卷丹百合鱗莖高效離體再生體系的研究△

鐘燦，王蕾，劉浩，肖深根，張水寒*

(1.湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410013；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝園林學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

·中藥農(nóng)業(yè)·

卷丹百合鱗莖高效離體再生體系的研究△

鐘燦1，王蕾1，劉浩1，肖深根2，張水寒1*

(1.湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410013；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝園林學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

目的：以湖南主栽卷丹百合的鱗莖為起始外植體，建立卷丹百合鱗莖高效離體再生體系。方法：比較消毒方法、不同6-BA濃度、培養(yǎng)基組合和環(huán)境條件等對(duì)鱗莖污染率、不定芽的誘導(dǎo)、伸長(zhǎng)和生根的影響。結(jié)果：用8% NaClO消毒15 min配合0.1% HgCl2消毒15～20 min后，消毒效果較好，鱗片成活率高；溫度為26±2 ℃，光照強(qiáng)度為2000 Lx條件下，6-BA濃度為2.5～3.5 mg·L-1，鱗片萌芽最快，不定芽生長(zhǎng)最健壯；0.5 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-12，4-D培養(yǎng)基組合有利于不定芽的生長(zhǎng)；0.5 mg·L-1NAA培養(yǎng)基組合最有利于不定芽的生根，移栽成活率高達(dá)100%。結(jié)論：建立此體系為卷丹的脫毒苗培育和品種改良提供一定技術(shù)支持。

湖南；卷丹；鱗片；高效；離體再生

卷丹(LiliumlancifoliunThunb.)為百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium)的多年生球根類植物，藥食兩用，藥用及食用價(jià)值較高，國內(nèi)外市場(chǎng)需求量越來越大，也是目前湖南省中藥材種植的主栽品種之一，種植面積超過25 000 hm2[1]。

卷丹百合的繁殖以優(yōu)質(zhì)鱗莖無性繁殖為主，但無性繁殖存在繁殖系數(shù)小、種性退化、病害加重等問題，且需要大量?jī)?yōu)質(zhì)種球，不利于卷丹種植的可持續(xù)發(fā)展和經(jīng)濟(jì)效益的提高。而高效離體再生能大大提高鱗莖的繁殖系數(shù)，快速提供更多優(yōu)質(zhì)的種苗，且能為卷丹百合脫毒苗和新品種的培育提供了可靠的技術(shù)支持。目前國內(nèi)外諸多學(xué)者對(duì)百合的組織培養(yǎng)的進(jìn)行研究，起源較早[2-4]，然而，關(guān)于卷丹百合的高效離體再生的研究近幾年才慢慢興起[5-9]，針對(duì)卷丹忌連作、病害嚴(yán)重等問題，對(duì)其脫毒快繁技術(shù)研究鮮有報(bào)道。本課題組針對(duì)組織培養(yǎng)3個(gè)最主要影響因素外植體的選擇、培養(yǎng)基類型和環(huán)境條件[10]，利用卷丹百合的鱗莖，通過對(duì)卷丹百合消毒方法、培養(yǎng)基組合和培養(yǎng)環(huán)境條件進(jìn)行研究，建立了卷丹百合鱗莖離體高效再生體系，并篩選適合進(jìn)行脫毒處理的溫度，以期為卷丹百合脫毒苗的培育和品種改良提供一定試驗(yàn)基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試品種

湖南龍山縣百合種植專用品種：卷丹百合，由湖南省中醫(yī)藥研究院謝昭明研究員鑒定為卷丹百合。

1.2 培養(yǎng)基

將接種工具、培養(yǎng)器皿以及不同的培養(yǎng)基在立式壓力蒸汽滅菌鍋121 ℃，105 Kpa條件下滅菌20 min后使用。培養(yǎng)條件溫度為26±1 ℃、光強(qiáng)2000 Lx、濕度80%、每d光照14 h。

1.2.1 初代培養(yǎng)基篩選：MS+0～4.5 mg·L-16-BA。

1.2.2 繼代培養(yǎng)基優(yōu)化：以MS為基本培養(yǎng)基，按照L9(34)正交試驗(yàn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別考察6-BA、NAA、2，4-D 3個(gè)因素對(duì)卷丹百合不定芽的生長(zhǎng)的影響，每個(gè)因素設(shè)計(jì)3個(gè)水平，因素水平表見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平 mg·L-1

以上培養(yǎng)基的均添加200 mg·L-1的肌醇，30 g·L-1蔗糖和6.0 g·L-1瓊脂，pH值均為5.5～5.8。

1.2.3 生根培養(yǎng)基篩選：1/4 MS(記作處理A，下同)；1/2 MS(B)；1/4 MS+0.5 mg·L-1IBA(C)；1/4 MS+1.0 mg·L-1IBA(D)；1/4 MS+0.1 mg·L-1NAA(E)；1/4 MS+0.5 mg·L-1NAA(F)。以上培養(yǎng)基的均添加200 mg·L-1的肌醇，20 g·L-1蔗糖和6.5 g·L-1瓊脂，pH值均為5.5～5.8。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 卷丹百合的消毒 取干凈、無病斑的卷丹百合鱗莖，加適量洗衣粉用自來水沖洗1～2 h后，在超凈工作臺(tái)上用70%酒精浸泡1 min，然后用8%的NaClO加數(shù)滴吐溫浸泡10～20 min，用無菌蒸餾水清洗5 次，再用0.1% HgCl2加數(shù)滴吐溫浸泡0～25 min，或者用0.1% HgCl2加數(shù)滴吐溫浸泡15 min后把鱗莖切成1 cm2左右的小鱗片再用0.1% HgCl2浸泡5 min二次消毒方法，最后用無菌水洗4～6次，接種后統(tǒng)計(jì)鱗片的污染率和鱗片生長(zhǎng)情況。

1.3.2 卷丹百合離體再生培養(yǎng)基的篩選 在超凈工作臺(tái)上將鱗莖切成1 cm左右的小鱗片作為起始外植體，接種在初代培養(yǎng)基上，15 d后統(tǒng)計(jì)芽分化率和每個(gè)鱗片上芽的數(shù)量，隨后轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基上，30 d后統(tǒng)計(jì)芽的生長(zhǎng)情況。當(dāng)芽伸長(zhǎng)到3～5 cm后，轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上，統(tǒng)計(jì)根的生長(zhǎng)率和生長(zhǎng)情況，待長(zhǎng)出健壯根系后，并煉苗3～7 d，移栽到高溫高壓滅菌的珍珠巖：蛭石：泥炭土為1∶1∶2的栽培基質(zhì)中，10 d后統(tǒng)計(jì)移栽成活率。

1.3.2卷丹百合離體再生培養(yǎng)條件的篩選 將接種的卷丹百合鱗片培養(yǎng)條件溫度為26～40 ℃、光強(qiáng)0～4000 Lx、濕度80%、每d光照12 h條件下培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)其萌芽啟動(dòng)時(shí)間、不定芽誘導(dǎo)率和鱗莖生長(zhǎng)情況等，優(yōu)選最佳培養(yǎng)條件。

2 結(jié)果與分析

2.1卷丹百合鱗片消毒方法的研究

表2 不同消毒組合的消毒效果

用同樣濃度的NaClO和HgCl2對(duì)卷丹百合鱗片進(jìn)行不同時(shí)間的消毒處理，5 d后統(tǒng)計(jì)不同鱗片的污染率和成活率。由表2可以看出，單獨(dú)使用8%的NaClO消毒，隨著消毒時(shí)間的延長(zhǎng)，鱗片的污染率有所降低，但總體來說消毒不夠徹底，最終鱗片都因?yàn)槲廴境苫盥蕿?。然而用NaClO配合0.1% HgCl2進(jìn)行消毒，隨著HgCl2使用時(shí)間的延長(zhǎng)污染率顯著降低，當(dāng)HgCl2消毒時(shí)間增至25 min時(shí)，污染率最低為0。而用8%NaClO消毒10～15 min配合0.1%的HgCl2消毒15～20 min時(shí)，5 d左右鱗片轉(zhuǎn)綠，9 d左右開始萌發(fā)不定芽，成活率最高。當(dāng)NaClO消毒時(shí)間為20 min，或者HgCl2消毒時(shí)間為25 min，以及NaClO消毒15 min 配合HgCl2消毒15 min，將鱗片切開再利用HgCl2進(jìn)行5 min二次消毒時(shí)，大部分鱗片組織壞死發(fā)白，成活率明顯降低。因此建立卷丹百合鱗莖再生體系的最佳消毒方法為以8% NaClO消毒15 min配合0.1% HgCl2消毒15～20 min，其污染率較低，鱗片成活率高達(dá)90%以上。

2.2 6-BA濃度卷丹百合鱗片分化性能的影響

表3 6-BA濃度對(duì)鱗片分化性能的影響

從表3可以看出，6-BA對(duì)卷丹百合鱗片不定芽的分化有明顯的促進(jìn)作用，在不添加6-BA的培養(yǎng)基中鱗片的萌芽啟動(dòng)時(shí)間、不定芽分化率和平均芽數(shù)都明顯低于添加了6-BA培養(yǎng)基中的，隨著6-BA濃度的增加卷丹百合鱗片不定芽的誘導(dǎo)率和平均芽數(shù)呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，卷丹百合鱗片芽誘導(dǎo)率最高和平均芽數(shù)最多均是6-BA濃度為4.5 mg·L-1時(shí)，分別為94.02%和5.36個(gè)。而鱗片萌芽啟動(dòng)時(shí)間則有所不同，6-BA濃度在0～2.5 mg·L-1范圍內(nèi)，鱗片的萌芽啟動(dòng)時(shí)間隨著6-BA濃度的增加而提前，當(dāng)6-BA濃度為2.5 mg·L-1時(shí)，鱗片的啟動(dòng)時(shí)間最快為9 d，而當(dāng)6-BA濃度為3.5 mg·L-1和4.5 mg·L-1時(shí)，雖然鱗片的不定芽誘導(dǎo)率和不定芽平均數(shù)都高于6-BA濃度為2.5 mg·L-1時(shí)，但是萌芽啟動(dòng)時(shí)間推遲到10 d，且繼代培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)初代培養(yǎng)中6-BA濃度越高，其不定芽生長(zhǎng)較為緩慢，不利于壯苗培育。因此，6-BA濃度對(duì)鱗片的分化性能有影響，2.5～3.5 mg·L-16-BA濃度適宜卷丹百合鱗片的分化。

2.3 不同激素配比對(duì)鱗片不定芽生長(zhǎng)的影響

表4 不同激素組合對(duì)鱗片不定芽生長(zhǎng)情況的影響

表5 方差分析表

*代表P<0.05。

為了研究適合卷丹鱗片不定芽生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，獲得更多健壯的再生植株，提高其再生頻率。按照L9(34)正交試驗(yàn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別考察6-BA、NAA、2，4-D 3個(gè)因素對(duì)卷丹百合不定芽生長(zhǎng)的影響。由表4直觀分析結(jié)果可以看出，對(duì)不定芽株高的影響試驗(yàn)因素是2，4-D的R值最大，因素6-BA次之，NAA的R值最小，說明參試因素對(duì)卷丹鱗片不定芽生長(zhǎng)的影響順序?yàn)?，4-D>6-BA>NAA。從表5的方差分析結(jié)果中可以看出，2，4-D對(duì)不定芽伸長(zhǎng)的影響存在顯著差異(P<0.05)，6-BA和NAA對(duì)其伸長(zhǎng)影響未達(dá)到顯著差異水平(P>0.05)。這說明激素對(duì)不定芽生長(zhǎng)的影響2，4-D占主導(dǎo)作用，方差分析結(jié)果與直觀分析結(jié)果一致。因此MS+0.5 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-12，4-D最適合卷丹鱗片不定芽的生長(zhǎng)，有利于培育壯苗。

2.4 環(huán)境條件對(duì)卷丹百合鱗片分化性能的影響

表6 不同光照度對(duì)鱗片分化性能和生長(zhǎng)的影響

表7 不同溫度對(duì)鱗片分化性能和生長(zhǎng)的影響

由表6、表7可以看出，光照強(qiáng)度和溫度對(duì)卷丹百合鱗片組織培養(yǎng)有一定影響。光照強(qiáng)度的大小影響鱗片萌芽啟動(dòng)時(shí)間、分化頻率以及小鱗莖的顏色，當(dāng)鱗片處于黑暗條件下(光照度為0 Lx)時(shí)，其萌芽啟動(dòng)時(shí)間最早為8 d，而不定芽誘導(dǎo)率則是當(dāng)光照度為2000 Lx時(shí)最高為90.12%，且生長(zhǎng)的小鱗莖為綠色，生長(zhǎng)較快，萌發(fā)后15 d左右有葉片長(zhǎng)出，葉片呈鮮綠色，生長(zhǎng)健壯。而在光照強(qiáng)度為0和4000 Lx條件下的小鱗莖生長(zhǎng)緩慢，0 Lx條件鱗莖呈白色，有少量短小的葉片萌發(fā)也呈白色，4000 Lx條件下鱗莖呈深褐色，12 d未見葉片生長(zhǎng)。溫度對(duì)鱗片的不定芽分化影響顯著，對(duì)小鱗莖的生長(zhǎng)影響較大，主要表現(xiàn)為高溫條件下萌芽啟動(dòng)時(shí)間明顯延長(zhǎng)，不定芽誘導(dǎo)率顯著降低，鱗莖生長(zhǎng)緩慢甚至枯死。因此卷丹百合鱗片離體再生的適合的光照度和溫度分別為2000 Lx和26 ℃。而高溫對(duì)不定芽的誘導(dǎo)有抑制作用，不利于其生長(zhǎng)。因此可以利用這一特性先培育壯苗，再通過空氣熱處理組培壯苗進(jìn)行脫毒的處理。

2.5 卷丹百合鱗片不定芽生根的研究

表8 不同激素組合對(duì)不定芽生根的影響

++++根系很多；+++根系多；+++根系一般；+根系少；-根系無根。

為了研究適合卷丹鱗片不定芽生根的配方，分別用不同的培養(yǎng)基對(duì)不定芽進(jìn)行生根處理，統(tǒng)計(jì)生根率，記錄其生根情況，統(tǒng)計(jì)移栽成活率。由表8可知，不同的培養(yǎng)基組合對(duì)卷丹鱗片不定芽的生根有明顯影響，F(xiàn)組中不定芽生根率最高為90.32%，且根系條數(shù)最多，生長(zhǎng)速度最快，移栽成活率達(dá)到100%，而D組中不定芽生根率為0。培養(yǎng)基添加NAA的生根率和移栽成活率高于不添加任何激素的，而培養(yǎng)基中添加IBA生根率和移栽成活率最低。基本培養(yǎng)基MS中大量元素越少其生根率越高，根系數(shù)量和生長(zhǎng)速度越快，移栽成活率也越高；NAA濃度為0.5 mg·L-1時(shí)生根率、根系數(shù)量、根系生長(zhǎng)速度和移栽成活率高于NAA為0.1 mg·L-1時(shí)，而IBA濃度濃度越高其生根率和移栽成活率越低。因此選擇1/4MS+0.5 mg·L-1NAA作為卷丹鱗片不定芽最適培養(yǎng)基組合。

A：不定芽的誘導(dǎo)；B：不定芽伸長(zhǎng)圖1卷丹鱗片不定芽誘導(dǎo)與伸長(zhǎng)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用湖南省主栽的百合品種卷丹百合的鱗莖為材料，通過對(duì)其消毒方法、不定芽誘導(dǎo)、不定芽的生長(zhǎng)和生根等試驗(yàn)，進(jìn)行卷丹鱗莖高效離體再生體系建立的研究。結(jié)果表明：卷丹鱗莖離體再生過程中，鱗片的消毒和不定芽的生根相對(duì)較難，而不定芽的誘導(dǎo)和生長(zhǎng)相對(duì)較容易。此卷丹高效離體再生體系具有消毒徹底，不定芽增殖系數(shù)高，成活率高等特點(diǎn)，為利用分子生物技術(shù)快速選育卷丹百合新品種和脫毒苗的培育提供了一定的技術(shù)支持。

外植體消毒徹底是保證高效再生的前提，然而在我們的試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，卷丹百合鱗莖消毒較為困難，需要先用70%酒精浸泡1 min后，再用8% NaClO配合0.1% HgCl2進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的消毒才能有效降低污染率，可能是因?yàn)槲覀儾捎玫氖?年生的卷丹百合鱗莖，其本身的內(nèi)生菌較多。時(shí)間較短的話細(xì)菌性污染較為嚴(yán)重，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，其細(xì)菌布滿整個(gè)培養(yǎng)基，導(dǎo)致大部分鱗片污染，成活率降低，但是切開的鱗片用0.1% HgCl2進(jìn)行二次消毒時(shí)，導(dǎo)致鱗片組織壞死，成活率不高，這一研究與郭海[5]關(guān)于鱗片消毒難研究一致，但是與其消毒方法和消毒時(shí)間的長(zhǎng)短有一定差異。

本課題組通過研究發(fā)現(xiàn)卷丹百合鱗片的分化能力較強(qiáng)，在不同環(huán)境條件和不同的培養(yǎng)基上均能萌發(fā)出不定芽，溫度對(duì)不定芽是誘導(dǎo)和生長(zhǎng)影響不大，6-BA濃度和光照強(qiáng)度對(duì)其不定芽是誘導(dǎo)和生長(zhǎng)有一定影響，但是差異不明顯。在不定芽伸長(zhǎng)階段，利用正交試驗(yàn)考察了6-BA，NAA和2，4-D的影響，結(jié)果表明2，4-D對(duì)其不定芽的伸長(zhǎng)起主導(dǎo)作用，其次是6-BA，NAA影響最小。因此卷丹百合鱗片在26±2 ℃，2000 Lx光照強(qiáng)度下，先用MS+2.5～3.5 mg·L-16-BA誘導(dǎo)其萌發(fā)不定芽，再將不定芽轉(zhuǎn)接到MS+0.5 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-12，4-D中生長(zhǎng)，待不定芽長(zhǎng)得3～5 cm長(zhǎng)時(shí)轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基。然而我們?cè)谠囼?yàn)過程中發(fā)現(xiàn)單個(gè)不定芽生根較難，通過不同的培養(yǎng)基組合進(jìn)行生根試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，基本培養(yǎng)基中大量元素含量較低利于不定芽生根，且NAA誘導(dǎo)其生根的效果明顯好于IBA，這與龐新霞的研究結(jié)果一致[11]。稍帶部分鱗片轉(zhuǎn)接到大量元素含量為1/4的基本培養(yǎng)基中或者1/4MS+0.5 mg·L-1NAA中，生根快，根系發(fā)達(dá)，有利于培育壯苗，移栽成活率高達(dá)100%。

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Study on High-EfficientinvitroRegenerationfromBulbScalesofLiliumlancifoliumThunb.

ZHONG Can1，WANG Lei1，LIU Hao1，XIAO Shengen2，ZHANG Shuihan1*

(1.Hunan Academy of Chinese Medicine，Changsha，410013，China；2.College of Horticulture and Gardening，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China)

Objective：To establish a high-efficientinvitroregeneration system of bulb scales fromLiliumlancifoliumusing the bulb scales fromL.lancifoliumas the initial explants.Methods：The effect of sterilization，different concentrations of 6-BA，medium formulations，light intensity and temperature on pollution of bulb scales and induction，elongation and rooting of adventitious buds were compared.Results：The results showed that the optimal sterilization was using 8% NaClO for 15 min and 0.1% HgCl2for 15～20 min.The optimal adventitious buds induction formulation was MS base medium with 2.5～3.5 mg·L-16-BA，and the temperature was 26±2 ℃ with 2000 Lx light intensity.The combination of 0.5 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-12，4-D benefited the elongation of adventitious buds.And 0.5 mg·L-1NAA was the best combination of hormones for rooting，and survival rate of transplanting was 100%.Conclusion：The regeneration system provides a technical support for virus free seedling and variety improvement ofL.lancifolium.

Hunan；LiliumlancifoliumThunb.；bulb scales；high-efficient；regeneration in vitro

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.2.012

2014-11-14)

湖南省科技廳重點(diǎn)項(xiàng)目(2013NK2008)資助

*

張水寒，博士，研究方向：中藥資源、中藥制劑及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。E-mail：zhangshuihan0220@126.com