左金方的化學(xué)成分、抗腫瘤作用及體內(nèi)過程研究進(jìn)展△

錢平，楊秀偉

(北京大學(xué) 藥學(xué)院 天然藥物學(xué)系，天然藥物及仿生藥物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191)

·綜述·

左金方的化學(xué)成分、抗腫瘤作用及體內(nèi)過程研究進(jìn)展△

錢平，楊秀偉*

(北京大學(xué) 藥學(xué)院 天然藥物學(xué)系，天然藥物及仿生藥物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191)

左金方為元代醫(yī)家朱震亨創(chuàng)立的經(jīng)典中藥復(fù)方，由黃連、吳茱萸以6∶1比例組成，現(xiàn)代臨床上主要用于治療消化道潰瘍、胃炎、胃食管反流等疾病，療效確切。本文就近年來國內(nèi)外對左金方的化學(xué)成分、抗消化道腫瘤作用以及吸收、代謝和藥物代謝動力學(xué)的研究進(jìn)展進(jìn)行概述，以期為左金方的深入研究提供參考。

左金方；黃連；吳茱萸；化學(xué)成分；抗腫瘤；吸收；代謝；藥物代謝動力學(xué)

左金方出自元代醫(yī)家朱震亨的《丹溪心法》，臨床應(yīng)用已有700余年歷史，傳統(tǒng)劑型為水丸，目前市場上還有現(xiàn)代中藥劑型左金膠囊、左金片等。左金方由黃連、吳茱萸以6∶1比例組成，具有瀉火、疏肝、和胃、止痛之功能，主要用于治療肝火犯胃、脘脅疼痛、口苦嘈雜、嘔吐酸水、不喜熱飲[1]?，F(xiàn)代臨床上主要用于治療消化道潰瘍、胃炎、胃食管反流等疾病[2]。作為療效確切的經(jīng)典中藥復(fù)方，左金方的藥理作用研究受到了廣泛關(guān)注，包括抑制胃酸分泌、抑制胃蛋白酶活性、保護(hù)胃粘膜、抑菌、鎮(zhèn)痛抗炎等，有文獻(xiàn)對相關(guān)研究報(bào)道已進(jìn)行了總結(jié)[2]。除上述作用外，近年來已有關(guān)于左金方在干預(yù)消化道腫瘤方面的研究報(bào)道，本文對此進(jìn)行概述。此外，由于目前尚無關(guān)于左金方化學(xué)成分和體內(nèi)過程研究進(jìn)展的綜述，因此本文就這兩方面進(jìn)行了總結(jié)。

1 化學(xué)成分

1.1 單味藥材的化學(xué)成分

左金方由黃連和吳茱萸組成，黃連是毛茛科植物黃連CoptischinensisFranch.、三角葉黃連Coptis.deltoideaC.Y.Cheng et Hsiao或云連CoptisteetaWall.的干燥根莖。吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸Euodiarutaecarpa(Juss.)Benth.、石虎Euodiarutaecarpa(Juss.)Benth.var.officinalis(Dode)Huang和疏毛吳茱萸Euodiarutaecarpa(Juss.)Benth.var.bodinieri(Dode)Huang 的干燥近成熟果實(shí)[3]。兩味藥材的主要成分均為生物堿類，除此之外，黃連中還含有有機(jī)酸和木脂素類成分[4]，吳茱萸中還含有萜、黃酮和有機(jī)酸等類成分[5]。

目前在黃連中發(fā)現(xiàn)的生物堿基本上都是異喹啉類生物堿，而且大部分是芐基異喹啉類，其中原小檗堿類生物堿，尤其是季銨型原小檗堿類生物堿在黃連中含量最高，包括小檗堿(berberine)、巴馬汀(palmatine)、黃連堿(coptisine)、表小檗堿(epiberberine)、藥根堿(jatrorrhizine)和非洲防己堿(columbamine)等[6-7]，這幾個成分可占到黃連總生物堿的70%～80%[4]。叔胺型原小檗堿類生物堿主要為8-氧化黃連堿(8-oxocoptisine)、8-氧化小檗堿(8-oxyberberine)等[8]，而紫堇屬植物中廣泛存在的四氫小檗堿類生物堿在黃連中卻很少見。此外黃連還含有阿樸菲類生物堿，如木蘭花堿(magnoflorine)[7]、簡單異喹啉類生物堿如紫堇定(corydaldine)、降氧化北美黃連次堿(noroxyhydrastinine)等[8]。

吳茱萸中的生物堿主要包括吲哚類和喹諾酮類兩類。吲哚類生物堿包括具有5個完整環(huán)狀結(jié)構(gòu)的吲哚喹唑啉類，以及部分環(huán)狀結(jié)構(gòu)開裂的衍生物，還有少量只具有吲哚片段的化合物。吲哚類生物堿中以吳茱萸堿(evodiamine)、吳茱萸次堿(rutaecarpine)、去氫吳茱萸堿(dehydroevodiamine)最為普遍[9-13]，且含量較高[14]。此外還有羥基吳茱萸堿(hydroxyevodiamine)、吳茱萸酰胺(evodiamide)[9]、(7R，8S)-7-羥基-8-甲氧基-吳茱萸次堿[(7R，8S)-7-hydroxy-8-methoxy-rutaecarpine]、(7R，8S)-7-羥基-8-乙氧基-吳茱萸次堿[(7R，8S)-7-hydroxy-8-ethoxy-rutaecarpine]、(7R，8S)-7，8-二羥基-吳茱萸次堿[(7R，8S)-7，8-dihydroxy-rutaecarpine]、1-羥基吳茱萸次堿(1-hydroxyrutaecarpine)[10]、瑞特西寧(rhetsinine)[11]、吳茱萸果酰胺Ⅰ(wuchuyuamide Ⅰ)[12]、吳茱萸新堿(wuzhuyurutine)A和B[15]等。吳茱萸中喹諾酮類生物堿的母核結(jié)構(gòu)單一，但由于側(cè)鏈變化衍生的化合物較多[16-17]，其中含量較高的有吳茱萸卡品堿(evocarpine)、二氫吳茱萸卡品堿(dihydroevocarpine)等[17]。吳茱萸中的萜類化合物主要為檸檬苦素類化合物，是連接有呋喃環(huán)的高度氧化的四環(huán)降三萜類化合物，包括檸檬苦素(limonin；evodin；obaculactone)、吳茱萸內(nèi)酯醇(evodol)[12]、吳茱萸內(nèi)酯素(evodirutaenin)[18]、吳茱萸塔寧(evolimorutanin)[19]、疏毛吳茱萸內(nèi)酯素(evorubodinin)[20]等，其中檸檬苦素為含量較高的檸檬苦素類成分。

1.2 左金方的化學(xué)成分

對于左金方及相關(guān)復(fù)方的化學(xué)成分，文獻(xiàn)報(bào)道中多采用分析手段進(jìn)行研究，如薄層色譜法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)等[21]，本課題組首次采用化學(xué)分離的方法，從左金方70%乙醇提取物的醋酸乙酯及正丁醇萃取部位分離鑒定了30個化合物，包括22個生物堿、6個檸檬苦素類化合物和2個甾體類化合物[22-24]。除上述已知成分外，還得到6個新生物堿：10-甲氧基吳茱萸酰胺Ⅰ(10-methoxy-wuchuyuamide Ⅰ，1)、8-三氯甲基-7，8-二氫表小檗堿(8-trichloromethyl-7，8-dihydroepiberberine，2)、黃連醛堿(coptichic aldehyde，3)、黃連酯堿(coptichine，4)、13-醛基-8-氧化黃連堿(13-carboxaldehyde-8-oxocoptisine，5)、黃連酰胺(coptichinamide，6)；另有4個新檸檬苦素類化合物：吳茱萸檸檬辛素(euodirutaecin)A(7)和B(8)、吳茱萸內(nèi)酯素A(evodirutaenin A，9)、石虎檸檬素A1(shihulimonin A1，10)[23]，它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。其中化合物3、4和6結(jié)構(gòu)新穎，且具有較好的抗腫瘤活性[22]。朔源研究表明化合物1、7～10來源于吳茱萸，化合物2～6來源于黃連，從單味藥的化學(xué)成分分離沒有得到這些化合物，至少表明復(fù)方對這些化合物具有助溶作用或轉(zhuǎn)化作用。從左金方中還分離鑒定了吳茱萸苦素(rutaevin，11)和12α-羥基吳茱萸苦素(12α-hydroxyrutaevin，12)，亦來源于吳茱萸，與吳茱萸中的其他檸檬苦素類化合物不同，化合物11和12具有5β-H構(gòu)型，它們對脂多糖所致RAW264.7巨噬細(xì)胞過量產(chǎn)生一氧化氮的抑制作用強(qiáng)于其他檸檬苦素類化合物可能與此有關(guān)[20]。從左金方的化學(xué)成分指紋圖譜[25]中均存在吳茱萸堿、吳茱萸次堿、小檗堿、巴馬汀、黃連堿、表小檗堿和藥根堿及它們的生物學(xué)活性報(bào)道[10，26]分析，這些生物堿對左金方的作用均有貢獻(xiàn)。

圖1 化合物1～12的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

2 抗消化道腫瘤作用

左金方在現(xiàn)代臨床上主要用于治療消化道潰瘍、胃炎、胃食管反流等疾病，已有文獻(xiàn)對相關(guān)藥理作用的研究進(jìn)行了總結(jié)[2]，本文不再贅述。除此之外，值得關(guān)注的是左金方在預(yù)防和治療消化道腫瘤方面的發(fā)展?jié)摿?，近年來已有相關(guān)藥理作用的體內(nèi)、外研究報(bào)道。

研究表明[27]，黃連、吳茱萸不同配比的水提物能抑制人胃癌細(xì)胞(SGC-7901)增殖并誘導(dǎo)其凋亡，當(dāng)黃連、吳茱萸配比為6∶1時，作用最明顯。而細(xì)胞線粒體膜電位的下降提示線粒體依賴的凋亡通路參與了其細(xì)胞凋亡。在左金方對大腸癌發(fā)生、發(fā)展的干預(yù)作用研究中，發(fā)現(xiàn)小檗堿和吳茱萸堿能抑制人大腸癌細(xì)胞(HT29)的增殖和端粒酶的活性，而在1，2-二甲基酰肼誘導(dǎo)的大鼠大腸癌模型中，左金方能阻滯早期癌癥的發(fā)生和發(fā)展，其抗腫瘤作用可能與增加結(jié)腸腺瘤性息肉基因(APC)的表達(dá)量及抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(Dnmts)的活性有關(guān)[28-30]。另有研究表明，左金方及其中的單體成分小檗堿和吳茱萸堿對人肝癌細(xì)胞(HepG2)的增殖具有抑制作用，該作用主要是通過阻斷激活蛋白-1(AP-1)和/或核因子-κB(NF-κB)通路實(shí)現(xiàn)的[31]。本課題組采用人胃癌細(xì)胞(NCI-N87)和人結(jié)腸腺癌細(xì)胞(Caco-2)對從左金方中分離得到的22個生物堿和6個檸檬苦素類化合物進(jìn)行了活性評價(jià)[22-24]，結(jié)果表明黃連堿、小檗堿、吳茱萸堿和吳茱萸次堿對兩種腫瘤細(xì)胞系均具有較好的增殖抑制活性。這4個生物堿在復(fù)方中含量較高，但吸收程度較低，因此可能是左金方在胃腸道局部發(fā)揮抗腫瘤作用的主要有效成分[24]。

3 體內(nèi)過程研究

3.1 吸收

3.1.1 黃連中化學(xué)成分的吸收研究 小檗堿是黃連中的主要成分，但口服吸收差。研究表明P-糖蛋白(P-gp)是限制小檗堿腸吸收的重要因素[32-33]。另有報(bào)道采用人源腸Caco-2單層細(xì)胞模型對黃連生物堿進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)研究[34-35]，結(jié)果小檗堿、巴馬亭、藥根堿和黃連堿的表觀滲透系數(shù)Papp(AP→BL)均介于0.1～1×10-6cm·s-1之間，外流率(efflux ratio)均大于2。抑制劑實(shí)驗(yàn)表明這4個化合物均為P-gp的底物，而非多藥耐藥蛋白2(MRP2)的底物，4個化合物在1～100 μmol·L-1的濃度范圍內(nèi)對P-gp沒有抑制作用。大鼠外翻腸囊模型和在體腸灌流模型的研究結(jié)果表明，黃連提取物中的小檗堿、巴馬汀和藥根堿在腸道的轉(zhuǎn)運(yùn)方式均為被動擴(kuò)散，并且小腸中、上部，即十二指腸和空腸為優(yōu)勢吸收部位，吸收程度高于回腸和結(jié)腸[36-37]。

3.1.2 吳茱萸中化學(xué)成分的吸收研究 本實(shí)驗(yàn)室曾對吳茱萸堿、去氫吳茱萸堿、吳茱萸次堿和吳茱萸新堿B在人源腸Caco-2細(xì)胞單層模型上的膜透過性進(jìn)行了考察，結(jié)果Papp值分別為2.32×10-5、1.26×10-5、8.78×10-6、3.34×10-6cm·s-1，表明前二者均為透過性良好的化合物，后兩者均為中等吸收的化合物。但在實(shí)驗(yàn)過程中也發(fā)現(xiàn)吳茱萸堿、吳茱萸次堿溶解度較差，并推測該不利因素會影響其吸收[38]。有研究采用大鼠腸外翻模型分析吳茱萸提取物在腸道的吸收特征，結(jié)果表明吳茱萸堿、吳茱萸次堿在空腸和回腸的吸收過程中可能存在主動轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，而且轉(zhuǎn)運(yùn)不受P-gp影響[39]。采用人源腸Caco-2細(xì)胞單層模型亦評價(jià)了吳茱萸中檸檬苦素類化合物吳茱萸內(nèi)酯醇、檸檬苦素和石虎檸檬素A(shihulimonin A)的腸膜透過性[40]，結(jié)果表明吳茱萸內(nèi)酯醇和檸檬苦素是吸收良好的化合物，而石虎檸檬素A在吸收過程可能發(fā)生了代謝。

3.1.3 復(fù)方化學(xué)成分的吸收研究 在對左金方及相關(guān)復(fù)方的研究方面，大鼠腸灌流模型和人源腸Caco-2細(xì)胞單層模型的研究結(jié)果均表明，隨著配伍吳茱萸的比例增加，黃連生物堿中的小檗堿、巴馬亭、黃連堿和藥根堿的吸收隨之增加，其機(jī)制可能與抑制P-gp有關(guān)[41-42]。

3.2 代謝

在離體試驗(yàn)中，小檗堿對重組人肝CYP2D6活性有一定的抑制作用，半數(shù)抑制濃度為(7.40±0.36) μmol·L-1；而對重組人肝CYP1A2和CYP3A4活性的抑制作用很弱，提示可能不會發(fā)生臨床意義上的藥物相互作用[43]。在體外肝微粒體溫孵實(shí)驗(yàn)中，小檗堿(13)可被大鼠肝微粒體藥物代謝酶迅速代謝，產(chǎn)生4個主要代謝產(chǎn)物：小檗紅堿(berberrubine，14)、芬氏唐松草定堿(thalifendine，15)、去亞甲基小檗堿(demethyleneberberine，16)和藥根堿(17)，見圖2[44]，代謝反應(yīng)僅發(fā)生在取代基上，母核結(jié)構(gòu)剛性強(qiáng)。

圖2 小檗堿的大鼠肝微粒體代謝

動物種屬不同、細(xì)胞色素藥物代謝酶亞型不同，小檗堿的代謝位點(diǎn)亦有一定差異，見圖3[45]。

吳茱萸堿、吳茱萸次堿和檸檬苦素對小檗堿的代謝有抑制作用，其中吳茱萸次堿和檸檬苦素的代謝抑制作用明顯強(qiáng)于吳茱萸堿。在體誘導(dǎo)-體外肝微粒體溫孵的研究結(jié)果表明，黃連-吳茱萸配伍給藥后可通過抑制大鼠肝微粒體中紅霉素-N-脫甲基酶(ERD)、氨基比林-N-脫甲基酶(ADM)的活性而降低小檗堿的肝代謝[46-47]。表明黃連-吳茱萸配伍增加了小檗堿的生物利用度，使小檗堿能夠維持一定的血藥濃度。但也有研究者在預(yù)先給予大鼠吳茱萸提取物進(jìn)行處理后，再給予黃連提取物，以評價(jià)吳茱萸對小檗堿體內(nèi)暴露程度的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，預(yù)先給予吳茱萸提取物雖然能夠一定程度上減少小檗堿Ⅰ相代謝產(chǎn)物的生成，但其更主要的作用是誘導(dǎo)大鼠肝臟尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶1A1(UGT1A1)的活性和表達(dá)量，從而加快小檗堿的代謝，最終導(dǎo)致小檗堿體內(nèi)暴露水平下降[48]。

圖3 小檗堿的代謝和/生物轉(zhuǎn)化

3.3 藥物代謝動力學(xué)研究

有研究者給大鼠灌胃黃連-吳茱萸粉末(6∶1)的羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)混懸劑后，采用LC-MS/MS同時測定了小檗堿、巴馬汀和藥根堿的血藥濃度，藥物代謝動力學(xué)數(shù)據(jù)表明三者達(dá)峰時間(tmax)均為90 min；消除半衰期(t1/2)分別為(336.9±46.5)、(215.7±33.5)、(325.3±8.0) min；達(dá)峰濃度(Cmax)分別為(121.1±11.9)、(35.2±9.5)、(219.9±12.8) ng·mL-1。在3個生物堿的藥時曲線中均出現(xiàn)了三峰現(xiàn)象，文獻(xiàn)報(bào)道中推測可能是由于組織中藥物濃度高導(dǎo)致的向血漿中再分布，或者是肝腸循環(huán)所致[49]。

有研究比較了黃連和吳茱萸配伍對去氫吳茱萸堿和黃連堿藥物代謝動力學(xué)行為的影響，結(jié)果表明配伍對二者的影響截然相反，一方面可以顯著增加去氫吳茱萸堿的藥時曲線下面積(AUC)和Cmax，并使tmax提前；而配伍后黃連堿的Cmax和AUC均有不同程度的下降，同時tmax延遲，t1/2縮短。此外，在二者的藥時曲線中也都出現(xiàn)了多峰現(xiàn)象[50]。

在分別灌胃給予大鼠小檗堿單體和單味黃連及黃連-吳茱萸藥對(6∶1)的65%乙醇提取物實(shí)驗(yàn)中，對小檗堿的藥物代謝動力學(xué)參數(shù)進(jìn)行了對比研究，結(jié)果表明大鼠灌胃藥對提取物后小檗堿的tmax最小，Cmax最大，表明黃連、吳茱萸配伍后，吳茱萸能促進(jìn)小檗堿的吸收[51]。

4 結(jié)語

復(fù)方是中藥臨床應(yīng)用的主要形式，因此以復(fù)方為載體進(jìn)行中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究更加符合中醫(yī)藥的特點(diǎn)。左金方為經(jīng)典中藥復(fù)方，研究表明其具有多種藥理作用，而這些作用源于其中化學(xué)成分的多樣性?；瘜W(xué)成分研究是中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究的重要基礎(chǔ)，因此本文首先對左金方的化學(xué)成分研究進(jìn)展進(jìn)行了概述。中藥復(fù)方多為口服給藥，其中的化學(xué)成分從進(jìn)入消化道到產(chǎn)生效應(yīng)，中間經(jīng)歷了吸收、分布、代謝、排泄(ADME)的過程[52]，因此體內(nèi)過程研究是闡明中藥物質(zhì)基礎(chǔ)的重要途徑之一。此外，由于藥物在血液循環(huán)系統(tǒng)中的經(jīng)時濃度變化是對其ADME的宏觀、定量的反映，所以本文對左金方相關(guān)的吸收、代謝以及藥物代謝動力學(xué)研究概況進(jìn)行了總結(jié)。

根據(jù)以上的總結(jié)，可以發(fā)現(xiàn)對左金方體內(nèi)過程的研究仍有待深入。首先，目前研究的左金方中的單體成分較少，結(jié)構(gòu)類型較為單一，難以全面反映整個復(fù)方的體內(nèi)過程，而這又與缺乏化學(xué)研究有關(guān)；其次，藥物在體內(nèi)經(jīng)歷的是動態(tài)、連續(xù)的過程，因此如何將包括吸收、代謝、活性、毒性等各個環(huán)節(jié)在內(nèi)的研究結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)一，完整、全面地反映左金方的體內(nèi)過程，同時闡明體內(nèi)過程與藥理效應(yīng)之間的關(guān)系，是亟待進(jìn)行的研究內(nèi)容。左金方主要化學(xué)成分明確，對其物質(zhì)基礎(chǔ)及其體內(nèi)過程的深入研究，有助于將左金方開發(fā)為有效組份的現(xiàn)代中藥制劑。

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Progresses in Chemical Constituents，Antitumor Activities and Physiological Disposition Studies of Zuojin Formula

QIAN Ping，YANG Xiuwei*

(State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs，School of Pharmaceutical Sciences，Peking University，Beijing 100191，China)

Zuojin Formula，an important formula of Traditional Chinese Medicine(TCM)，was originated by Zhu Zhen-Heng in the first half of the 14thcentury in China，and it consists of Coptidis Rhizoma(CR)and Euodiae Fructus(EF)by the ratio of 6∶1(w/w).Zuojin Formula is mainly used to treat some gastrointestinal diseases in modern clinic，like gastric ulcer，gastritis，gastro-esophageal reflux disease，etc.In this article the progresses in chemical constituents，antitumor activities，absorption，metabolism and pharmacokinetic studies of Zuojin Formula were summarized in order to provide some help for the further researches of Zuojin Formula.

Zuojin Formula；Coptidis Rhizoma；Euodiae Fructus；chemical constituents；antitumor activities；absorption；metabolism；pharmacokinetic

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.2.021

2014-10-06)

國家自然科學(xué)基金(81173508)；國家科技支撐計(jì)劃(2011BAI07B08)

*

楊秀偉，教授，博士生導(dǎo)師；Tel：(010)82801569，E-mail：xwyang@bjmu.edu.cn