妙丸為例，以鹽酸小檗堿峰為參照峰，以S5為參照?qǐng)D譜，經(jīng)過多點(diǎn)校正，自動(dòng)匹配，采用中位數(shù)法生成對(duì)照?qǐng)D譜，見圖2。標(biāo)示了細(xì)粉和超微粉二妙丸指紋圖譜中15個(gè)共有峰，其中7號(hào)峰為鹽酸小檗堿峰，見圖3～4。

2.5.5 相似度評(píng)價(jià) 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A版)”分別對(duì)細(xì)粉和超微粉二妙丸指紋圖譜進(jìn)行相似度分析，10批超微粉二妙丸與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度分別為0.945、0.938、0.935、0.917、0.925、0.934、0.928、0.956、0.945、0.956；10批細(xì)粉二妙丸與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度分別為0.928、0.935、0.926、0.913、0.929、0.932、0.933、0.956、0.943、0.911，均大于0.91，均符合指紋圖譜要求。

圖2 二妙丸典型的HPLC指紋圖譜

圖3 10批細(xì)粉二妙丸的HPLC指紋圖譜

圖4 10批超微粉二妙丸的HPLC指紋圖

可見二妙丸的指紋圖譜可以從整體反應(yīng)出其化學(xué)成分信息，可為二妙丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。此外，兩種不同粉體二妙丸在共有峰方面沒有顯著差別，但在共有峰的峰面積上，超微粉妙丸的共有峰峰面積要大于細(xì)粉妙丸，見表1。說明藥粉經(jīng)超微粉碎后，粉體粒徑減小，比表面積增大，與提取溶媒的接觸面積增加，相同的提取時(shí)間內(nèi)提取效率提高，有效成分溶出量增加，這也反映出超微技術(shù)在傳統(tǒng)丸劑制備中的優(yōu)勢。

表1 不同批次細(xì)粉、超微二妙丸共有峰峰面積均值及相應(yīng)比值

注：S1為10批細(xì)粉二妙丸各共有峰峰面積均值；S2為10批超微粉二妙丸各共有峰峰面積均值。

3 討論

本試驗(yàn)通過對(duì)兩種不同粉體的二妙丸進(jìn)行HPLC指紋圖譜研究，對(duì)共有峰進(jìn)行指認(rèn)，建立其共有模式，為建立二妙丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。同時(shí)超微粉妙丸的提取效率要優(yōu)于細(xì)粉妙丸，后續(xù)的溶出度試驗(yàn)表明，超微粉妙丸的溶出度也顯著優(yōu)于細(xì)粉妙丸。

二妙丸檢測波長的選擇是通過高效液相色譜-二極管陣列檢測器(HPLC-DAD)檢測，在2.1色譜條件下，繪出各波長三維色譜圖，選擇色譜峰信息完整、分離度好、基線平穩(wěn)、干擾最少的檢測波長；采用單因素法對(duì)二妙丸的提取方法進(jìn)行考察，回流提取效率更高；雖然蒼術(shù)中的揮發(fā)油是其有效成分，但是通過乙醚除去揮發(fā)油使得指紋圖譜的色譜峰的分離度更好，檢測基線更平穩(wěn)，確定采用2.3項(xiàng)下提取方法；此外還對(duì)流動(dòng)相及色譜柱進(jìn)行了優(yōu)選。

本試驗(yàn)成功建立了兩種粉體狀態(tài)的二妙丸HPLC指紋圖譜，為建立二妙丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了參考。對(duì)其全面質(zhì)量控制還需要采用高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(HPLC-Q/TOF-MS)進(jìn)行定性和高效液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜(HPLC-QqQ-MS)進(jìn)行定量相結(jié)合的研究，發(fā)現(xiàn)其等效部位群[8]，最終建成宏觀和微觀相結(jié)合的質(zhì)量評(píng)價(jià)方式，確保二妙丸在臨床上的有效性，這是今后研究工作的方向。

[1] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

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HPLCFingerprintStudyonUltra-microandNormalpowderofErMiaoPill

XIAOJuan，CAIPing，WANDan，ZHANGShuihan*

(HunanAcademyofChineseMedicineHunanChineseMedicinePowderandInnovationDrugProvinceDepartmentCoconstructionandKeyLaboratories，MinistryofEducation，Changsha410006，China)

Objective：To establish HPLC fingerprint of Ultra-micro and Normal powder of Er Miao Pill respectively and compare the fingerprints.Methods：The fingerprint of Ultra-micro and normal powder of Er Miao Pill was acquired by HPLC.The HPLC chromatograms were analyzed by the similarity calculation software.Results：The results of methodological study met technical requirements of HPLC fingerprint.The similarities of the ultra-micro and normal powder of Er Miao Pill exceeded0.91，The HPLC fingerprints of ultra-micro and normal powder of Er Miao Pill had obvious differences in area of common peaks but less differences in number of common peaks.Conclusion：The HPLC fingerprint method was stable and accurate and could reflect the whole chemical composition information and provide a basis for the establishment of quality standard for Er Miao pill.

Er Miao Pill；HPLC fingerprint；ultra-micro powder

湖南省戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)科技攻關(guān)與重大科技成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目(2012GK4103)

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張水寒，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥資源、制劑及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究；E-mail：zhangshuihan0220@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.12.025

2015-04-22)