叢枝菌根侵染強度與二年生三七生物量和藥效成分含量的相關(guān)性研究

曾燕，郭蘭萍，王繼永，崔秀明，楊光，王永炎，黃璐琦*

(1.中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心，北京 100700；2.中國中藥公司，北京 102600；3.北京師范大學(xué) 資源學(xué)院，北京 100875；4.昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650093)

·基礎(chǔ)研究·

叢枝菌根侵染強度與二年生三七生物量和藥效成分含量的相關(guān)性研究

曾燕1，2，3，郭蘭萍1，王繼永2，崔秀明4，楊光1，王永炎3，黃璐琦1*

(1.中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心，北京 100700；2.中國中藥公司，北京 102600；3.北京師范大學(xué) 資源學(xué)院，北京 100875；4.昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650093)

目的：研究叢枝菌根侵染強度對三七生長和藥效成分皂苷的影響；方法：在大田條件下，對三七種子接種叢枝菌根真菌Glomusmosseae，生長二年后，隨機采集100株三七，分株測定菌根侵染強度、地下部生物量和皂苷含量；結(jié)果：隨著叢枝菌根侵染強度的增加，三七地下部生物量、人參皂苷Rd和四種皂苷總含量均出現(xiàn)明顯地先增加而后出現(xiàn)下降趨勢。同時，隨著叢枝菌根侵染強度的增加，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd以及這四種皂苷的總產(chǎn)量均出現(xiàn)明顯地先增加后下降的趨勢。結(jié)論：叢枝菌根侵染強度與三七地下部生物量、皂苷含量及皂苷產(chǎn)量存在顯著的相關(guān)性，具有低侵染增加，高侵染轉(zhuǎn)而降低的現(xiàn)象。叢枝菌根適度侵染時三七有最大的生物量和最高的皂苷含量及皂甙產(chǎn)量。

叢枝菌根真菌(AMF)；菌根侵染；三七；皂苷；Hormesis

三七Panaxnotoginseng(Bruk) F.H.Chen是五加科人參屬植物，是馳名中外的名貴中藥材?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，三七在心腦血管系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病、腫瘤等方面的治療均具有很好的效果[1]。三七主要活性成分為三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd和三七素等。目前，三七均為人工栽培，病害嚴重，為控制三七病蟲害的發(fā)生，藥農(nóng)加大了農(nóng)藥施用量，這不僅造成三七藥材品質(zhì)的下降，而且加重了產(chǎn)地環(huán)境的安全隱患。

作為自然界中廣泛存在的生命共生體系，叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhiza fungi，AMF)對于植物適應(yīng)各種逆境脅迫具有重要意義?；谄鋵λ幱弥参锷L發(fā)育，抗逆性和藥效成分都有積極的促進作用，近年來藥用植物菌根研究逐漸成為熱門的研究領(lǐng)域，中藥材菌根栽培技術(shù)在優(yōu)質(zhì)綠色藥材的生產(chǎn)方面具有潛在的優(yōu)勢[2-4]。

AMF對植物的侵染受諸多因素的影響，如土壤肥力、含水量、光照等[5-6]。對于菌根技術(shù)在藥用植物中的應(yīng)用，是否侵染強度越大越好？還是侵染強度在一定范圍內(nèi)時藥用植物具有最大的產(chǎn)量或最高的藥效成分含量？明確相關(guān)問題對于菌根技術(shù)應(yīng)用于中藥材栽培生產(chǎn)中具有重要的意義，將為中藥材菌根技術(shù)的廣泛應(yīng)用和制定科學(xué)的栽培規(guī)程提供技術(shù)支撐。對此，本文以三七為例，對接種AMF的三七進行大樣本取樣，單株測定菌根侵染強度、藥材生物量和皂苷含量，考察菌根侵染強度與藥材生物量與藥效成分含量的關(guān)系，以明確侵染強度與藥材產(chǎn)量和品質(zhì)的“量——效”關(guān)系。

1 材料和方法

1.1材料

試驗所用叢枝菌根菌劑為GlomusmosseaeBGC XJ02(GM)。播種方法：在整理好的土壤上均勻地散上0.5cm厚的菌劑，覆蓋土壤約2cm，播上三七種子，三七種子播種距離為2cm×2cm。而后在種子上覆蓋土壤約2cm，蓋上一層曬干的松針，第一次澆透水，以后保持土壤含水量30%左右。整個實驗置于遮蔭棚中，遮光率約為80%。土壤基本理化性質(zhì)：有機質(zhì)3.66%，全氮0.17%，全磷0.12%，全鉀1.30%，堿解氮172.01mg·kg-1，速效磷14.21mg·kg-1，速效鉀145.13mg·kg-1， pH5.7。

2009年12月進行播種栽培，于2011年10月采收三七，隨機收集100株三七植株進行相關(guān)實驗。三七地下部分用自來水沖洗干凈后，用吸水紙吸干。同時單株收集少量三七須根段，用FAA固定液固定用于菌根侵染檢查。三七藥材置于鼓風(fēng)干燥箱中50℃干燥。

1.2測定方法

菌根侵染情況觀察：將采集的三七根透化染色：10%KOH，90℃，半小時透化；而后用1%H2O2清洗三次；加1%鹽酸酸化；采用Phillips和Hayman[7]的染色方法進行根樣染色觀察。根據(jù)Trouvelot等[8]的方法，按照菌根侵染和叢枝豐度分級的標準，輸入等級參數(shù)，用“mycocalc”軟件，計算整個根系的菌根侵染強度(Intensityofthemycorrhizalcolonisationintherootsystem)：M%=(95n5+70n4+30n3+5n2+n1)/全部根段數(shù)。其中n5表示：5級侵染的根段數(shù)；n4表示：4級侵染的根段數(shù)，等等。

三七藥材生物量測定：三七主要藥用部位為地下部分。采收時將地上部分去除，地下部分用自來水快速刷洗干凈，用吸水紙吸干，置于鼓風(fēng)干燥箱中50℃烘干24h，稱定干重即為三七藥材干重。

三七藥效成分含量測定：取三七藥材粉末(過四號篩)0.5g，精密稱定，精密加入甲醇50mL，稱定重量，40℃超聲40min，冷卻后補足減失的甲醇，搖勻，過0.45μm微孔濾膜，取續(xù)濾液做為供試品。標準品三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd購買于中國藥品食品監(jiān)督檢驗所。采用Waters2695高效液相色譜儀進行分析(HPLC)，色譜柱以18烷基硅烷鍵合為填充劑。分析時以乙腈為流動相A，以水為流動相B，梯度洗脫；流速為1.5mL·min-1；檢測波長為203nm，柱溫為25℃。進樣量為10μL。

1.3數(shù)據(jù)分析

每株三七的侵染強度對應(yīng)該株三七的地下部生物量和皂苷含量，做散點圖，二次函數(shù)擬合，SPSS17.0檢驗擬合的曲線的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1侵染強度與三七地下部生物量的相關(guān)性

隨機取菌根化三七100株，單株測定侵染強度和地下部干重，分析其相關(guān)性。結(jié)果顯示，隨著菌根侵染強度的增加，三七生物量出現(xiàn)了明顯的先增加，而后出現(xiàn)下降的趨勢。即出現(xiàn)了雙相劑量-反應(yīng)曲線為特征的一種趨勢。在侵染強度為20%～30%時，三七具有最大的生物量(圖1)。

2.2侵染強度與三七皂苷含量的相關(guān)性

對菌根化三七隨機取樣100株，單株測定侵染強度和三七地下部三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd的總含量，分析其相關(guān)性。結(jié)果顯示，隨著菌根侵染強度的增加，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd的4種皂苷的總含量出現(xiàn)先增加，而后下降的趨勢，即出現(xiàn)了雙相劑量-反應(yīng)曲線為特征的一種趨勢。特別是人參皂苷Rd和四種皂苷的總含量出現(xiàn)這種效應(yīng)的趨勢很明顯。菌根侵染強度在20%～30%時，三七具有最大的皂苷含量(圖2)。

圖1 AM真菌侵染強度與三七生物的相關(guān)性(n=100)

2.3侵染強度與三七皂苷產(chǎn)量的相關(guān)性

對菌根化三七隨機取樣100株，單株測定侵染強度、三七地下部的干重和三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd的含量。根據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)計算出各皂苷成分單株的產(chǎn)量。以每株三七的侵染強度對應(yīng)該株三七的皂苷產(chǎn)量，分析其相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著菌根真菌侵染強度的增加，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd及四種皂苷的總產(chǎn)量均出現(xiàn)先明顯的先增加，而后下降的趨勢，即出現(xiàn)了雙相劑量-反應(yīng)曲線為特征的一種趨勢，菌根侵染強度為20～30%之間時，具有最大的皂苷產(chǎn)量(圖3)。

圖2 叢枝菌根真菌侵染強度與三七皂苷含量的相關(guān)性(n=100)

圖3 AM真菌侵侵染強度對三七地下皂苷產(chǎn)量的影響(n=100)

3 結(jié)論與討論

AMF作為植物共生的一種真菌，除了為寄主提供礦質(zhì)營養(yǎng)，促進水分吸收之外，共生過程還能直接刺激植物防御物質(zhì)(如次生代謝物)的形成[9-11]，相關(guān)研究在藥用植物方面也多有報道。如接種AMF能促進白術(shù)、蒼術(shù)、川黃柏、白芷、丹參、人參、半夏等藥用植物的生長，提高特定藥效成分含量[2-3]。是否隨著AMF侵染強度的增加，藥用植物生物量和特定藥效成分含量也越高？有關(guān)AMF侵染強度與藥用植物生物量和藥效成分含量之間的“量——效”關(guān)系未見報道。研究人員考察過不同施肥量下AMF侵染對藥用植物生長和藥效成分的影響，認為在適當?shù)氖┓柿肯?，AMF的侵染更有利于藥用植物生物量和藥效成分含量的積累[12-14]。雖然隨著土壤施肥量的增加，AMF侵染強度會出現(xiàn)先增加后下降的趨勢[6]，但不能簡單地理解為AMF侵染強度與藥用植物生物量或藥效成分含量的“量——效”關(guān)系，畢竟土壤肥力的差異也是重要的影響因素。

在生物學(xué)研究領(lǐng)域中，有一種Hormesis現(xiàn)象，是指生物體在不同劑量(或程度)化學(xué)物質(zhì)(或環(huán)境因子)刺激下產(chǎn)生的，以雙相劑量——反應(yīng)曲線為特征的一種適應(yīng)性反應(yīng)，即外來刺激物質(zhì)對生物體產(chǎn)生的高劑量抑制，低劑量促進的現(xiàn)象，或稱之為“毒物興奮效應(yīng)”、“化學(xué)興奮效應(yīng)”“低劑量促進效應(yīng)”、或“低劑量有毒物質(zhì)的刺激作用等[15-16]，這些刺激物可以是化學(xué)試劑、金屬元素、也可以是病菌，產(chǎn)生的效應(yīng)可以是植物生長發(fā)育指標，也可能是次生代謝物[17]。國內(nèi)在藥用植物研究中至今沒有見到Hormesis的提法和具體的研究，但有少量類似的研究[17]。如低劑量鎘和鉛能使夏枯草果穗個數(shù)和果穗總量顯著增加，而高劑量則出現(xiàn)抑制效應(yīng)[18]；低劑量水楊酸增加了半夏株高、提高了葉綠素含量和SOD活性，同時還提高塊莖產(chǎn)量[19]；隨著NaCl濃度的增加，淫羊藿根、葉和箭葉淫羊藿根、莖、葉均呈現(xiàn)在低濃度范圍內(nèi)總黃酮含量增加，而在高濃度鹽脅迫下總黃酮含量呈下降趨勢[20]；低濃度Cd處理增加了青蒿中青蒿素含量，隨著Cd濃度的增加，青蒿素含量又出現(xiàn)下降的趨勢[21]。由于研究對象和觀察指標的不同，目前尚無能夠完全解釋“hormesis”現(xiàn)象的發(fā)生機制[22]。

本研究發(fā)現(xiàn)：隨著AMF侵染強度的增加，三七生物量、皂苷含量和皂苷產(chǎn)量均出現(xiàn)了明顯的先增加后下降的趨勢，侵染強度在一定范圍時(20%～30%)，三七地下部生物量、皂苷含量和皂苷產(chǎn)量均可達到最大值。這是否可以稱之為AMF侵染與三七生物量和藥效成分的“hormesis”現(xiàn)象呢？這在菌根研究領(lǐng)域是一個比較有意思的現(xiàn)象，但就此提出菌根侵染的“hormesis”理論可能還欠妥，畢竟菌根侵染寄主是受多因素影響的，沒有一個可簡單控制的“劑量”，這還需要更為嚴謹?shù)脑囼炄ヲ炞C。

AMF對三七生物量和藥效成分含量之間的低侵染促進，而高侵染轉(zhuǎn)而抑制的現(xiàn)象，對于指導(dǎo)中藥材的生產(chǎn)具有重要意義：可以通過調(diào)節(jié)栽培過程中的水分、肥力和光照等因子來調(diào)節(jié)AMF對藥用植物的侵染強度，從而獲得較高的藥材產(chǎn)量和較好的藥材品質(zhì)。

[1] 崔秀明.三七藥材的道地性研究[M].昆明：云南科技出版社，2007.

[2]ZengY，GuoLP，ChenBD，etal.ArbuscularmycorrhizalsymbiosisforsustainablecultivationofChinesemedicinalplants：apromisingresearchdirection[J].AmJChinMed，2013，41(6)：1199-1221.

[3]ZengY，GuoL，ChenB，etal.Arbuscularmycorrhizalsymbiosisandactiveingredientsofmedicinalplants：currentresearchstatusandprospectives[J].Mycorrhiza，2013，23(4)：253-265.

[4] 曾燕.叢枝菌根對三七生長、藥效成分及抗病性的影響[D].北京：北京師范大學(xué)，2012.

[5]SmithS，ReadD.Mycorrhizalsymbiosis[M].3rdedned.London：Academic，2008.

[6]PhillipsJM，HaymanDS.Improvedproceduresforclearingrootsandstainingparasiticandvesicular-arbuscularmycorrhizalfungiforrapidassessmentofinfection[J].TransactionsoftheBritishMycologicalSociety，1970，55(1)：158-161，N16-N18.

[7]TrouvelotA,FardeauJC,PlenchettC,etal.Nutritionalbalanceandsymbioticexpressioninmycorrhizalwheat[J].PhysiolVeg，1986(24)：300.

[8]LiuJ，WuL，WeiS，etal.Effectsofarbuscularmycorrhizalfungionthegrowth，nutrientuptakeandglycyrrhizinproductionoflicorice(GlycyrrhizauralensisFisch)[J].PlantGrowthRegulation，2007，52(1)：29-39.

[9]SchliemannW，AmmerC，StrackD.MetaboliteprofilingofmycorrhizalrootsofMedicagotruncatula[J].Phytochemistry，2008，69(1)：112-146.

[10]PrasadR，BadgeU，PuspangadanP，etal.BacopamonnieriL.：PharmacologicalaspectsandcasestudyinvolvingPiriformosaindica[J].IntJIntegrBiol，2008(3)：100-108.

[11] 賀學(xué)禮，劉媞，趙麗莉.接種叢枝菌根對不同施氮水平下黃芪生理特性和營養(yǎng)成分的影響[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2009，20(9)：2118-2122.

[12] 盧彥琦，賀學(xué)禮.AM真菌與施N量對白術(shù)幼苗化學(xué)成分和生物產(chǎn)量的影響[J].河北大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2005，25(6)：650-653.

[13] 滕華容，賀學(xué)禮.不同AM真菌和施磷量對柴胡黃酮含量的影響[J].陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005(4)：53-54.

[14]CalabreseEJ，BaldwinLA.Hormesisasabiologicalhypothesis[J].EnvironHealthPerspect，1998，106(supll1)：357.

[15]CalabreseEJ，BaldwinLA.Toxicologyrethinksitscentralbelief[J].Nature，2003，421(6924)：691-692.

[16] 郭蘭萍，張小波，楊光，等.Hormesis及其在藥用植物生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].中國中藥雜志，2011，36(5)：525-529.

[17] 武征，郭巧生，王慶亞，等.夏枯草內(nèi)在品質(zhì)及生長特性對鉛、銅、鎘脅迫的響應(yīng)[J].中國中藥雜志，2010，25(3)：263-267.

[18] 薛建平，張愛民，方中明，等.水楊酸對半夏植株生長的影響[J].中國中藥雜志，2007，32(12)：1134-1136.

[19] 陳光登，黎云祥，張浩，等.鹽脅迫對兩種淫羊藿屬植物生長及各器官總黃酮含量的影響(英文)[J].西北植物學(xué)報，2008，28(10)：2047-2054.

[20] 韓曉麗.土壤重金屬污染及其化學(xué)修復(fù)對青蒿生長及青蒿素含量的影響[D].開封：河南大學(xué)，2008.

[21] 韓善華.Hg2+脅迫對植物細胞結(jié)構(gòu)的影響及其機制[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志，2009，21(5)：480-481.

RelationshipbetweenIntensityoftheMycorrhizalColonisationinRootSystemandBiomassorSaponinsContentofPanaxnotoginseng

ZENGYan1，2，3，GUOLanping1，WANGJiyong2，CUIXiuming4，YANGGuang1，WANGYongyan3，HUANGLuqi1*

(1.NationalResourceCenterforChineseMateriaMedica，ChinaAcademyofChineseMedicalSciences，Beijing100700，China；2.NationalTraditionalChineseMedicineCorporation，Beijing100195，China；3.CollegeofResourcesScience&Technology，BeijingNormalUniversity，Beijing100875，China；4.FacultyofLifeScienceandTechnology，KunmingUniversityofScienceandTechnology，Kunming650093，China)

Objective：To research the effect of mycorrhizal colonisation on the growth and saponins content ofPanaxnotoginseng.Methods：The effects of AMF on the growth and the saponins content in the root ofP.notoginsengwere examined by introducing exogenousGlomusmosseaeinto two years plants under field condition.Results：With the increasing of intensity of the mycorrhizal colonization，it showed a trends of increase first and then decrease for the biomass，ginsenoside Rd and total contents of notoginsenoside R1，ginsenoside Rg1，ginsenoside Rb1and ginsenoside Rd in the inoculated plants.Conclusion：There was a strong correlation between the intensity of the mycorrhizal colonization and the plant biomass or contents and total yield of saponins.When the intensity of the mycorrhizal colonization was intermediate range，the biomass，saponins contents and saponins amount reached maximum.

Arbuscularmycorrhiza fungi (AMF)；mycorrhizal colonization；Panaxnotoginseng；saponins；hormesis

*

黃璐琦，研究員，研究方向：分子生藥、中藥資源；Tel：(010)64011944，E-mail：huangluqi01@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.12.006

2014-12-02)